切割bcl-2 mRNA核酶对人胆管癌细胞致瘤性的影响

目的 研究切割ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ核酶对人胆管癌细胞致瘤性的影响。方法 将合成的切割ｂｃｌ－ｍＲＮＡ核酶基因与真核细胞表达载体重组,并用重组后的载体转染人胆管癌细胞,再将经转染的胆管癌细胞接种于裸鼠皮下,观察该肿瘤细胞的致瘤情况。结果 转染切割ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ核酶基因的胆管癌细胞的ｂｃｌ－２表达水平及裸鼠体内致瘤性（０／５）较对照组（８／１０和５／５）明显下降。结论 该切割ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ核酶能     

切割bcl-2 mRNA核酶诱导人胆管癌细胞凋亡的形态学改变

研究切割ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ核酶诱导胆管财亡的形态学改变。方法将合成的切割ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ核酶民真核细胞表达载体重组,并用重组后的载体转染人胆管癌细胞,通过光镜及扫描和透射电镜手段,观察转染后的胆管癌细胞,通过光镜及扫描和透射电镜手段,观察传染后的胆管癌细胞凋亡的形态学改变。     

胆管癌bcl-2蛋白的表达及意义

bcl-2基因是80年代初发现的造血系统肿瘤的一个原癌基因,不仅存在B淋巴细胞中,也存在于许多正常组织和胚胎组织,它是一种与细胞凋亡相关的癌基因,其主要作用是抑制细胞凋亡.我们应用免疫组化方法检测肝外胆管癌bcl-2蛋白的表达,对其与肝外胆管癌的生物学行为及预后关系进行探讨.     

PCNA和bcl-2在金仓鼠胆管癌和胆管细胞增生中的表达

目的 建立肝内胆管癌（ICC）动物模型,观察增殖细胞核抗原（PCNA）和bcl-2在肝内胆管癌发生发展的病理过程中的表达。方法 60只6周龄雄性金仓鼠,随机分为正常对照组、单纯结扎胆总管组和二异丙醇亚硝胺（DIPN）组,分别在实验的5、10及15周分扎处死动物,观察其形态学变化。免疫组化SABC法检测胆管癌组织和胆管上皮细胞增生中PCNA和bcl-2的表达。结果 PCNA标记指数（PCNA LI）在胆管腺癌中最高（78.5%）,不典型增生（51.6%）、腺瘤样增生（50.3%0、胆管肠上皮化生（40.3%）、小胆管囊性增生（25.5%）和小胆管增生（23.6%）次之,正常胆管上皮（3.1%）最低（P＜0.01）。bcl-2在胆管组织癌变过程中的阳性表达率分别是：正常胆管上皮30％（3／10）、量管增生20％（2／10）、肠上皮化生20％（2／10）、腺瘤样增生40％（4／10）、不典型增生40％（4／10）、腺癌最高,为80％（8／10）（P＜0.05）。结论 PCNA标记指数在肝内胆管癌和胆管上皮细胞增生中明显高于正常胆管组织,提示胆管癌的发生有是从正常胆管组织到间变,再发展为胆管癌;抑制细胞凋亡的bcl-2的过表达可能是DIPN诱发的肝内胆管癌发生的重要机制。     

bcl-2核酶对SMMC7721细胞端粒酶活性的影响作用

目的 观察bcl-2核酶对SMMC-7721细胞的作用,探讨bcl-2表达水平的改变对细胞端粒酶活性的影响。方法 经脂质体介导的方法将PMTr-neo（下向bcl-2核酶真核表达载体）导入SMMC7721细胞中,细胞克隆转移扩大培养后,采用TUNEL,TRAP-PCR-ELISA,免疫组化技术结合图像分析技术检测SMMC7721/PMTr-neo细胞凋亡=细胞端粒酶活性及P16,P12的改变。结果 较对照组SMMC7721/PMTr-neo细胞Bcl-2表达水平显著下降,伴有显著细胞凋亡现象;同时端粒酶活性下降,P16,P21表达水平显著增加。结论 bcl-2核酶可促进SMMC7721细胞发生凋亡,并降低细胞端粒酶活性,提示Bcl-2表达水平的改变对细胞端粒酶活性有一定的影响。     

切割bcl─2RNA核酶的逆转录病毒载体的构建与鉴定

目的：构建逆转录病毒载体介导的切割ｂｃｌ－２ＲＮＡ的核酶（ＲＺ）基因真核细胞表达载体．方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的ＲＺ基因，先克隆于ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）的ＨｉｎｃⅡ位点，命名为３ＺＲＺ（＋）／（－），用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法进行测序，体外转录，进行体外切割反应．ＲＺ基因酶切回收后，定向克隆于逆转录病毒载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ中．结果：ＲＺ基因序列正确，具有切割活性，经酶切鉴定ＲＺ基因已被克隆于ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ位点，重组逆转录病毒载体命名为ｐＤＲＺ－ＲＺ．结论：体外合成ＲＺ基因后，可定向克隆逆转录病毒载体，为细胞内合成ＲＺ提供了手段     

针对bcl—2RNA核酶体外切割反应的琼脂糖凝胶电泳

用琼脂糖凝胶电泳检测外ｂｃｌ－２ｃＤＮＡ和ＲＺＤＮＡ转录物与鉴定核酸的体外切割活性，方法：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果：琼脂糖凝胶电泳可见核酶和ｂｃｌ－２ＲＮＡ转录物及其切割ｂｃｌ２ＲＮＡ后的产物，结论：琼脂糖凝胶电泳是一种可用于外转录物与初步鉴定核酸切割活性的简便方法。     

切割bcl—2RNA核酶的逆转录病毒载体的构建与鉴定

构建逆转录病毒载体介导的切割ｂｃｌ－２ＲＮＡ的核酶（ＲＺ）基因真核细胞表达载体，方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位上的ＲＺ基因，先克隆于ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）的ＨｉｎｃⅡ位点，命名为３ＺＲＺ（＋）／（－），用Ｓ ａｎｇｅｒ以脱氧链终止法进行测序，体外转录，进行体外切割反应，ＲＺ基因酶切回收后，定向克隆于逆转录病毒载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ中，结果：ＲＺ基因序列正确，具有切割活性，经酶切鉴定ＲＺ     

胆管癌组织中自发性细胞凋亡和bcl-2/bax表达的状况及意义

目的：研究胆管癌组织中自发性细胞凋亡和bcl-2/bax基因表达的状况及意义。方法：TUNEL法原位检测凋亡细胞，免疫组化检测bcl-2和bax蛋白表达。结果：40例胆管癌标本自发性细胞凋亡指数（AI）的中位值为7．89％，高／中分化和无淋巴结转移胆管癌AI分别高于低分化和淋巴结转移者（P＜0．01），胆管癌组织bcl-2和bax蛋白表达率分别为７２．５％（２９／４０）和５７．５％（２３／４０），与癌旁正常胆管壁组织比较差异显著（Ｐ＜０．０１），高／中分化胆管癌bcl-2蛋白表达率高于低分化胆管癌（P＜0．01），bcl-2表达阳性胆管癌AI低于阴性，bax阳性高于阴性（P＜0．01），结论：胆管癌细胞仍保胃凋亡机制，bcl-2凋亡途径参与了胆管癌的发生，发展过程，AI和bcl-2蛋白表达可作为判断胆管癌恶性程度的指标。     

bcl-2、c-myc基因表达在去甲二氢愈创木酸诱导人恶性胶质瘤细胞凋亡中的意义

目的：观察bcl-2、c-myc在去甲二氢愈创木酸（NDGA）诱导恶性胶质瘤细胞系SHG－44细胞凋亡中的变化及意义。方法：利用光镜和电镜观察及TUNEL法检测培养细胞凋亡的情况,用免疫组织化学、原位杂交和图像分析等方法检测bcl-2、c-myc基因mRNA和蛋白的表达水平。结果:①一定浓度的NDGA处理SHG－44细胞12－96h,均可诱导SHG－44细胞发生凋亡,且随着作用时间的延长,凋亡细胞数增加越明显;②经NDGA处理细胞后,出现SHG－44细胞bcl-2、c-myc蛋白表达水平降低,且随着作用时间的延长,这种趋势更加明显,与细胞调亡的发生密切相关;③原位杂交结果显示,NDGA处理细胞不同时间后,出现SHG－44细胞bcl-2、c-myc基因mRNA的表达水平降低,结果与免疫组化检测一致。结论：NDGA诱导SHG－44细胞的凋亡可能与其下调bcl-2、c-myc基因的表达有关,但其确切机制有待进一步深入研究。     

反义bcl-2 和反义survivin对人神经母细胞瘤细胞系SK-N-MC细胞生长的作用

目的研究反义bcl-2和反义survivin(svv)对人神经母细胞瘤(NB)细胞系SK-N-MC细胞生长的作用.方法利用基因重组技术,采用定向克隆构建在真核细胞中能够稳定表达反义bcl-2 或反义svv 的逆转录病毒载体PBabe puro-Asbcl-2和PBabe puro-Assvv,并分别经脂质体LipofectamineTM介导转染人NB细胞株SK-N-MC细胞,经嘌呤霉素(2.0 μg/ml)筛选得到抗性克隆,同时以空载体Pbabe puro 转染SK-N-MC作为对照;以免疫组化和Western 印迹分析反义bcl-2、反义svv对细胞内源性Bcl-2、SVV蛋白质的表达抑制作用,应用MTT法研究细胞(5×103 /孔)的生长和增殖情况,并接种于裸鼠(3只/组),观察107 个细胞在6周时的成瘤情况,以研究反义bcl-2、反义svv对SK-N-MC细胞生长的作用.结果反义bcl-2转染后的细胞SK-N-MC/PBabe puro-Asbcl-2中的Bcl-2表达明显降低,反义svv转染后的细胞SK-N-MC/PBabe puro-Assvv中的SVV表达也明显降低;且这两种细胞均生长缓慢, 裸鼠移植瘤体积均明显小于SK-N-MC原始细胞或转染空载体的细胞接种形成的移植瘤.结论稳定表达的反义bcl-2、反义svv均能够有效抑制SK-N-MC细胞内源性相应蛋白质Bcl-2、SVV的表达,提示这两个基因在NB细胞的肿瘤形成中均具有一定的作用.     

RRM2在人胆管癌组织及胆管癌细胞系中的表达和意义

目的:探讨核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)在人胆管癌组织及胆管癌细胞系中的表达、分布以及生物学意义。方法:采用免疫组织化学技术(SP法)检测RRM2基因和蛋白在40例胆管癌标本、40例癌旁胆管组织以及10例正常胆管组织标本中的表达;同时采用RT-PCR法及Western blot法分别检测了RRM2基因mRNA及其蛋白在人胆管癌细胞系QBC939以及人正常胆管上皮细胞系HIBEC中的表达。结果:RRM2基因蛋白在胆管癌组织中表达阳性率为72.5%,而在癌旁胆管组织和正常胆管组织中未能检测到RRM2表达。在人胆管癌细胞系QBC939中,RRM2的mRNA及蛋白均特异性表达,而在正常人胆管上皮细胞系HIBEC中未见RRM2的表达。结论:RRM2在人类胆管癌组织和胆管癌细胞系中选择性高表达,可能与胆管癌的发生、发展密切相关。     

全反式维甲酸诱导人胆管癌细胞凋亡的作用

目的：研究全反式维甲酸（ATRA）对胆管癌细胞的生长的影响，方法：应用台盼蓝染色，MTT法，光镜，透射电匀流式细胞仪等检测ATRA对体外培养的人胆管癌细胞株QBC939细胞的诱导凋亡作用。结果：不同浓度的ATRA对QBC939细胞的增殖均有抑制作用，且量效关系明显，但大剂量则主要导致细胞坏死，以10μ.mol.L^-1ATRA的作用效是最好。QBC939细胞经10μ.mol.L^-1ATRA处理7d的产殖抑制率可达到60％，光镜及透民镜下可见细胞恶必表型向正常发生逆转，并可观察到凋亡小体，流式细胞仪分析显示，ATRA处理组细胞周期延迟10％，G1期货经例明显升高50．5％，S／G2期比例分别下降39．8％和11．4％，结论：ATRA可抑制胆管癌细胞的增殖，并诱导癌细胞凋亡。     

bcl-2反义寡核苷酸对膀胱癌BIU87细胞株的影响

目的:探讨bcl-2反义寡核苷酸对培养的膀胱癌BIU87细胞株的影响.方法:采用bcl-2基因第1外显子的反义寡核苷酸,以硫代磷酸修饰(PS-ASON),序列为5′-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3′,与膀胱癌细胞株BIU87共同孵育作为实验组.加入正义的bcl-2寡核苷酸,序列为5′-TACCGCGTGCGACCCTCT-3′(PS-SON)作为对照组,用流式细胞仪检测细胞凋亡和坏死率,电镜观察细胞形态变化.结果:与对照组相比,实验组的细胞坏死率明显上调,电镜下细胞形态呈坏死改变.结论:bcl-2的反义寡核苷酸引起膀胱癌细胞大量坏死,可能成为膀胱癌的治疗方法之一.     

缺血预处理对人在体肺组织细胞凋亡及调控基因蛋白bcl-2表达的影响

目的 :通过对需阻断一侧肺动脉主干行肺叶切除的患者进行实验观察 ,以了解人肺组织缺血再灌注损伤是否促进肺组织细胞凋亡 ,以及缺血预处理对人在体肺组织细胞凋亡和对其凋亡调控基因bcl 2蛋白表达的影响。方法 :选择 16例需阻断一侧肺动脉才能行肺叶切除的病例随机分为对照组与缺血预处理组 ,每组 8例。预处理采用阻断 5min ,开放 5min两周期的缺血预处理方式 ,对照组则无预处理过程 ,余同预处理组。分别于缺血前 ,缺血 30min ,再灌 30min和再灌 6 0min取余肺组织少许 ,采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法 (TUNEL)检测细胞凋亡 ,用免疫组织化学法检测bcl 2蛋白表达水平。结果 :TUNEL检测显示对照组中再灌 30min后与再灌 6 0min后较术前细胞凋亡指数显著增加 (P <0 .0 5 ) ,随着再灌时间延长 ,凋亡细胞指数也呈显著增加趋势 (P <0 .0 5 )。缺血预处理组较对照组的细胞凋亡指数在再灌 30min与再灌 6 0min显著降低 (P <0 .0 5 )。免疫组化显示 ,缺血预处理组bcl 2蛋白表达较对照组显著增加 (P <0 .0 5 ) ,对照组中各时间点其表达水平并无差异 (P >0 .0 5 )。结论 :①缺血再灌注能促进人在体肺组织细胞凋亡。②缺血预处理可能通过上调bcl 2蛋白的表达来抑制人在体肺组织细胞凋亡