转化生长因子-β_1对猪关节软骨细胞合成糖胺多糖的作用

目的 :观察转化生长因子 β1 (TGF β1 )对软骨细胞外分泌基质糖胺多糖 (GAG)含量的影响。方法 :通过Ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞 ,定量接种 6× 10 6 个细胞于培养皿 ,在细胞贴壁后更换培养基时 ,加入TGF β1 10ng mL ,每周传代 1次 ,连续 5周 ,留取所有培养液用阿利新蓝法测定软骨细胞外分泌基质GAG的变化 ;利用光镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。结果 :体外培养的软骨细胞从传代后合成糖胺多糖类基质 ,第 2代传代细胞分泌GAG的能力最强 ;加入TGF β1 能明显促进传代软骨细胞合成大量的糖胺多糖类基质。结论 :TGF β1 能明显促进体外培养的传代软骨细胞合成大量的糖胺多糖类基质     

转化生长因子—β1对猪关节软骨细胞合成糖胺多糖的作用

目的观察转化生长因子-β1 (TGF-β1)对软骨细胞外分泌基质糖胺多糖(GAG)含量的影响。方法通过Ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞,定量接种6×106个细胞于培养皿,在细胞贴壁后更换培养基时,加入TGF-β1 10ng/mL,每周传代1次,连续5周,留取所有培养液用阿利新蓝法测定软骨细胞外分泌基质GAG的变化;利用光镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。结果体外培养的软骨细胞从传代后合成糖胺多糖类基质,第2代传代细胞分泌GAG的能力最强;加入TGF-β1能明显促进传代软骨细胞合成大量的糖胺多糖类基质。结论TGF-β1能明显促进体外培养的传代软骨细胞合成大量的糖胺多糖类基质。     

TGF-β1和BMP-2对终板软骨细胞增殖和糖胺多糖合成的影响

目的:探讨转化生长因子β1(TGF-β1)和骨形态发生蛋白2(BMP-2)对体外培养大鼠终板软骨细胞增殖和合成糖胺多糖的影响。方法:取原代大鼠终板软骨细胞,体外培养传代至第二代,常规培养液培养组为对照组,培养液中加入TGF-β1及BMP-2作用于软骨细胞为实验组,观察细胞的生长情况,测定终板软骨细胞增殖和糖胺多糖(GAG)含量的变化,分析两种因子对软骨细胞增殖行为和合成糖胺多糖的影响。结果:单独应用TGF-β1与BMP-2刺激,终板软骨细胞增殖能力及糖胺多糖合成较对照组增高,而TGF-β1与BMP-2联合使用能够更加明显地促进终板软骨细胞增殖能力及糖胺多糖的合成。结论:一定浓度的TGF-β1与BMP-2联合使用,能有效促进体外培养的软骨细胞增殖和合成GAG基质的能力。     

猪耳廓软骨细胞外分泌基质的检测

目的　通过体外传代培养猪耳廓软骨细胞 ,并连续检测软骨细胞形成外分泌基质的能力 ,寻找出最适宜接种的种子细胞。方法　通过Ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞 ,定量接种 6× 10 6个细胞于培养皿 ,每周传代 1次 ,连续 5周 ,留取所有培养液用阿利新蓝法测定软骨细胞外分泌基质糖胺多糖 (GAG) ;利用光镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。结果　第 1,2 ,3 ,4,5周软骨细胞外分泌基质GAG平均含量分别为 :612 ,12 3 5 ,14 62 ,113 8和 710 μg。 结论　体外培养的第 2代软骨细胞功能和活性最佳 ,传代第 2周是最佳接种时间。     

猪软骨细胞外分泌基质功能检测的实验研究

寻找体外传代培养猪耳廊软骨细胞最适宜接种的种子细胞。方法：通过Ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞,定量接种６＊１０＾６个细胞于培养皿,每周传代１次,连续５周,留取所有培养液,用阿利新蓝法测定软骨细胞外分泌基质糖胺多糖;利用光镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。     

体外培养人胎儿软骨细胞的生物学特性

目的 建立人胎儿软骨细胞分离培养、扩增技术体系,研究其体外单层培养条件下的生长特性,探讨胎儿软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性。方法酶消化法获取胎儿软骨细胞,体外培养扩增,经测定细胞生长曲线、群体倍增时间及累计倍增数目,观察细胞生长动力学并确定体外生长规律。通过免疫组织化学检测Ⅱ型胶原分泌,阿利辛蓝比色法测定基质糖胺多糖(GAG)含量。P1细胞接种于聚羟乙酸(PGA)纤维支架,观察两者生物相容性及细胞体外成软骨能力。结果 关节软骨细胞形态呈典型的多角形,随着传代的次数增加,逐渐变成“成纤维细胞样”的条梭形。平均倍增时间为74 h。细胞连续培养5代,累计倍增数目为7.83±0.42。P1-P5间接免疫组化Ⅱ型胶原表达阳性,P6不表达。GAG含量P1细胞低于P0细胞,随体外培养时间延长逐渐增加。P1细胞接种于PGA纤维支架,体外培养14 d,组织学观察显示有软骨组织形成。结论 胎儿软骨细胞经常规体外培养,至第6代失去分泌软骨特异性基质的功能。P1细胞接种PGA纤维展现良好的生物相容性,初步证实胎儿软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性。     

体外培养人胎儿软骨细胞的生物学特性

目的建立人胎儿软骨细胞分离培养、扩增技术体系,研究其体外单层培养条件下的生长特性,探讨胎儿软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性.方法酶消化法获取胎儿软骨细胞,体外培养扩增,经测定细胞生长曲线、群体倍增时间及累计倍增数目,观察细胞生长动力学并确定体外生长规律.通过免疫组织化学检测Ⅱ型胶原分泌,阿利辛蓝比色法测定基质糖胺多糖(GAG)含量.P1细胞接种于聚羟乙酸(PGA)纤维支架,观察两者生物相容性及细胞体外成软骨能力.结果关节软骨细胞形态呈典型的多角形,随着传代的次数增加,逐渐变成"成纤维细胞样"的条梭形.平均倍增时间为74 h.细胞连续培养5代,累计倍增数目为7.83±0.42.P1～P5间接免疫组化Ⅱ型胶原表达阳性,P6不表达.GAG含量P1细胞低于P0细胞,随体外培养时间延长逐渐增加.P1细胞接种于PGA纤维支架,体外培养14 d,组织学观察显示有软骨组织形成.结论胎儿软骨细胞经常规体外培养,至第6代失去分泌软骨特异性基质的功能.P1细胞接种PGA纤维展现良好的生物相容性,初步证实胎儿软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性.     

细胞高密度培养促进兔关节软骨细胞糖胺多糖合成作用研究

目的 研究细胞密度对体外培养兔关节软骨细胞糖胺多糖(glycosaminoglyean,GAG)合成的影响.方法 1月龄新西兰兔5只,无菌手术切取双膝关节软骨,采用0.4%Pronase酶和0.025%Ⅱ型胶原酶消化分离关节软骨细胞,来源于同一只兔的软骨细胞分为两部分:一部分以密度2×104/cm2接种,传代时仍以相同密度接种;另一部分在细胞贴壁后人工降低细胞密度至2×103/cm2培养.原代(P0)和传1代(P1)细胞均在细胞融合后换液,并且于换液后12,24,36,48,60 h分别抽取上清测量GAG浓度.采用重复测最资料的方差分析,比较低密度培养P0组与高密度培养P0组、P1组上清GAG浓度.结果 低密度培养P0组上清GAG含量显著低于高密度培养P0组(P<0.001),且低于体外培养时间略长的高密度培养P1组软骨细胞(P<0.05).结论 高密度培养更有利于软骨细胞维持表型,是软骨平面培养的较好方式.     

黄芪多糖对体外培养大鼠软骨细胞内糖胺多糖合成的影响及其机制

目的:研究黄芪多糖对大鼠退变软骨细胞糖胺多糖(GAG)合成的影响。方法:分离大鼠关节软骨细胞传代培养并加入IL-1β造模,分别将100,10,1,0.1 mg/L的黄芪多糖作用于该软骨细胞,以4.5 mg/L的硫酸氨基葡萄糖作为阳性对照。其后检测细胞增殖、细胞内GAG含量、细胞内葡萄糖醛酸转移酶Ⅰ(GlcAT-1)mRNA含量和透射电镜观察细胞形态学改变。结果:各浓度的黄芪多糖均对大鼠软骨细胞增殖率无影响。100 mg/L的黄芪多糖可以增加软骨细胞内GAG的合成(P<0.01);1,10,100 mg/L的黄芪多糖能够增加GlcAT-1 mRNA的表达。结论:黄芪多糖能逆转IL-1β对体外培养的大鼠软骨细胞GAG合成的抑制作用,其主要机制可能与促进GlcAT-1的表达有关。     

骨髓间充质干细胞二维培养条件下向软骨细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨二维培养条件下转化生长因子-β1(TGF-β1)体外诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)分化为软骨细胞的方法.方法 取SD大鼠的股骨及胫骨,采用贴壁培养法分离纯化大鼠BMSC,取第4代BMSC行流式细胞术检测鉴定其表面抗原,分别以含1、5、10、15和20ng/mL的TGF-β1的诱导培养基在二维培养条件下对第4代BMSC诱导培养,2周后采用免疫组化法对Ⅱ型胶原进行定性检测,采用二甲基亚甲蓝(DMB)比色法定量检测诱导后细胞外基质糖胺多糖(GAG)的表达情况.结果 贴壁培养法可分离并纯化sD大鼠的BMSC,所得第4代BMSC细胞表面抗原CD44阳性,CD34、CD45阴性.经诱导培养2周后细胞形态变为不规则,Ⅱ型胶原免疫组化染色显示TGF-β15、10、15和20ng/mL组阳性,二甲基亚甲蓝(DMB)比色法检测显示实验组细胞外基质糖胺多糖(GAG)含量均明显增加(P<0.00),其中TGF-β110 ng/mL组细胞分泌的GAG显著多于其他剂量组(P<0.00).细胞分泌GAG的能力与细胞密度呈正相关(r=0.822,P<0.01).结论 贴壁培养法可以获得较纯的BMSC,该实验所用的诱导体系可成功将BMSC诱导为软骨细胞;TGF-β110ng/mL组诱导后细胞合成糖胺多糖(GAG)的能力强于其他剂量组,在该实验的细胞密度范围内其诱导后细胞合成糖胺多糖(GAG)的能力与细胞密度呈正相关.     

氟浓度对体外培养大鼠软骨细胞糖胺多糖和Ⅱ型胶原分泌的影响

目的 探讨氟浓度对体外培养软骨细胞糖胺多糖（GAG）和Ⅱ型胶原分泌的影响.方法 取2月龄雌性SD大鼠下肢髋关节及膝关节软骨,分离、培养出软骨细胞后,接种于细胞培养瓶,经鉴定后,分为空白对照组和NaF受试组（6.25 μmol/ml、12.50μmol/ml、25.00 tmol/ml、50.00 μmol/ml和100.00 μmol/ml）,孵育6d后,分别进行GAG含量测定、阿利新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色.结果 NaF受试6d后,大鼠软骨细胞培养液GAG含量各组无显著性差异（P＞0.05）;阿利新蓝染色显示,大鼠软骨细胞内的糖原异染颗粒亦无明显差异;Ⅱ型胶原免疫组化染色则显示,不同剂量NaF可引起对软骨细胞外Ⅱ型胶原染色积分随剂量的升高逐渐上升（P＜0.05）.结论 NaF对大鼠软骨细胞GAG分泌可能无影响,但可能影响Ⅱ型胶原的分泌.     

Characterization of Human Primary Chondrocytes of Osteoarthritic Cartilage at Varying Severity

Background  There is a difficulty in evaluating the in vivo functionality of individual chondrocytes, and there is much heterogeneity among cartilage affected by osteoarthritis (OA). In this study, in vitro cultured chondrocytes harvested from varying stages of degeneration were studied as a projective model to further understand the pathogenesis of osteoarthritis.

Methods  Cartilage of varying degeneration of end-stage OA was harvested, while cell yield and matrix glycosaminoglycan (GAG) content were measured. Cell morphology, proliferation, and gene expression of collagen type I, II, and X, aggrecan, matrix metalloproteinase 13 (MMP-13), and ADAMTS5 of the acquired chondrocytes were measured during subsequent in vitro culture.

Results  Both the number of cells and the GAG content increased with increasing severity of OA. Cell spreading area increased and gradually showed spindle-like morphology during in vitro culture. Gene expression of collagen type II, collagen type X as well as GAG decreased with severity of cartilage degeneration, while expression of collagen type I increased. Expression of MMP-13 increased with severity of cartilage degeneration, while expression of ADAMTS-5 remained stable. Expression of collagen type II, X, GAG, and MMP-13 substantially decreased with in vitro culture. Expression of collagen type I increased with in vitro cultures, while expression of ADAMTS 5 remained stable.

Conclusions  Expression of functional genes such as collagen type II and GAG decreased during severe degeneration of OA cartilage and in vitro dedifferentiation. Gene expression of collagen I and MMP-13 increased with severity of cartilage degeneration.

     

兔髁状突软骨细胞藻酸盐凝胶三维培养体系的建立

目的:建立兔髁状突软骨细胞的藻酸盐凝胶三维培养体系.方法:利用机械与酶消化的方法获得均一性的兔髁状突软骨细胞,在二维贴壁培养条件下增殖至P2代;将P2代细胞高密度条件下转入藻酸盐凝胶培养介质,进行三维培养;分别对培养细胞凝胶微球行石蜡包埋与树脂包埋切片,对三维培养条件下的软骨细胞行组织化学、免疫组织化学检测和超微结构观察.藻酸盐凝胶三维体系培养6周后,以EDTA分解凝胶,收获培养的软骨细胞,免疫组化法检测三维体系中收获的软骨细胞的蛋白合成能力.结果:藻酸盐凝胶三维培养体系中的髁状突软骨细胞生长状态良好;培养6周后从凝胶体系中收获细胞的软骨特异性功能蛋白表达水平较转入三维体系前未见降低,培养细胞保持了良好的分化表型.结论:成功地建立了髁状突软骨细胞的藻酸盐凝胶三维培养体系,在该体系中,软骨细胞生长状态与功能蛋白分泌能力良好.     

骨形成蛋白-7对多孔钽／软骨细胞复合物分泌功能以及 Col-Ⅱ、AGG 和 Sox9基因表达的影响

目的：研究人重组骨形成蛋白-7（bone morphogenetic protein-7,BMP-7）对国产多孔钽／软骨细胞复合物中软骨细胞分泌功能以及Ⅱ型胶原（ typeⅡcollagen,Col-Ⅱ）、蛋白聚糖（ aggrecan,AGG）和SRY相关高迁移率组基因9（SRY-related high mobility group-box gene 9,Sox9）mRNA表达的影响。方法：3周龄新西兰幼兔,取双膝关节软骨细胞分离培养及鉴定,将生长状态良好的第2代细胞以1×106／mL浓度接种于多孔钽并给予不同浓度BMP-7,分为对照组（多孔钽／软骨细胞组）、50μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组、100μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组及200μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组。 CCK-8法检测不同浓度BMP-7对多孔钽／软骨细胞生长及增殖的影响,扫描电镜观察各组软骨细胞在多孔钽表面及内部生长情况,二甲基亚甲蓝（ dimethyl methylene blue,DMMB）比色定量法对BMP-7／多孔钽／软骨细胞复合物糖胺多糖（ glycosaminoglycan,GAG）进行定量检测,实时荧光定量PCR检测Col-Ⅱ、AGG和Sox9 mRNA的表达。结果：原代软骨细胞培养24 h后呈梭形生长,4 d后细胞呈多角形,胞浆丰富。阿辛蓝（ alcian blue）、番红O（ safranin O）、Col-Ⅱ免疫细胞化学染色均呈阳性反应。 CCK-8法细胞增殖检测结果显示,100μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组细胞增殖水平高于其他各组（ P＜0．05）。扫描电镜示各组软骨细胞在多孔钽表面生长状态良好,细胞有多个突起、伸展、叠层生长并覆盖于多孔钽表面。 GAG定量检测显示,100μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组GAG含量比其他各组均明显升高（ P＜0．05）;实时荧光定量PCR检测显示,各实验组Col-Ⅱ、AGG和Sox9 mRNA表达量均高于对照组,以200μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组升高最为明显（ P＜0．05）。结论：BMP-7／多孔钽／软骨细胞复合体能促进体外软骨细胞增殖及细胞外基质的分泌,促进软骨基因的表达。     

Observation of the biological behavior of in vitro cultured immortalized chondrocytes induced by SV40LTAg gene transfection]

OBJECTIVE: To investigate the biological characteristics of immortalized chondrocytes cultured in vitro. METHODS: Primary chondrocytes were immortalized with SV40LTAg gene transfection and grown in monolayer culture. The biological characteristics of the cells were defined in terms of cell morphology and proliferative capacity observed under inverted microscope. GAG synthesis was assessed with toluidine blue and safranine O staining and type-II collagen levels by immunohistochemistry. RESULTS: After 50 passages, the immortalized chondrocytes appeared polygonal or triangular with still vigorous proliferative capacity in monolayer culture and positivity for GAG and collagen type II as characteristic of chondrocytes. CONCLUSION: The immortalized chondrocytes cultured in vitro can maintain their phenotype in a long term.     

胰岛素铁硒传递蛋白促进组织工程软骨形成的作用

目的研究胰岛素铁硒传递蛋白(ITS)对组织工程软骨形成的影响。方法第2代猪关节软骨细胞单层培养或离心形成细胞聚集体,根据培养液不同分为2组:常规培养组(达尔伯克改良伊格尔培养基+体积分数10%胎牛血清)和ITS组(达尔伯克改良伊格尔培养基+体积分数10%胎牛血清+体积分数1%ITS),噻唑蓝(MTT)法评估2组软骨细胞增殖;细胞聚集体培养1、2、3、4周后取材,比较2组细胞聚集体大体形态、湿质量、组织学、Ⅱ型胶原(ColⅡ)免疫组织化学染色和软骨特异基因表达。结果 MTT检测显示第5、6、7天ITS组光密度值显著高于常规培养组(P<0.01);ITS组软骨细胞聚集体体积在培养3周和4周时明显大于常规培养组;ITS组湿质量培养4周时为(7.91±1.49)mg,明显高于常规培养组的(5.37±1.31)mg(P<0.05)。ITS组细胞聚集体甲苯胺蓝染色和ColⅡ免疫组织化学染色明显强于常规培养组;2组软骨特异基因SRY相关高迁移组盒子基因9、ColⅡ表达相当,ITS组Ⅹ型胶原表达减弱,核心蛋白和Ⅰ型胶原表达增强。结论 ITS通过促进软骨细胞增殖和细胞外基质分泌可更好地促进组织工程软骨形成。     

不同培养时间软骨细胞的生物学特性

目的 探讨软骨细胞在体外不同培养时间的生物学特性。方法 把罗骨细胞置盖玻片上２,观察不同培养时间细胞的形态学变化和增殖能力,应用阿新蓝和三色染色,观察细胞在培养过程中酸性粘多糖（ＧＡＧ）、和胶原分泌情况。结果 软骨细胞经体外单层培养,传代４～５代后,细胞形态逐渐由多角形变为俊形,基质分泌减少,ＧＡＧ和胶原染色变浅。结论 软骨细胞在体外培养３周左右是作为有组织工程的最佳种子细胞。     

白藜芦醇对IL-lβ诱导体外培养人骨关节炎软骨细胞蛋白聚糖代谢的影响

目的通过体外培养骨关节炎(OA)软骨细胞体系,了解白藜芦醇对白细胞介素(IL)-lβ诱导OA软骨细胞蛋白聚糖代谢的影响。方法软骨细胞采自OA患者,采用分阶段酶消化法体外原代培养人软骨细胞。在培养液中加入IL-lβ诱导剂,设立兔血清对照组、实验对照组和白藜芦醇加药组;给予实验兔以白藜芦醇剂量灌胃后,抽取含药血清培养细胞。采用3种方法了解蛋白聚糖的代谢水平:1)用二甲基亚甲蓝分光光度法(DMMB法)检测细胞中及培养液中的糖安多糖(GAG)含量;2)酶联免疫吸附法检测培养液中蛋白聚糖的不同代谢片段(Mab-3B3和5D4);3)反转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量法检测软骨细胞的蛋白聚糖、基质金属蛋白酶-1(matrix metalLoproteinases,MMPs-1)和MMPs-3的mRNA表达水平。结果各浓度白藜芦醇含药血清组体外培养的软骨细胞释放入培养液中GAG百分比均值明显低于对照组,两者相比差异有统计学意义(P<0.01),随白藜芦醇的增加,释放入培养液中GAG的百分比逐渐降低;3B3含量的均值较对照组相比明显增高(P<0.01),与白藜芦醇浓度呈正相关,释放入培养液中5D4含量的均值则明显降低(P<0.05),与白藜芦醇浓度呈负相关;白藜芦醇可以增加OA患者软骨细胞和IL-1β诱导的OA患者软骨细胞蛋白聚糖mR-NA表达,减低MMPs-1、MMPs-3 mRNA的表达。结论白藜芦醇可以抑制IL-1β对OA患者软骨细胞蛋白聚糖代谢的促进作用,达到保护软骨,防止OA的目的 。     

软骨细胞与骨髓基质细胞共培养体外软骨形成的实验研究

目的探讨软骨细胞与骨髓基质细胞(BMSC)共培养体外构建软骨的可行性,以阐明软骨细胞能否诱导BMSC向软骨细胞分化并形成软骨组织. 方法分别培养猪的BMSC与耳软骨细胞,将2种细胞按82(BMSC软骨细胞)比例混匀,以5.0×107/ml的终浓度接种于聚羟基乙酸/聚乳酸支架(PGA/PLA,直径9 mm,高3 mm)作为共培养组,相同终浓度的单纯软骨细胞和单纯BMSC分别接种于相同支架作为阳性对照及阴性对照,1.0×107/ml(相当于共培养组中软骨细胞数)的单纯软骨细胞接种作为低浓度软骨细胞对照.每组各接种6例标本,每例接种细胞悬液200 μl.全部标本均于体外培养8周后取材,通过大体观察、湿重测定、蛋白多糖含量测定、组织学及免疫组织化学等相关检测对新生软骨进行评价. 结果各组细胞均与材料支架黏附良好.共培养组及阳性对照组(软骨细胞组)体外培养8周后均形成了成熟的软骨组织,并基本保持了复合物初始的大小和形状,2组新生软骨外观及组织学特征基本相同,免疫组织化学也显示2组均表达软骨特异性细胞外基质Ⅱ型胶原.定量测定结果表明,共培养组的平均湿重和蛋白多糖含量均达到阳性对照组的80%以上.阴性对照组(单纯BMSC组)在体外培养过程中逐渐皱缩变形,仅在组织块边缘的局部区域形成了极少量软骨样组织.低浓度软骨细胞组在体外培养过程中也出现了明显的皱缩变形,新生软骨平均湿重仅达到阳性对照组的40%左右,组织学显示只在局部形成了不连续的软骨组织. 结论软骨微环境在BMSC成软骨分化及体外软骨形成中具有重要作用,软骨细胞能有效地诱导BMSC向软骨细胞分化并促进BMSC体外软骨形成.