大鼠神经生长因子腺病毒表达载体的构建及其在星形胶质细胞中的表达

目的构建含有大鼠β-NGF基因的重组腺病毒载体并观察其在星形胶质细胞的表达,为下一步在动物体内进行中枢损伤的基因治疗提供基础.方法设计一对含有HindⅢ及Sal Ⅰ酶切位点的β-NGF基因上下游引物,PCR法扩增含有大鼠β-NGF cDNA的质粒pUC19-β-NGF,产物经HindⅢ及Sal Ⅰ双酶切,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,获得重组质粒pAdTrack-β-NGF,经Pme Ⅰ酶线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转入BJ5183中进行同源重组,重组子经卡那霉素抗性筛选及酶切分析,阳性克隆经293细胞包装,扩增,空斑法测定病毒滴度,转化体外培养的星形胶质细胞.通过RT-PCR、ELISA、Western blot法检测其在星形胶质细胞中的表达. 结果 PCR及酶切鉴定确认获得重组腺病毒载体pAd-β-NGF,重组腺病毒在293细胞中包装成功,病毒滴度达2×1011 PFU/ml.病毒上清液经ELISA 检测,β-NGF表达的量为(94.50±4.58) ng/L.结论该重组腺病毒载体的构建为下一步在动物体内的表达及中枢神经系统损伤的转基因治疗提供了一定的基础.     

hPDGF-A/hBD2双基因共表达腺病毒载体的构建及表达

目的 制备人血小板源性生长因子-A(human platelet-derived growth factor A, hPDGF-A) 和人β防御素2(human beta defensins, hBD2)双基因共表达腺病毒载体并观察其在大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)中的表达.方法 将hPDGF-A和hBD2通过内部核糖体插入位点(internal ribosome entry site, IRES) 连接后,以同源重组的形式插入腺病毒表达载体,由人胚肾293 细胞包装,获得有感染能力的重组腺病毒颗粒.重组病毒感染BMSCs后,用RT-PCR检测重组腺病毒的表达.结果 ①成功构建穿梭质粒pAdTrack-hPDGF-A-IRES2-hBD2.②成功构建重组腺病毒质粒pAdeasy-hPDGF-A-IRES2-hBD2.③293细胞包装获得有感染能力的重组腺病毒.④转染的BMSCs高表达hPDGF-A和hBD2.结论 构建了hPDGF-A/hBD2双基因共表达腺病毒载体,证实其转染BMSC后的表达.     

重组β-防御素2在脓毒症所致大鼠急性肺损伤发生发展中的作用

目的：探讨重组β-防御素2（BD2）对脓毒症所致大鼠急性肺损伤的保护作用以及对预后的改善。方法：SD大鼠36只随机分为对照组及实验组，每组各18只，分别予以气管滴注对照腺病毒载体（Ad-V，10^7PFU／ml）及可表达大鼠β-防御素2（rBD2）的腺病毒载体（Ad-rBD2，10^7PFU／m1）各100μl。48h后行盲肠结扎穿孔复制脓毒症模型；复制此模型后36h处死大鼠（n=12，实验组、对照组各6只），行腹腔灌洗液细菌计数、肺组织常规病理切片观察以及大鼠生存率分析（n=24，Ad-V组、Ad-rBD2组各12只）。结果：与对照组（Ad-V组）比较，实验组（Ad-rBD2组）肺组织损伤程度减轻，生存率明显提高（P〈0．05），腹腔灌洗液细菌计数无明显差别。结论：在体内表达的重组β-防御素2可明显改善脓毒症所致的急性肺损伤的肺部病变及其预后。     

大鼠促红细胞生成素重组腺病毒载体的构建及其在大鼠SGNs中的表达

目的构建大鼠促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)重组腺病毒载体,并转染于体外培养的大鼠螺旋神经元(spiral ganglion neurons,SGNs)。方法全基因合成大鼠EPO基因,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-EPO。经酶切、PCR及测序鉴定,再经PacⅠ酶切线性化后电转化感受态细胞,获得重组腺病毒载体pAdTrack-CMV-EPO,经PacⅠ酶切后转染至293细胞进行包装,制备重组腺病毒,扩增后进行病毒滴度测定及RT-PCR和Western blot鉴定。并转染至体外培养的螺旋神经元,免疫荧光检测及蛋白水平检测螺旋神经元中EPO表达。结果经KpnⅠ、HindⅢ酶切与测序鉴定显示,腺病毒载体pAdTrack-CMV-EPO构建成功,重组腺病毒AdEPO在293细胞中成功包装,扩增后病毒滴度为1.17×1011U/ml;经RT-PCR和Western blot检测EPO在293细胞中成功表达。重组腺病毒载体AdEPO经鉴定均构建正确;免疫荧光及Western blot检测转染腺病毒后螺旋神经元中EPO表达显著增强。结论成功构建了EPO重组腺病毒载体,并成功转染螺旋神经元,可显著增强螺旋神经元中EPO表达水平。     

大鼠ACE2腺病毒载体的构建及其在INS-1细胞中的表达

目的构建携带大鼠血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)基因的重组腺病毒表达载体并确定其对INS-1细胞的感染效率。方法采用RT-PCR方法,从大鼠肾脏组织中扩增出ACE2基因的全长cDNA序列,将ACE2基因定向克隆到穿梭质粒载体pShuttle-GFP-CMV,经与腺病毒骨架质粒pAdxsi载体同源重组后得到携带大鼠ACE2基因的重组腺病毒(pAdxsi-GFP-CMV-ACE2),采用PCR的方法对重组腺病毒进行鉴定,转染HEK293细胞进行包装和扩增,氯化铯密度梯度离心法纯化,半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infective dose,TCID50)方法测定重组腺病毒的滴度。体外转染INS-1细胞,绿色荧光观察绿色荧光蛋白(GFP)和Western blotting检测ACE2蛋白的表达。结果克隆得到大鼠ACE2基因,经PCR鉴定和测序证实结果正确,成功构建得到高滴度的重组腺病毒,并能高效感染INS-1细胞。结论成功构建了表达ACE2的复制缺陷型重组腺病毒,为深入研究ACE2基因在胰岛细胞中的生物学功能提供了一定的工作基础。     

人β防御素2（HBD2）与人乳头瘤病毒HPVl6E6羧基端编码基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的构建人β防御素与人乳头瘤病毒HPV16E6羧基端基因的真核表达质粒，并检测其在真核细胞中的表达情况，探讨其作为DNA疫苗治疗宫颈癌的可行性。方法利用分子克隆技术，将HBD2基因片段与HPV16E6羧基端基因片段连接，插入真核表达质粒pcDNA3．1，经测序鉴定后，用阳离子脂质体法转染真核细胞COS7，RT—PCR及免疫组化法检测其表达。结果重组质粒pcDNA3．1／HBD2～HPV16E6C转染COS7细胞48小时后，RT—PCR扩增出插入的HBD2--HPV16E6C片段，免疫组化染色呈棕黄色阳性反应。结论人β防御素与人乳头瘤病毒HPV16E6羧基端融合基因能在真核细胞中有效表达，为今后进行整体动物DNA免疫试验奠定了基础。     

人β防御素2(HBD2)与人乳头瘤病毒 HPV16E6羧基端编码基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的构建人β防御素与人乳头瘤病毒HPV16E6羧基端基因的真核表达质粒,并检测其在真核细胞中的表达情况,探讨其作为DNA疫苗治疗宫颈癌的可行性.方法利用分子克隆技术,将HBD2基因片段与HPV16E6羧基端基因片段连接,插入真核表达质粒pcDNA3.1,经测序鉴定后,用阳离子脂质体法转染真核细胞COS7,RT-PCR及免疫组化法检测其表达.结果重组质粒pcDNA 3.1/HBD2-HPV16E6C转染COS7细胞48小时后,RT-PCR扩增出插入的HBD2-HPV16E6C片段,免疫组化染色呈棕黄色阳性反应.结论人β防御素与人乳头瘤病毒HPV16E6羧基端融合基因能在真核细胞中有效表达,为今后进行整体动物DNA免疫试验奠定了基础.     

大鼠BMP-7重组腺病毒构建及在肾小管上皮细胞中表达

目的:利用AdEasy~(TM) system构建携带大鼠BMP-7基因的重组腺病毒,并鉴定其在原代肾小管上皮细胞中的表达.方法:将BMP-7全长序列分为46个片段分段合成,再采用PCR方法将合成的46个寡核苷酸片段拼接成BMP-7基因,并克隆到测序载体中测序鉴定.经Not I和Hind Ⅲ双酶切后接入pShuttle-CMV穿梭载体,构建重组腺病毒的穿梭质粒pShuttle-BMP-7.EcoRI酶切重组pShuttle-BMP-7,与pAdEasy~(TM)DNA电穿孔共转化BJ5183感受态菌, 抽提重组AdBMP-7质粒,PacI酶切线性化重组质粒AdBMP-7后,转染Ad293细胞进行病毒包装和扩增,腺病毒荧光检测试剂盒测定其滴度.用AdBMP-7感染大鼠肾小管上皮细胞,以ELISA法和Western-blot法检测BMP(-7)在大鼠肾小管上皮细胞中的表达.RT-PCR方法检测α-SMA mRNA的表达水平,以鉴定重组腺病毒AdBMP-7的生物学活性.结果:构建了BMP-7基因的重组腺病毒载体,并制备出高滴度重组腺病毒保存液.该重组腺病毒在体外能有效转染大鼠肾小管上皮细胞并高表达BMP-7蛋白,所表达的BMP-7蛋白能有效逆转由TGF-β1诱导的α-SMA表达增高.结论:成功地构建了携带大鼠BMP-7基因的重组腺病毒,并初步证实其具有一定的抗肾纤维化功能.     

携带乙肝核心抗原基因复制缺陷型重组腺病毒的高效制备和表达

目的构建表达乙肝病毒核心抗原(HBcAg)的复制缺陷型重组腺病毒载体。方法扩增乙肝病毒(HBV)C基因片段,亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共同电转化到大肠杆菌BJ5183内进行同源重组,经卡那霉素抗性筛选和酶切鉴定筛选出携带HBVC区基因的重组腺病毒载体,用脂质体包裹PacⅠ酶切线性化的重组质粒,转染到293细胞内进行重组腺病毒的包装。体外转染真核细胞,通过示踪基因绿色荧光蛋白表达的观察、RT-PCR和ELISA检测目的基因的表达。结果成功获得重组腺病毒质粒pAd-HBc。重组质粒pAd-HBc导入293细胞,经过包装和二次扩大培养获得了具有感染能力的重组腺病毒颗粒Ad-HBc,其病毒滴度达5×109pfu/mL,并能在真核细胞中有效表达目的基因。结论成功构建表达HBcAg复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步开展HBV基因治疗研究提供实验基础。     

人β-防御素-3与人表皮生长因子融合蛋白的克隆及原核表达

目的:克隆融合蛋白d-EGF成熟链基因,构建原核表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)表达体系中进行有效表达、分离纯化并鉴定其特异性。方法:以蛋白基因序列为基础,RT-PCR扩增人防御素-β和表皮生长因子基因,分别构建β-防御素-3(β-defensin-3)、EGF重组质粒,应用重组PCR方法,将EGF的DNA序列拼接到β-defensin-3 DNA序列的3'端,将基因克隆入原核表达载体pET-SUMO,构建重组质粒pET-SUMO-d-EGF。采用PCR、测序等方法鉴定后转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni-trap柱纯化,SDS-PAGE检测表达及纯化结果,最后以Western blot对其进行特异性鉴定。结果:成功构建β-defensin-3、EGF重组质粒,经重组PCR成功扩增出294 bp的目的片段,重组体PCR结果与预期结果一致,测序正确。转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导经SDS-PAGE分析得到28 kDa左右的目的蛋白条带。Western blot鉴定出融合蛋白含有抗EGF、β-防御素-3两种抗原特异性的蛋白。结论:成功构建原核表达载体pET-SUMO-d-EGF,并获得纯化的融合蛋白,为进一步的活性分析奠定了实验基础。     

益生菌VSL#3对Oxazolone小鼠结肠炎结肠黏膜中β防御素-2表达的影响

目的观察益生菌VSL#3对Oxazolone小鼠结肠炎结肠黏膜中β防御素-2表达的影响。方法建立Oxazolone小鼠结肠炎模型并分为VSL#3治疗组、SASP治疗组、治疗对照组。免疫组化方法、RT-PCR及Western blot检测各组结肠粘膜组织中β防御素-2的蛋白及mRNA的表达。结果免疫组化方法、RT-PCR检测及Western blot检测发现VSL#3治疗组小鼠结肠粘膜中β防御素-2的蛋白及mRNA的表达低于治疗对照组,与SASP治疗组比较差异没有显著性。结论VSL#3对Oxazolone诱导的小鼠结肠炎有治疗作用,其作用机制可能与下调β防御素-2的表达有关。     

FLIP腺病毒表达载体的构建及其在大鼠肺血管内皮细胞中的表达

目的：构建FLIP（FLICE—inhibitory protein）腺病毒表达载体并观察该载体在大鼠肺血管内皮细胞（PVEC）中的表达情况,为研究FLIP蛋白的抗凋亡作用打下基础．方法：利用含有大鼠FLIP基因的原始载体,通过Admax腺病毒包装系统,构建表达大鼠FLIP基因的重组腺病毒Ad—FLIP;原代培养并鉴定大鼠PVEC．利用成功构建的重组腺病毒Ad—FLIP感染大鼠PVEC．通过逆转录酶-多聚酶链反应（reverse transcfiptase—polymerase chain reaction,RT—PCR）和Western Blot分别检测经重组腺病毒Ad—FLIP感染后大鼠PVEC及对照组细胞中FLIP基因mRNA和蛋白表达水平．结果：成功构建含有大鼠FLIP基因的重组腺病毒Ad—FLIP;经Ⅷ因子间接免疫荧光鉴定原代培养大鼠PVEC纯度达90％以上;大鼠PVEC经重组腺病毒Ad—FLIP感染后24h即检测到FLIP mRNA和蛋白表达水平明显增高．结论：重组腺病毒Ad—FLIP可有效提高大鼠PVEC中FLIP基因的表达水平．     

人IL-10基因重组复制缺陷型腺病毒DNA的构建

目的构建人IL-10基因的重组腺病毒并进行体外表达和检测.方法从质粒pcDNA3IL-10的CMV启动子下游完整切下IL-10 cDNA的片段,将其定向插入Gateway载体,在克隆酶的作用下将阳性克隆质粒转入目的腺病毒载体.PacI酶线性化IL-10腺病毒DNA后阳离子质脂体转染293A细胞,获得人IL-10的复制缺陷型重组腺病毒.体外感染人胰腺癌细胞株Bxpc-3和大鼠胰腺细胞株AR-42J;Western blot检测人IL-10的表达.结果成功地构建人IL-10重组腺病毒,病毒滴度达2×109PFU/mL.体外感染的细胞株均检测到IL-10的表达.结论构建复制缺陷型重组腺病毒能够介导IL-10的基因表达,为细胞因子的抗炎治疗奠定实验基础.     

Caveolin-1基因重组腺病毒表达系统的构建与鉴定

目的：构建靶向肝脏的小凹蛋白-1 caveolin-1基因重组腺病毒并对该表达体系进行鉴定。方法：根据GeneBanks中caveolin-1的序列设计引物,以大鼠肝组织提取总RNA为模板,PCR扩增caveolin-1,并将caveolin-1序列克隆至pAdTrack-CMV质粒中,再与pAd-easy质粒进行同源重组构建重组腺病毒载体,利用脂质体法于293细胞中进行包装重组腺病毒, RT-PCR 检测 caveolin-1基因的转录, Western blotting检测caveolin-1蛋白的表达情况。结果：PCR及Western blotting检测结果表明成功构建出caveolin-1基因重组腺病毒。结论：成功构建出caveolin-1基因重组腺病毒,为进一步研究caveolin-1基因在肝纤维化及肝硬化疾病中的作用机制打下实验基础。     

促血管生成素-1腺病毒表达载体构建及鉴定

目的构建表达促血管生成素-1（Ang-1）的腺病毒载体,为研究Ang-1防治慢性缺血性疾病提供前期基础。方法通过PCR从pMD18-Ang-1质粒中扩增Ang-1基因,酶切连接入载体pDC315-GFP并转化大肠杆菌感受态细胞,PCR鉴定测序分析;借助AdMax腺病毒包装系统实现重组,提取质粒DNA并转染HEK293细胞,观察GFP荧光并以Western Blot检测目的蛋白的表达,以终点稀释法测定病毒滴度。结果重组质粒pDC315-GFP-Ang-1经PCR鉴定阳性克隆,测序分析比对正确,重组腺病毒转染HEK293细胞后可观察到GFP-Ang-1融合蛋白,病毒滴度1×1011PFU/ml。结论成功构建了表达Ang-1基因的腺病毒载体。     

重组β-防御素2多肽对脓毒症大鼠肺组织细胞凋亡的影响

目的：观察重组β-防御素2多肽预处理对脓毒症大鼠肺组织细胞凋亡的影响。方法：SPF级SD大鼠48只随机分成对照组和防御素组，采用盲肠结扎穿孔术（CLP）复制脓毒症模型，防御素组在CLP前48h经气管插管气道滴注10^7PFU重组腺病毒（含有β-防御素2编码基因），而对照组则同法给予对照腺病毒（不合β-防御素2编码基因）。分别于CLP后0、12、36和72h处死大鼠，取肺组织，采用透射电镜，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡，采用电镜、苏木精-伊红（HE）染色观察肺组织病理变化。结果：TUNEL检测显示，对照组大鼠CLP后12、36和72h肺组织细胞凋亡指数显著增加（P〈0．01）；与对照组相比，防御素组CLP后相应时间点肺组织细胞凋亡指数显著降低（P〈0．05）。HE染色可见，两组大鼠CLP后12、36和72h肺泡及肺泡间质充血、水肿，炎症细胞渗出，肺泡腔不同程度狭窄。与对照组相比较，防御素组相应时间点肺组织内炎症细胞渗出减少，间质水肿减轻。结论：重组β-防御素2多肽预处理能抑制脓毒症肺组织的细胞凋亡，对急性肺损伤（ALI）具有保护作用。     

人血管内皮生长因子165基因腺病毒载体的构建及其在C17.2神经干细胞的表达

[目的]构建含有人血管内皮生长因子165(VEGF165)基因的重组腺病毒载体并观察其在C17.2神经干细胞的表达,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供基础.[方法]将VEGF165基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV,获得重组质粒pAdTrack VEGF165,经酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转染大肠杆菌BJ5183同源重组获得重组腺病毒质粒,将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒pAdCMV VEGF165,转化体外培养的C17.2神经干细胞.通过RT-PCR、原位杂交、免疫组化、Western blot法检测其在C17.2神经干细胞中的表达.[结果]重组腺病毒AdCMV VEGF165在293细胞中包装成功,病毒滴度达2×1011efu/mL.病毒上清液经ELISA检测VEGF165表达的量为(1135±138)ng/L.重组腺病毒转染神经干细胞后有稳定表达.[结论]成功构建pAd VEGF165重组腺病毒,获得了稳定表达VEGF165的神经干细胞克隆,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供了基础.     

促血管生成素-2过表达重组腺病毒载体的构建

目的 构建小鼠促血管生成素-2(Ang-2)基因过表达重组腺病毒载体.方法 化学合成小鼠Ang-2编码序列,经PCR扩增、鉴定后连接至穿梭质粒.将含目的基因的重组质粒转化DH5α感受态细胞,所得阳性转化子经电泳分析并测序鉴定.将携带目的基因的穿梭质粒与辅助包装质粒共转染人胚肾细胞系HEK293细胞,反复冻融获取重组腺病毒,终点稀释法测定病毒滴度,重组腺病毒转染HEK293细胞并提取蛋白,采用免疫印迹法分析Ang-2蛋白的表达.结果 PCR产物电泳分析可见大小约1.5 kp的特征性条带,基因序列显示测序结果与GenBank提供的Ang-2序列一致,经 HEK293细胞包装后腺病毒滴度为1×108.8 pfu/ml,免疫印迹法分析可见大小57 kD特征性条带,即重组腺病毒可成功表达Ang-2蛋白.结论 Ang-2基因重组腺病毒载体可成功构建.     

sCD80-Linker-sCD40L融合基因重组腺病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞的表达

目的:构建人sCD80-Linker-sCD40L融合基因重组腺病毒载体,观测其在真核细胞中的表达。方法:以RT-PCR法从人外周血单个核细胞总RNA扩增IL12B亚基信号肽、sCD80和sCD40L编码序列,以重叠PCR法获得带有IL12B亚基信号肽的sCD80-Linker-sCD40L融合基因。使用AdMax腺病毒包装系统构建携带融合基因的重组腺病毒载体。以重组病毒感染NIH3T3细胞,观察融合基因的表达。结果:经测序证实,正确构建了携带sCD80-Linker-sCD40L融合基因的重组腺病毒载体。RT-PCR和Western blot证实融合基因在NIH3T3细胞中表达。结论:成功构建了携带sCD80-Linker-sCD40L融合基因的重组腺病毒载体,并在真核细胞中表达,为后续研究奠定了基础。     

重组AdPD-L1腺病毒的构建表达及鉴定

目的构建程序性死亡配体-1(PD-L1)重组腺病毒载体,以期用于体内实验研究.方法酶切含有小鼠全长PD-L1 cDNA的pcDNA3.1/PD-L1质粒,亚克隆到穿梭质粒pAdtrack-CMV上,在BJ5183细胞内和AdEasy-1同源重组,筛选阳性克隆,酶切、测序鉴定正确,线性化后脂质体法转染293细胞进行包装、扩增,利用报告基因EGFP对病毒滴度进行监测,氯化铯密度梯度离心纯化病毒.PCR、Western blot鉴定AdPD-L1感染293细胞后PD-L1的表达,同时进行野生型腺病毒的检测和PD-L1在混合淋巴细胞反应中的作用.结果测序、酶切证实PD-L1基因重组腺病毒载体构建成功.RT-PCR、Western blot检测AdPD-L1感染的293细胞,均有PD-L1的表达.无野生型腺病毒的产生,PD-L1能显著抑制小鼠混合淋巴增殖反应.结论成功构建了含小鼠PD-L1基因的重组腺病毒载体,这种膜结合性的PD-L1与其相应受体结合后,对T细胞可起到负性调控的作用,为下一步体内基因治疗实验奠定了基础.