大肠杆菌DH5α及其耐乙酸突变株生长和产乙酸规律

大肠杆菌DH5α的耐乙酸突变株DA19在复合培养基中有生长优势，最大比生长速率提高，产乙酸减少，对乙酸的耐受力增加。在基本培养基中DA19生长优势更加明显，消耗葡萄糖速率加快，单位菌体产乙酸得率YA/X比DH5α低，以消耗葡萄糖为基准的菌体得率YX/G提高。在添加乙酸的基本培养基中，DA19细胞浓度高于DH5α，更快利用葡萄糖。DA19在高葡萄糖浓度下(102g／L)也能良好生长，菌体浓度达26g／L，YX/G为0．257g／g。在变速补料分批培养中，DA19可以有效地控制乙酸的生成，细胞浓度达到20g／L，YX/G为0．360g／g，为其在高密度培养中的应用奠定了基础。     

Fe2+和Fe3+对大肠杆菌DH5α及其耐乙酸突变株生长及乙酸生成的影响

Fe^2＋和Fe^3＋对E．coli DH5α及其耐乙酸突变株DAl9的代谢有较大影响。在以葡萄糖为碳源的基本培养基中，添加Fe^2＋或Fe^3＋后DH5α生长改善，菌体浓度增加，菌体得率（YX／G）提高，但同时产乙酸量也大为增加，且在添加Fe^2＋后增加更多，然而其单位菌体的产乙酸量（YA／X）降低。DAl9在添加Fe^2＋或Fe^3＋后生长改善，YX／G提高，同时产乙酸大大减少，YA／X和乙酸得率（YA/G）大大降低。DAl9的生长还与Fe^2＋的添加时间有关，在培养过程中添加Fe^2＋越早，细胞浓度和YX／G增加的幅度越大，同时产乙酸、YA／X及YA／G下降的幅度也越大；在12h及其之后添加对DAl9生长没有明显影响。DH5α和DAl9在添加Fe^2＋后生长改善的效果比Fe^3＋明显。     

大肠杆菌乙酸代谢突变株的培养和外源基因表达

大肠杆菌JL3是JM101经诱变和连续培养所选育到的乙酸耐受性突变株，JL3在复合培养基中产生的乙酸比JM101少，菌体对葡萄糖的得率（YX／S）增加，在基本培养基M中连续培养，最大菌体得率（YG）增大，维持系数（m)降低，存在外源乙酸时，JL3对葡萄糖亲和性增加，显示较强的生长优势，在含有10g/L乙酸钠的复合培养基中，JL3／pUC19的β－半乳糖苷酶比活比JM101／PUC19提高30％。     

大肠杆菌乙酸耐受株的代谢流分布

通过在基本培养基中的连续培养，比较了大肠杆菌耐乙酸突变株JL3碳源基本代谢流量分布与出发株JM101的差异，发现随比生长速率的增大，两者进入磷酸戊糖途径的碳流增加，进入三碳羧环的碳流减少。在相同的比生长速率下，突变株JL3中分配于磷酸戊糖途径的碳流所占比例高于JM101，在比生长速率0．626h^-1时，JL3进入磷酸戊糖途径的 占摄入碳流的33．2％，而JM101只占9．0％。计算得到J3力JM101关于ATP的最大菌体得率为10．2g/mol和5．68g／mol，维持系数为64．5mmol/(g.h)和82．3mmol/(kg.h），表明JL3的能量代谢效率高于JM101。     

显色培养基快速检测食品中大肠杆菌的应用研究

目的评价大肠杆菌（Escherichia coli）显色培养基（简称HKEA）的检测效果。方法以制备的显色培养基HKEA与国外3种同类商品化显色培养基FKTBX、FKEA和CHEA对比。分别对13株质控菌、12种模拟样品以及15份实际样品进行检测。结果测试质检菌株、模拟样品和实际样品在配制的大肠杆菌显色培养基可以达到与FKTBX、FKEA和CHEA相近的检测限和灵敏度。对某些大肠杆菌的灵敏度比国外同类显色培养基更高。结论研究试制的显色培养基HKEA与国外其它三种显色培养基一样,都具有较好的检测效果,可大大提高大肠杆菌的检测效率,预测在实际应用中具有较大的价值。     

突变人干扰素-α2b基因5'端提高其在大肠杆菌中的表达

目的 对人干扰素-α2b(hIFN-ao2b)基因的5'端进行突变,构建重组人干扰素-α2b(rhIFN-α2b)原核高表达工程菌,以提高rhIFN-α2b的表达水平.方法 依据大肠杆菌密码子偏好性,在不改变hIFN-α2b的氨基酸序列的情况下,定点突变hIFN-α2b基因5'端序列并PCR扩增出rhIFN-α2b',克隆至温控型表达载体pJW2,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组子,温度诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE、Westernblot鉴定分析并以WISH-VSV系统检测其抗病毒活性.结果 SDS-PAGE分析表明rhIFN-α2b表达量约占菌体总蛋白20.6%,Westem blot表明rhIFN-α2b具有与hIFN-α2b相同的免疫原性,WISH细胞-VSV病毒系统证实其比活性达1.2×108 IU/mg,与未突变工程菌一致.结论 突变hIFN-α2b基因5'端可以提高其表达水平,并成功构建出rhIFN-α2b原核高表达工程菌.     

新生隐球菌CAP64荚膜缺陷株ura5突变株的筛选和鉴定

目的：筛选和鉴定新生隐球菌CAP64荚膜缺陷株ura5突变株。方法：(1)用体外基因重组技术将G418抗性基因插入到新生隐球菌1．2kb的ura5基因中;(2)用电转化方法将体外重组片段导入受体菌;(3)利用5-氟乳清酸(5-FOA)反筛选法筛选ura5突变株;(4)用遗传学鉴定营养缺陷株的方法鉴定突变体。结果：1株突变株ura5基因的序列与重组片段相同;其Southern杂交显示在20kb和7kb处出现2条杂交条带;该突变株能在SDU、SDU和YEPD／G418平板上生长,不能在SD平板生长;其生长曲线显示突变株生长速度依赖于尿嘧啶的提供量。结论：获得了1株新生隐球菌CAP64荚膜缺陷株ura5突变株,建立了新生隐球菌CAP64荚膜缺陷株转化系统,为CAP64基因的功能研究提供了工具。     

neuB1失活空肠弯曲菌O:19突变株感染致病力的初步研究

目的 探讨neuB1失活空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,CJ)O19突变株的感染致病力.方法 由CJ O19野生株构建neuB1灭活的突变株,检测其对正常人血清杀菌活性的敏感性、运动力和自身凝集(AAG)活性,并与野生株进行比较.结果突变株对10%正常成人血清(normal human serum,NHS)杀菌活性的敏感性高于同源的野生株(P＜0.05),孵育15 min和60 min后突变株存活率分别为(20.6±7.4)%和(9.6±3.6)%,而野生株分别为(36.9±5.9)%和(15.5±4.3)%,但突变株的运动力和AAG活性与野生株比较却没有显著性差异(P＞0.05).结论 neuBl失活CJ O19突变株仍具有较强的感染致病力,因而应考虑灭活后突变菌株疫苗的开发研究.     

neuB1失活空肠弯曲菌O∶19突变株感染致病力的初步研究

目的探讨neuB1失活空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,CJ)O∶19突变株的感染致病力。方法由CJ O∶19野生株构建neuB1灭活的突变株,检测其对正常人血清杀菌活性的敏感性、运动力和自身凝集(AAG)活性,并与野生株进行比较。结果突变株对10%正常成人血清(normal human serum,NHS)杀菌活性的敏感性高于同源的野生株(P<0.05),孵育15min和60min后突变株存活率分别为(20.6±7.4)%和(9.6±3.6)%,而野生株分别为(36.9±5.9)%和(15.5±4.3)%,但突变株的运动力和AAG活性与野生株比较却没有显著性差异(P>0.05)。结论neuB1失活CJ O∶19突变株仍具有较强的感染致病力,因而应考虑灭活后突变菌株疫苗的开发研究。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测杜氏盐藻突变株中硝酸盐还原酶基因的表达

目的分析获得的2株杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)突变藻株(M1和M2)中NR基因的表达情况。方法应用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)方法,以管家基因β-actin作为内参,进行相对定量检测比较NR基因的表达变化。结果盐藻突变藻株NR基因相对表达量明显低于野生型杜氏盐藻。所分离的杜氏盐藻NR突变藻株中确实存在NR基因的突变。结论本研究为最终利用NR基因作为选择标记,建立杜氏盐藻专用筛选标记奠定了实验基础。     

Pseudomonas putida ND6中萘降解调控基因nahR突变株的构建及萘降解调控机制初探

【目的】构建Pseudomonas putida ND6中双拷贝萘降解调控基因nahR突变株,初步探讨ND6菌株的萘降解调控模式。【方法】扩增nahR基因的上下游同源片段及卡那霉素抗性基因Km;利用重叠延伸PCR技术将这三个片段连接起来,然后将其克隆到自杀性载体pEX18Tc,得到同源重组载体pEX18Tc-RKm;采用热激法将同源重组载体pEX18Tc-RKm转化到供体菌Escherichia coli S17-1,再利用接合转移的方法将供体菌中的载体转到受体细菌ND6菌株,通过同源重组敲除nahR基因,对突变菌株进行nahR基因调控分析。【结果】成功获得了nahR基因突变株。以萘为唯一碳源的无机盐培养基中,突变株生长明显比野生型延迟;以水杨酸钠为唯一碳源的无机盐培养基中,突变株与野生株生长曲线并无明显差异。以葡萄糖为唯一碳源培养时,野生型ND6中的nahR基因有一定量的本底表达量,加入诱导物水杨酸钠后,其表达水平没有明显的变化。【结论】本研究为深入研究ND6菌株萘降解操纵子调控机制奠定了基础。通过对突变株和野生型的比较研究,我们发现ND6菌株中的萘降解上游操纵子受到NahR蛋白的调控,而下游操纵子不受NahR蛋白的调控,且nahR基因为组成型表达。     

膜联蛋白A5 cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:克隆人膜联蛋白A5 cDNA并在大肠杆菌系统内作表达.方法:利用RT-PCR技术从人胎盘组织的总RNA扩增膜联蛋白A5的cDNA序列,将该基因插入GST融合表达载体pGEX-5T,在tac 启动子控制下,IPTG诱导表达GST融合蛋白.以亲合层析法纯化表达的融合蛋白,用KPTT法验证抗凝血活性.结果:凝胶电泳显示PCR扩增产物的长度为978 bp,重组质粒测序结果表明,插入片段与人膜联蛋白A5的序列完全一致.在IPTG诱导下,K802重组菌高效表达出相对分子质量为58 000的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的26%.纯化蛋白具有很强的抗凝血活性.结论:成功克隆人膜联蛋白A5基因并在大肠杆菌中高效表达.     

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的基因修饰及其在大肠杆菌中 …

目的 对人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ,ＧＭ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ５′端进行修饰以实现在大肠杆菌中的高效表达。方法 采用ＰＣＲ方法进行插入和定点突变,转化大肠杆菌实现原核系统表达。通过细胞和生物学方法对表达产物进行鉴定。结果 修饰后基因的氨基酸序列与文献报道完全一致,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的２５％;重组蛋白可     

双Tac启动子的构建及其对人白细胞介素2在大肠杆菌中表达的影响

采用基因工程技术,在表达质粒 PTLIL-2中于人白细胞介素 2(interleukin 2,IL-2)cD-NA 片段前插入了来自质粒PDR540的含Tac 启动子的片段,并适当调整SD 序列与ATG 密码之间的距离,构建成含双Tac 启动子和双SD 序列的质粒 PTLIL-2DT。结果该重组质粒的IL-2 基因在大肠杆菌中表达效率提高了4倍。本文对重组 IL-2抽提和生物活性恢复的处理方法也作了探讨。     

宫颈癌组织中HPV16E6的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的进行人乳头瘤病毒16型相关肿瘤的E6血清学研究。方法采用聚合酶链反应(PCR)从宫颈癌组织DNA中扩增出HPV16E6基因片段,克隆至测序质粒pGEM-T中,并用限制性内切酶将HPV16E6基因切下,克隆至表达质粒pGEMEX-1中,经IPTG诱导表达为融合蛋白,分子量约45KD。结果融合蛋白占菌体总蛋白的25％,免疫印迹检测表明HPV16E6融合蛋白能被抗HPV16E6抗体识别。结论大肠杆菌表达HPV16E6蛋白的获得可为HPV相关性肿瘤的血清学诊断和流行病学研究打下基础。     

人纤溶酶原K5突变体Ⅰ的构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化

[目的]构建人纤溶酶原Kringle 5(K5)的突变体Cys461-Cys540(K5 mut1),在大肠杆菌中表达,亲和层析纯化,为探讨K5抗血管增生活性与Kringle结构域的关系提供基础.[方法]以K5全长cDNA为模板用PCR的方法扩增人纤溶酶原K5mutl基因,将其克隆进表达载体pET-22b( )中,并用限制性核酸内切酶酶切和DNA测序鉴定其连接正确;pET-22b( )/K5 mut1转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物用固化Ni2 -His Bind Resin亲和层析方法纯化,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot方法分析鉴定.[结果]PCR扩增获得258 bp的人纤溶酶原K5 mutl基因片段,正确插入pET-22 b( )载体,在大肠杆菌中该基因编码蛋白的表达量占菌体总蛋白13%左右;SDS-PAGE显示其相对分子质量M1≈14.1×103,Western blot证实该表达蛋白为K5 mut1重组蛋白,经亲和层析后K5 mut1重组蛋白纯度大于90%,获得率约为10 mg/L.[结论]成功构建人纤溶酶原K5 mut1,实现在大肠杆菌中高效表达,亲和层析纯化获得较高纯度K5 mut1重组蛋白.     

大肠杆菌内同源重组法构建含mIκBα基因的重组腺病毒及其在Hep G2细胞中的表达

目的 通过在大肠杆菌内同源重组,快速、有效地制备含人mIκBα基因的腺病毒重组体的方法,并观察其在肝癌细胞株Hep G2细胞中的表达。方法 首先将目的基因mIκBα克隆进结合有绿色荧光蛋白报告基因的穿梭质粒-pAdTrack-CMV中,将新形成的质粒pAdTrack-CMV-mIκBα用限制性内切酶Pme I线性化后,再与腺病毒骨架质粒-pAdEasy-1一同转化进大肠杆菌株BJ5183细胞中。用对卡那霉素抗性挑选重组体质粒-pAd-mIκBα,并通过限制性内切酶分析,确认重组。最后将线性化后的重组体质粒转染进腺病毒包装细胞株293细胞。腺病毒重组体Ad-mIκBα在7~10 d内产生。借助GFP的表达,测定和观察在293细胞中重组腺病毒的滴度及其在Hep G2细胞中的表达。结果 经PCR检测提示重组体腺病毒含有mIκBα基因。Ad-mIκBα的滴度是2.7×109 PFU/ml。当MOI等于10时,在Hep G2细胞中,Ad-mIκBα病毒可有效和稳定地表达,其感染效率24 h为57%,48 h达100%。结论 运用在大肠杆菌内同源重组法能有效和方便地构建含目的基因mIκBα的腺病毒重组体Ad-mIκBα。该重组体能在293细胞中扩增,并有效地感染Hep G2细胞。为进一步研究mIκBα基因的功能和该基因治疗肝癌提供了一个良好的基因转导载体。     

血清与海马内 5-羟色胺和 5-羟基吲哚乙酸的 LC-MS/MS测定及其在白芍抗抑郁功效评价中的应用

[目的]建立一种用于测定血清和海马组织中 5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)和 5-羟基吲哚乙酸(5-hydroxyindole acetic acid,5-HIAA)含量的液相色谱与串联质谱联用(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析方法,并应用于中药抗抑郁功效的评价。[方法]取小鼠血清和海马组织,通过蛋白沉淀法进行样品前处理后,利用所建立的 LC-MS/MS分析方法测定 5-HT和 5-HIAA的含量。采用 Hypersil ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱,柱温为 40 ℃,流动相为 0.1%甲酸水(含 2 mmol·L-1乙酸铵):乙腈,流速为 1 mL·min-1质谱检测选择多重反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式。将 198只小鼠随机分为正常对照组、模型组、盐酸氟西汀组和,30个白芍提取物组,每组 6只。测定血清和海马中 5-HT和 5-HIAA含量,并进行悬尾实验与强迫游泳实验。[结果] 5-HT和 5-HIAA分别在 0.1～1 000 ng·mL-1和 1～500 ng·mL-1浓度范围内线性关系良好(r> 0.999)加样回收率和精密度均符合生物样品的分析要求。白芍提取物组 5-HIAA/5-HT值相对于模型组的变化程度,与行学实验指标变,化程度具有一定相关性,且变化程度显著高于行为学实验,组内相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)更小。[结论]建立的 LC-MS/MS分析方法操作简便快捷、结果准确、灵敏度高、重现性好、专属性强,可同时测定血清、海马组织中 5-HT和 5-HIAA的含量,适用于白芍等具有神经保护功效药物的研究及药效评价。