γ-H2AX细胞周期相关性的分析

Objective: To analyze and discuss cell cycle's correlation of γ-H2AX, so as to accumulate the data for the further studies of γ-H2AX. Methods: MOLT-4 cells, and peripheral blood lymphocytes (PBLs), with or without 48 h stimulation of phytohemagglutinin (PHA), were irradiated by ultraviolet rays (UV rays). Fluorescence-labeled γ-H2AX antibody was used to detect γ-H2AX foci at the DNA double-strand breaks (DSBs) in chromatin, DNA damage was analyzed by flow cytometry, cell cycle and cell apoptosis were detected by sub-G1 peak method, the expression of y-H2AX was detected by Western blot. Results: With the progression of time, sub-G1 peak emerged apparently in the DNA histograms, and the cells of apoptosis increased gradually; with the progression of time, the increase of γ-H2AX emerged and firstly raised, then decreased; PBLs with 48 h stimulation of PHA entered apparently cell cycle, cells of S and G2/M phase emerged, and PBLs without stimulation of PHA did not enter cell cycle; Western blot showed the increase of the expression of γ-H2AX, and the increase also firstly raised, then decreased. Conclusion: γ-H2AX expressed in the cells of stationary phase and proliferative phase, and with the progression of time, the increase of γ-H2AX firstly raised, and then decreased.     

基因组的监视器：组蛋白H2AX

组蛋白H2A变体H2AX在离其肽链C端4个氨基酸处存在一个高度保守的丝氨酸残基（Ser139），DNA双链断裂（DSB）一经产生，该残基便能迅速被磷酸化，形成γH2AX。γH2AX识别抗体是探测DSB存在的金标准；H2AX在细胞周期关卡中起重要作用，H2AX/细胞不能正确停止在G2期并进入有丝分裂期；H2AX的丧失不影响V(D)J重排，但有效的类型转换重组需要H2AX；H2AX还在细胞分裂中起重要作用。总之，H2AX是基因组的监视器，DNA损伤一旦发生，H2AX的磷酸化即会被启动，然后招募更多的修复因子共同修复DNA损伤；H2AX在抑制基因组不稳定和癌症放疗疗效预测方面具有一定的作用。     

rH2AX与MDC1特异性的结合在DNA损伤应答中的作用

0 引言 细胞周期检测点非常严格地检测DNA的损伤,并且延迟细胞周期进程而给DNA修复留出时间.如果损伤太剧烈,它们可以触发细胞死亡.越来越多的证据显示DNA检测点内的任何缺陷都可能导致遗传的不稳定性,如肿瘤细胞就是这样产生的[1].     

DNA损伤修复过程中H2AX磷酸化的调控及其意义

组蛋白2A变异体（histone family 2A variant,H2AX）在DNA双链断裂（double-strand break,DSB）损伤时可以发生不同的翻译后修饰,包括磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化。通过这些修饰,H2AX标记损伤的DNA双链,促进局部DNA修复因子和染色体重塑因子的募集,维持基因组的稳定性。这对于DSB的有效修复及细胞周期从周期检查点的恢复都是十分必要的。另外,H2AX在DSB信号通路必不可少的作用及其在肿瘤发生早期被激活事件,使它成为肿瘤生物学研究中的热点基因蛋白。本文中重点阐述近几年H2AX在DSB损伤修复中的研究进展,同时提出将它作为一个表观遗传标记,在人类肿瘤的早期诊断和治疗中的潜在应用价值。     

热休克预处理对高温致中国仓鼠肺细胞（V79）细胞DNA双链断裂的影响

目的研究热休克预处理对高温致V79细胞DNA双链断裂的影响。方法培养V79细胞,分为对照组和39℃、40℃、41℃、42℃热休克预处理组,预处理后,恢复6 h,再以43℃与45℃进行高温损伤处理,4%多聚甲醛固定,抗γ-H2AX抗体标记,然后羊抗鼠FITC二抗孵育1 h,细胞核内DNA双链断裂斑点用激光共聚焦显微镜进行观察。结果在激光共聚焦显微镜下观察,经统计：对照组细胞核内的DNA双链断裂数量与热休克预处理组细胞核内的DNA双链断裂数量差异有统计学意义（P<0.05）。结论热休克预处理可以减少高温所致V79细胞DNA双链断裂的数量,说明V79细胞可以产生对温度的适应性反应。     

基于流式细胞术的组蛋白γ-H2AX磷酸化检测方法的建立

目的：建立基于流式细胞术的生物标记物γ-H2AX自动化检测方法,并探讨此方法用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的前景。方法：试验分为不添加体外代谢活化系统（-S9）长时（24 h）处理组和添加体外代谢活化系统（+S9）短时（4 h）处理组,分别采用CCK-8方法选择4个不同浓度的依托泊苷（ETO）和环磷酰胺（CP）处理人成淋巴TK6细胞,24 h后收获细胞,采用连接荧光分子的γ-H2AX抗体和核酸染料SYTOX Green双色标记,使用高通量流式细胞仪分析组蛋白H2AX磷酸化（γ-H2AX）阳性的细胞比例。结果：与溶剂对照组比较,-S9 24 h处理组,不同浓度的依托泊苷诱导产生的γ-H2AX阳性细胞比例显著增加,量效关系明显（r=0.999,P < 0.05）;+S9 4 h处理组,不同浓度的环磷酰胺诱导产生的γ-H2AX阳性细胞比例亦显著增加,量效关系明显（r=0.988,P < 0.05）。结论：流式细胞仪可快速、准确地分析体外培养的TK6细胞中γ-H2AX的变化,本试验初步建立了基于流式细胞术的组蛋白γ-H2AX磷酸化检测方法。     

组蛋白H2AX的磷酸化及其在肿瘤中的应用

组蛋白H2AX磷酸化与DNA损伤及修复密切相关,并在细胞周期检测点调控、基因组稳定的维持和肿瘤抑制中起着重要作用。文章对组蛋白H2AX磷酸化在检测肿瘤致癌物、探讨肿瘤发生机制及指导肿瘤放化疗等方面作一综述。     

p53和γ-H2AX作为乙醛引起DNA损伤早期生物标记物的实验研究

目的： 评价乙醛染毒p53野生型人类淋巴母细胞(TK6)后,细胞中DNA损伤标记物p53、γ-H2AX的表达变化,并与彗星试验中的DNA链断裂指标进行敏感性比较,探讨p53和γ-H2AX 作为乙醛引起DNA损伤的早期生物标记物的可能。方法：乙醛在0.5~20 mmol/L的浓度范围分别染毒TK6细胞20 min、2和12 h后,采用高通量的流式细胞术检测肿瘤抑制蛋白total-p53、磷酸化p53(p-p53)以及磷酸化组蛋白(γ-H2AX)的细胞表达率和表达强度(平均荧光强度);同时采用碱性彗星试验检测乙醛引起的DNA链断裂指标(细胞拖尾率、尾长、尾部DNA百分含量以及尾矩)的变化。结果：乙醛染毒TK6细胞12 h后,γ-H2AX的表达强度在15及20 mmol/L浓度下显著升高(P<0.05),p-p53的细胞表达率在0.5~7.5 mmol/L浓度范围内呈现剂量依赖的升高趋势,total-p53的细胞表达率趋势与p-p53相似,但与阴性对照组相比,差异无统计学意义。彗星试验中,细胞拖尾率、尾长、尾部DNA百分含量以及尾矩在5.0~12.5 mmol/L浓度范围内均增加,并呈现剂量依赖性。染毒2 h后,与阴性对照组相比,total-p53和p-p53的细胞表达率在15和20 mmol/L浓度下显著升高(P均<0.05),细胞拖尾率、尾部DNA百分含量以及尾矩在20 mmol/L浓度升高(P均<0.05)。染毒20 min后,3种生物标志物均未见清晰的变化趋势,4种DNA链断裂指标均未见显著变化(P均＞0.05)。结论：乙醛染毒TK6细胞12 h可诱导p-p53细胞表达率升高、γ-H2AX细胞表达强度升高、 total-p53细胞表达率轻微升高,以及细胞拖尾率、尾长、尾部DNA百分含量、尾矩的升高。p-p53比γ-H2AX和DNA链断裂指标在检测乙醛诱导的DNA损伤方面更加敏感。     

甲基硝基亚硝基胍诱导CHL细胞中γH2AX焦点的形成

背景与目的： 研究甲基硝基亚硝基胍(MNNG)是否可诱导中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)中γH2AX焦点的形成,以及是否有细胞系依赖性。 材料与方法： 应用MTT试验检测不同浓度MNNG对鼠CHL细胞的生存率的影响;应用免疫荧光实验检测细胞中γH2AX焦点的形成。 结果： MTT检测表明MNNG对CHL细胞的细胞毒性有明显的时间和剂量效应;免疫荧光实验发现1 mg/L MNNG处理2 h、8 h、24 h的CHL细胞中含有γH2AX焦点的细胞比例及焦点数均较对照组显著增加(P<0.05),含有超过30个γH2AX焦点的细胞比例分别达到56％,92％和91％。 结论： MNNG可以诱导CHL细胞中γH2AX焦点的形成,并且有明显的时间效应。     

X射线诱导γH2AX焦点形成的定量分析及其致DNA双链断裂的动态变化

目的 比较DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs^+/+)和DNA-PKcs^-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEF) X射线诱导γH2AX焦点形成的定量分析,并对鼻咽癌SUNE-1细胞进行X射线致DNA DSB动态变化。方法 采用蛋白印迹检测DNA-PKcs蛋白表达情况,细胞免疫荧光检测X射线5 Gy诱导的γH2AX焦点形成,通过ImageJ软件分析γH2AX焦点形成数量的差异。结果 DNA-PKcs在DNA-PKcs^-/-和DNA-PKcs^+/+ MEF细胞中分别表达缺失和正常。应用γH2AX焦点/细胞和γH2AX焦点/mm²分析方法动态分析X射线诱导的DNA-PKcs^+/+、DNA-PKcs^-/-MEF细胞和SUNE-1细胞DSB形成的总体趋势一致;照后 0.5~1.0 h大量γH2AX焦点形成,DNA-PKcs^+/+ MEF细胞于照后6.0 h完成修复,DNA-PKcs^-/-MEF和SUNE-1细胞X射线后于照后24.0 h完成修复。γH2AX焦点/细胞的峰值出现在照后1.0 h,γH2AX焦点/mm²的峰值则出现在照后0.5 h。对于DNA-PKcs^+/+和DNA-PKcs^-/-MEF细胞,γH2AX焦点/细胞在照后0.5、1.0、3.0、6.0、12.0 h的不同,而γH2AX焦点/mm²在照后3.0、6.0、12.0 h不同。结论 利用细胞免疫荧光动态检测照后致γH2AX焦点/细胞或γH2AX焦点/mm²的分析方法为动态定量研究DSB损伤及修复提供了新的思路。     

丝裂霉素对体外胃癌细胞DNA损伤和增殖的影响

目的探讨丝裂霉素对体外胃癌细胞DNA损伤和增殖的影响。方法选用不同浓度丝裂霉素处理体外培养的胃癌细胞SGC-7901,利用免疫荧光和Western blot技术,分别检测γH2AX的焦点形成和蛋白水平变化;使用MTT法检测SGC-7901细胞的增殖情况。结果丝裂霉素的作用浓度和作用时间存在交互效应,除400 μg/ml外,平均γH2AX焦点数和焦点细胞率呈逐渐增加趋势（P<0.05）;400 μg/ml时,6 h组平均γH2AX焦点数和焦点细胞率低于4 h组,差异有统计学意义（P<0.05）。随丝裂霉素作用时间延长,γH2AX蛋白水平呈先升后降趋势,差异有统计学意义（P<0.05）。MTT结果显示,丝裂霉素对SGC-7901细胞的增殖有明显抑制作用（P<0.05）。结论γH2AX可敏感反应丝裂霉素对胃癌细胞DNA的损伤,丝裂霉素对体外胃癌细胞增殖抑制明显。     

DNA糖基化酶1对幽门螺杆菌致胃上皮细胞DNA损伤的保护作用

目的：探讨氧化性DNA损伤修复关键酶DNA糖基化酶1（OGG1）在幽门螺杆菌（HP）感染致胃上皮细胞（GES-1） DNA损伤中的作用。方法：实验分为对照组、HP感染组、OGG1干扰组、HP感染组+OGG1干扰组。采用RNA干扰技术沉默GES-1细胞OGG1表达,24 h后进行HP感染,于感染后24 h和48 h分别采用CCK-8试验和LDH释放试验检测细胞活力和细胞坏死情况;感染48 h后分别采用彗星试验和γH2AX焦点形成试验检测细胞DNA损伤;采用TUNEL试验和PARP表达检测细胞凋亡情况。结果：与对照组相比,HP感染组和单纯OGG1干扰组的细胞活力、LDH水平、DNA损伤情况、γH2AX焦点形成、TUNEL阳性细胞数目及活性PARP表达水平均无显著变化（P均 > 0.05）。而OGG1干扰+HP感染则引起胃上皮细胞活力下降、LDH释放增加、DNA损伤加重、γH2AX焦点形成增多、TUNEL阳性细胞增多及活性PARP表达升高,与对照组及HP感染组相比,差异均有统计学意义（P < 0.05或0.01）。结论：OGG1在HP感染致胃上皮细胞氧化性DNA损伤中发挥了保护作用,为防护HP感染相关的胃部疾病提供了新的策略和方向。     

香烟烟雾提取物对人呼吸道上皮细胞DNA损伤和凋亡的影响

背景与目的:香烟烟雾可以致多种细胞发生DNA损伤已有报道证实。本研究旨在进一步阐明香烟烟雾提取物(cigarettesmokeextract,CSE)作用于正常人类支气管上皮细胞系(normalhumanbronchialepithelialcells,NHBE)和肺腺癌细胞系SPC-A1后引起的DNA损伤和凋亡情况。方法:不同浓度的CSE作用于NHBE和SPC-A1细胞,用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测两种细胞活性。荧光标记的磷酸化H2AX组蛋白(γ-H2AX)抗体特异性标记细胞核内DNA双链断裂(DNAdouble-strandbreaks,DSBs)处的γ-H2AX,然后用流式细胞仪定量检测并分析DNA损伤。用免疫印迹检测γ-H2AX表达。同时,亚G1峰法(SubG1peak)和AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶双染色流式细胞术检测CSE诱导的细胞凋亡。用激光共聚焦显微镜观察细胞损伤和凋亡形态学变化。结果:MTT结果显示,随CSE浓度和作用时间增加,细胞活性均逐渐降低。CSE可引起细胞DNA双链断裂,γ-H2AX最大值在作用后4h左右,然后逐渐降低。DNA损伤后平均12h可以出现凋亡。另外,激光共聚焦显微镜观察到两种细胞内的γ-H2AX量在细胞受到CSE刺激后快速大量的积聚,呈现典型细胞损伤的形态学变化,较为明显的凋亡形态学特征4h后方可出现。结论:CSE能直接引起NHBE和SPC-A1细胞的DNA损伤和凋亡,且存在着浓度和时间依赖关系。     

川芎嗪通过RAD52调控乳腺癌细胞DNA损伤修复

目的:探究TMP对乳腺癌BT474细胞增殖、细胞周期及其调控蛋白表达与DNA双链断裂修复通路的相关性。方法:CCK8法测定TMP对乳腺癌BT474细胞的增殖抑制情况；流式细胞术测定TMP对细胞周期的影响；单细胞凝胶电泳测定分析TMP对损伤后细胞DSBs累积情况的影响；Isce-I内切酶系统检测TMP对修复通路活性的影响；Western blotting检测DSBs修复通路相关染色体结合蛋白表达水平变化。结果:TMP通过使细胞阻滞在G₁期呈浓度依赖性抑制BT474细胞增殖，显著减少体内由Zeocin导致的细胞拖尾DNA含量(P<0.05);TMP显著增加BT474细胞对RAD52、ERCC1、XRCC4以及DNA LigⅣ蛋白募集，减少对KU80蛋白募集，促进了SSA以及NHEJ通路修复活性(P<0.05)。结论:TMP通过阻滞BT474细胞停留在G₁期使其发挥增殖抑制作用的机制之一；TMP通过增强损伤缺口对各个通路的关键染色体结合蛋白募集，促进SSA与NHEJ修复通路活性从而减少DNA损伤。     

组蛋白H2AX磷酸化与肿瘤放疗敏感性关系的研究进展

目的:总结国内外关于组蛋白H2AX磷酸化与肿瘤放疗敏感性关系的研究现状.方法:应用检索Medline及维普期刊全文数据库检索系统,以"组蛋白、H2AX、磷酸化、DNA修复、肿瘤、放疗和敏感性"等为关键词,检索2000-01～2007-08相关组蛋白H2AX与放疗敏感性方面的文献.资料选择:对资料进行初选,组蛋白H2AX的生物学功能与肿瘤放疗敏感性的关系等方面的文献.纳入标准: 1)关于组蛋白H2AX的生物学功能的研究.2)关于组蛋白H2AX磷酸化可以指示放疗敏感性的研究.3)关于组蛋白H2AX磷酸化与提高放疗敏感性的研究.资料提炼:粗选有百余篇关于组蛋白H2AX方面的文章,根据纳入标准,精选50篇文献,最后纳入分析24篇文献.结果:组蛋白H2AX在DNA发生双链断裂损伤时发生磷酸化,磷酸化的H2AX参与DNA损伤修复和维持基因组稳定性;由于γ-H2AX的数量与DNA损伤的数量存在一一对应的关系,因此,γ-H2AX可以作为低剂量电离辐射后衡量肿瘤放疗敏感性的指示器;通过抑制H2AX上游的激酶阻止H2AX被磷酸化,或直接抑制γ-H2AX在DNA修复进程中的功能,或应用潜在的电离辐射致敏荆,可以延长电离辐射后γ-H2AX的持续时间,增加未被修复的DNA损伤的数量.从而促进肿瘤放疗的有效性.结论:组蛋白H2AX可以作为肿瘤放疗敏感性潜在的靶分子,为提高肿瘤放射治疗疗效提供了新途径.     

γH2AX预测肺癌患者化疗敏感性的研究

目的：探讨应用磷酸化组蛋白 （γH2AX） 预测肺癌患者对顺铂、 卡铂、 吉西他滨、 阿霉素等化疗药物敏感性的可行性和可靠性。方法： 原代培养肺癌患者肿瘤细胞, 分别予不同浓度的化疗药作用后, 采用流式细胞术 （FCM）、 免疫细胞化学法 （ICC）、MTT比色法, 比较并分析各不同浓度药物作用下肿瘤细胞中γH2AX灶点数、 γH2AX阳性细胞百分数及细胞增殖抑制率的差异。结果： 在同种药物不同浓度作用下, 肿瘤细胞内γH2AX灶点数、 γH2AX阳性细胞百分数及细胞增殖抑制率之间的差异具有统计学意义 （P均<0.05）, 并相互之间具有相关性 （P均<0.05）, 不同药物之间γH2AX的表达差异有统计学意义 （P均<0.05）, 并与细胞增殖抑制率间具有相关性 （P均<0.05）。结论： 肿瘤细胞内γH2AX的表达能在一定程度上预测其对化疗药物的敏感性并对指导肿瘤患者的个体化治疗有重要意义。     

GNG4对卵巢癌顺铂耐药A2780/DDP细胞DNA损伤修复及化疗敏感性的影响

目的:探讨GNG4与卵巢癌顺铂耐药A2780/DDP细胞DNA损伤修复及化疗敏感性的关系。方法:将A2780/DDP细胞分为500 ng/ml顺铂作用组（cDDP组）、短发夹RNA（shRNA）-GNG4沉默GNG4表达组（shRNA组）、500 ng/ml顺铂和shRNA-GNG4干预组（shRNA+cDDP组）、未...     

叠氮胸苷对人胶质瘤细胞辐射后DNA双链损伤修复的影响

目的 观察逆转录酶抑制剂叠氮胸苷（AZT）对人脑胶质瘤U251放射性DNA损伤双链修复（DSB），探讨其放射增敏的机制。方法实验分为4个组：空白组：未行AZT与7一射线处理；放射组：细胞接受2Gyγ射线单次照射；加药组：细胞培养液中加入终浓度为0.8mm／L的AZT，作用24h；药放组：细胞经过0．8mm／L的AZT作用24h后，再行2Gyγ射线单次照射。用中性单细胞凝胶电泳方法检测辐射后DNA双链断裂（尾矩）。结果 空白组与加药组细胞无慧尾，表明AZT本身不会导致DNADSB。而放射组和药放组均出现明显的彗星图象，药放组的初始DSB与放射组相比无显著性差异（P〉0.05）。但前者的修复速度较慢，照射后2h放射组的DSB基本修复完全，而药放组仍有50％的残留。结论 AZT的放射增敏作用机制与其对DNADSB的修复有关。     

紫外线A辐射对人角质形成细胞的损伤作用

目的：研究紫外线A（UVA）辐射对人角质形成细胞（HaCaT）活力和凋亡的影响及损伤机制。方法：采用不同剂量（1、5、10、20、30、40 J/cm²）UVA照射HaCaT细胞建立急性UVA损伤细胞模型;采用四甲基噻唑蓝（MTT）法及流式细胞术分别检测UVA照射后对细胞活力和凋亡的影响;免疫荧光和Western blot分别检测细胞内γH2AX焦点形成及其蛋白表达水平;原子力显微镜直接观测DNA损伤断裂情况。结果：与对照组相比,5~30 J/cm²范围内,细胞活力随UVA照射剂量的增加而降低（P<0.05）,且呈现剂量-效应关系（r=0.982,P=0.009）;UVA照射后20 h细胞凋亡率在10~40 J/cm²明显增加且有一定的量-效关系（r=0.936,P=0.008）。在30和40 J/cm² UVA照射后,免疫荧光也可观察到明显的焦点形成;不同剂量照射后均可检测到磷酸化γH2AX蛋白的表达,在5和10 J/cm² UVA照射时磷酸化γH2AX蛋白表达增强最为明显;原子力显微镜观察到在30和40 J/cm² UVA照射后细胞DNA与对照组相比有明显的断裂,并出现许多断片。结论：UVA可诱导DNA链断裂,引起细胞损伤,从而促进HaCaT细胞凋亡并抑制其存活。