体外培养条件下肝细胞功能研究

目的 探讨一种新的细胞培养模型以使体外培养的肝细胞更好地恢复肝功能。方法 利用三明治构型培养肝细胞,观察体外肝细胞蛋白合成,生物转化及其mRNA表达并与传统单层胶原培养肝细胞相比较。结果 三明治构型培养肝细胞保持稳定的蛋白分泌功能并持续增长,且有良好的生物转化功能,而传统单层胶原培养肝细胞蛋白分泌功能微弱,7d后基本消失,肝细胞生物转化功能差。原位杂交显示三明治构型培养较单层胶原培养肝细胞具有更强的白蛋白、P450-bmRNA表达,结论 三明治构型培养肝细胞较传统单层胶原培养肝细胞具更强的白蛋白、P450-bmRNA表达。结论 三明治构型培养肝细胞较传统单层胶原培养肝细胞更类似体内肝细胞,可体外重建细胞极性。     

体外肝细胞极性的重建

目的 使培养肝细胞在体外重建细胞极性。方法 利用三明治构型培养成鼠肝细胞并观察其形态、特异性膜区域蛋白分布并以单层胶原培养肝细胞作对照。结果 三明治构型肝细胞呈单层生长，形成肝板样结构，伴胆小管网络形成，免疫组织化学证明肝细胞膜区域蛋白呈特异性分布。而在对照组，肝细胞基本没有形成肝板样结构，肝细胞膜区域蛋白没有形成特异性分布。结论 三明治构型培养肝细胞在体外重建细胞极性，保留了体内肝细胞的特点。     

体外培养肝细胞胆汁分泌功能的研究

目的：使体外培养肝细胞获得胆汁分泌功能.方法：利用三明治构型培养成SD大鼠肝细胞并观察其胆小管结构及其胆汁分泌功能的形成,并以单层胶原培养肝细胞作对照。结果：免疫细胞化学显示三明治构型肝细胞培养24h后,胆小管结构初步形成,随着培养时间延长,胆小管结构更加清晰,120h后形成胆小管网络,而在对照组肝细胞,胆小管结构形成后,随着培养时间延长逐渐模糊,120h后胆小管结构消失,没有形成胆小管网络。其次,荧光二乙酯的肝细胞代谢显示,三明治构型肝细胞培养96h后即有胆汁分泌功能,而在对照组,肝细胞没有胆汁分泌功能。结论：三明治构型培养肝细胞在体外重建体内胆小管结构,保持了体内肝细胞胆汁分泌功能的特点。     

乙醇对体外生长肝细胞功能的影响

目的探讨一种新的细胞培养模型以观察乙醇对培养肝细胞功能的影响。方法利用三明治构型培养成鼠肝细胞并观察酒精对其形态、胆汁分泌功能以及蛋白合成功能的影响。结果首先荧光二乙酯的肝细胞代谢显示,三明治构型肝细胞培养96h后有明显的胆汁分泌功能,而在酒精干预后,胆汁分泌功能消失。其次三明治构型肝细胞96h后具有较好的蛋白合成功能,而给予酒精干预后,肝细胞蛋白合成功能受到损害而明显下降。结论酒精可造成肝细胞损伤,导致肝细胞功能严重下降。本实验为在细胞水平研究酒精性肝病的发病机理提供了一个体外模型,具有重要的临床意义。     

三明治构型培养肝细胞——一种潜在的生物人工肝单位

目的：探索一种新的生物人工肝单位。方法：双层胶原三明治构型培养肝细胞,并观察其形态分化的特点及蛋白合成功能,并与传统单层胶原培养肝细胞相比较。结果：三明治构型培养的肝细胞48h后形成肝板样结构,伴胆小管网络,肝细胞蛋白分泌功能稳定、持续增高,生存时间达2个月之久;而对照组基本没有形成肝板样结构,蛋白分泌功能差,7d后基本消失,细胞趋向死亡。结论：三明治构型培养的肝细胞在体外重建细胞极性,形态及功能更接近体内肝细胞,是一种潜在的生物人工肝单位。     

三明治构型原代大鼠肝细胞培养细胞极性重建及功能的研究

目的 研究三明治构型培养大鼠原代肝细胞的形态学变化、极性重建过程并对其功能进行测定.方法 改良原位两步法门静脉胶原酶灌注分离单肝细胞,三明治构型培养肝细胞,观察肝细胞的形态学变化,测定特异性膜区域蛋白的重新分布,检测白蛋白mRNA及肝细胞功能.结果 平均每个鼠肝可获取(2～3)×108个肝细胞,活率在93%±3%,纯度在96%±3%.培养6～8 h后,肝细胞排列成肝索样结构.3 d后,白蛋白mRNA表达明显增强.4 d后,DPPIV几乎完全集中在胆小管膜区.5 d后,胆小管完全连接成网络.形态维持达49 d以上.结论 三明治构型肝细胞培养体系更接近于肝细胞体内生长环境.肝细胞可在较长时间内保持良好的形态结构和功能.     

低温条件下肝细胞研究

目的 探索一种新的肝细胞储存方法。方法 三明治构型低温储存肝细胞，并观察其形态、细胞活率、特异性胆小管膜抗原分布及蛋白合成功能，并与传统单层胶原储存肝细胞相比较。结果 三明治构型肝细胞能较好地耐受低温损伤，保持较高的细胞活串和蛋白合成功能，更好地维持了肝细胞形态。结论 三明治构型肝细胞能较好地耐受低温损伤，为建立肝细胞库，生物人工肝及肝细胞移植的推广提供了潜在的临床应用前景。     

酒精对体外肝细胞极性的影响

目的观察酒精对培养肝细胞极性的影响。方法利用三明治构型培养成鼠肝细胞并观察酒精干预下其形态、膜区域蛋白特异性分布以及P450-b和白蛋白mRNA表达的变化，以确定酒精对肝细胞极性的影响。结果酒精干预后，肝细胞变扁平、多核、胞浆稀薄，肝板样结构消失；免疫组织化学染色证明肝细胞膜区域蛋白失去特异性分布；原位杂交显示加入酒精后只有较弱的P450＋b和白蛋白mRNA阳性表达。结论酒精可导致肝细胞极性破坏．从而造成肝细胞损伤，本研究为在细胞水平研究酒精性肝病的发病机理提供了一个体外模型，具有较重要的临床意义。     

肝癌细胞系SMMC7721蛋白质组学初步分析

目的　分析肝癌细胞系SMMC772 1的蛋白质表达 ,筛选肝细胞癌的差异蛋白。方法　应用表面增强激光解吸离子化蛋白质芯片技术检测肝细胞癌细胞系SMMC772 1及正常肝细胞L0 2的蛋白质谱。用PBSII C型蛋白质芯片阅读机读取数据并进行分析。结果　与L0 2细胞相比 ,有 15个蛋白质在SMMC772 1细胞中出现明显的变化 ,其中 6个蛋白在肝癌细胞中高表达 ,9个蛋白低表达 ,L0 2细胞中去磷酸化蛋白 17175Da表达较多 ,而在SMMC772 1细胞中磷酸化蛋白172 5 5Da表达较多。结论　SMMC772 1细胞与正常肝细胞L0 2 4蛋白表达差异对指导肝癌诊断和治疗具有重要意义。研究蛋白质的磷酸化 /去磷酸化有助于了解肝癌发生过程和分子机制。     

肝内胆管癌细胞系ICC-9810与肝细胞癌细胞系SMMC-7721蛋白质组学比较

目的 比较肝内胆管癌细胞系ICC-9810、肝细胞癌细胞系SMMC-7721及正常肝细胞系L02的蛋白质表达,筛选胆管细胞癌和肝细胞癌的标志蛋白.方法 收集体外培养的肝内胆管癌细胞系ICC-9810、肝细胞癌细胞系SMMC-7721及正常肝细胞系L02细胞,细胞裂解液处理后提取蛋白.应用表面增强激光解吸离子化(SELDI)蛋白质芯片技术同时使用IMAC3和WCX2两种芯片检测肝内胆管癌细胞系ICC-9810、肝细胞癌细胞系SMMC-7721及正常肝细胞系L02的蛋白质谱.用PBSII-C型蛋白质芯片阅读机读取数据,采用Proteinchip Software 3.0.2软件分析数据.结果 与L02细胞比较,有12个蛋白质在两种肝癌细胞系中均出现明显的变化,其中4个蛋白高表达,8个蛋白低表达.比较两种肝癌细胞系的蛋白质谱,发现7个蛋白在ICC-9810细胞中高表达,10个蛋白低表达;11个蛋白在SMMC-7721细胞中高表达.在L02和ICC-9810细胞中去磷酸化蛋白17 175 Da表达较多,而在SMMC-7721细胞中磷酸化蛋白17 255 Da表达较多.结论 肝内胆管癌、肝细胞癌与正常肝细胞的差异蛋白表达为寻找肝肿瘤标志物提供了重要线索.17 255 Da蛋白的磷酸化/去磷酸化可能与肝细胞癌的发生有关.     

The Actin‐Binding Protein Cofilin and Its Interaction With Cortactin Are Required for Podosome Patterning in Osteoclasts and Bone Resorption In Vivo and In Vitro

The adhesion of osteoclasts (OCs) to bone and bone resorption require the assembly of specific F‐actin adhesion structures, the podosomes, and their dense packing into a sealing zone. The OC‐specific formation of the sealing zone requires the interaction of microtubule (MT) + ends with podosomes. Here, we deleted cofilin, a cortactin (CTTN)‐ and actin‐binding protein highly expressed in OCs, to determine if it acts downstream of the MT‐CTTN axis to regulate actin polymerization in podosomes. Conditional deletion of cofilin in OCs in mice, driven by the cathepsin K promoter (Ctsk‐Cre), impaired bone resorption in vivo, increasing bone density. In vitro, OCs were not able to organize podosomes into peripheral belts. The MT network was disorganized, MT stability was decreased, and cell migration impaired. Active cofilin stabilizes MTs and allows podosome belt formation, whereas MT disruption deactivates cofilin via phosphorylation. Cofilin interacts with CTTN in podosomes and phosphorylation of either protein disrupts this interaction, which is critical for belt stabilization and for the maintenance of MT dynamic instability. Accordingly, active cofilin was required to rescue the OC cytoskeletal phenotype in vitro. These findings suggest that the patterning of podosomes into a sealing zone involves the dynamic interaction between cofilin, CTTN, and the MTs + ends. This interaction is critical for the functional organization of OCs and for bone resorption. © 2016 American Society for Bone and Mineral Research.     

人脐血间充质干细胞在体外向肝样细胞的诱导分化

目的 探讨脐血间充质干细胞(MSCs)在体外能否分化成肝细胞.方法 分离人脐血MSCs,培养传代,流式细胞仪进行细胞表面标志检测.取培养至第三代的细胞,接种于六孔板内,分两个阶段进行细胞分化的诱导,第一阶段采用含地塞米松(终浓度为0.5 μmol/L,下同)、肝细胞生长因子(HGF,10 ng/ml)、表皮生长因子(10 ng/ml)及1×ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒)的F12培养基诱导2周,第二阶段用含地塞米松(0.5 μmol/L)、HGF(10 ng/ml)、抑瘤素M(10 ng/ml)及1×ITS的F12培养基继续诱导2周.诱导期间于倒置显微镜下观察细胞的形态变化;采用逆转录聚合酶链反应检测分化细胞的甲胎蛋白(AFP)、白蛋白、人细胞角蛋白18(CK-18)及酪氨酸氨基转移酶(TAT)基因的表达,以免疫荧光染色法检测分化细胞胞浆中AFP、白蛋白、CK-18的表达;用电子显微镜观察分化细胞的超微结构.结果 培养的脐血MSCs不表达CD14、CD34及CD45,也不表达CD49f、CD54及HLA-DR;部分表达CD106;强表达CD13、CD29及CD44.未分化的脐血MSCs不表达AFP、TAT及白蛋白基因,弱表达CK-18基因;诱导分化1周后可检测到AFP基因的表达,诱导分化4周后,不仅表达AFP、CK-18和白蛋白基因,还表达TAT基因.免疫荧光染色显示,未分化的MSCs胞浆中无AFP、白蛋白及CK-18的表达;分化细胞则可以检测到上述物质的表达.诱导至第4周的分化细胞,可见核仁大且明显,细胞核周围有板层状的内质网,胞浆中可见脂滴及簇状糖原,线粒体丰富,细胞表面有微绒毛.结论 脐血MSCs在合适的诱导条件下可以分化为肝样细胞.     

Development of a Bioartificial Liver with Sandwiched-Cultured Hepatocytes Between Two Collagen Gel Layers

Abstract: We have been developing a multiplate type of bioartificial liver (BAL) using primary cultured hepatocyte monolayers since 1987. This BAL has been shown to prolong the survival time of anhepatic dogs and rabbits. Initially, hepatocytes were cultivated on collagen-coated plates. To increase the multiplated BAL function, a sandwich cultivation method was employed in which rat hepatocytes were cultured between two collagen gel layers and were then evaluated in both stationary and perfusion cultures. In the stationary culture, the sandwich method showed a higher activity in urea synthesis than in the other culture methods (culture on a collagen coating, culture on a collagen gel, and culture between a collagen coating and a collagen gel) for 14 days. In the perfusion culture, a BAL housing cultured hepatocytes (6.5 times 10 cells) in the sandwich system showed urea synthesis activity ranging from 17.5 to 22.6 μg/2 times 10⁶ cells/90 min. This activity was maintained for 5 days in the perfusion culture. The sandwich type of cultivation is applicable to the multiplated BAL.     

白细胞介素1β对大鼠肝细胞毒性作用的细胞内信号传导途径

目的研究白细胞介素-1β(IL-1β)对原代培养大鼠肝细胞细胞毒性作用的细胞内信号传导机制. 方法使用雄性Wistar大鼠,原位胶原酶灌注分离肝细胞.应用比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)活性,Wes tern Blot方法分析c-Jun N末端激酶(JNK)、p38激酶的表达,凝胶电泳移动抑制实验检测激活物蛋白-1(AP-1)的结合活性. 结果 IL-1 β促进原代培养大鼠肝细胞LDH释放(IL-1β刺激组与对照组LDH活性分别为21.9%±3.6% 和11.0%±1.8%,P＜0.01);IL-1β通过激活JNK途径,激活转录因子AP-1,对原代培养大鼠肝细胞产生细胞毒性作用,而同时激活的p38激酶途径对这一过程起负性调节作用. 结论 IL-1β通过激活JNK途径,激活转录因子AP-1,对原代培养大鼠肝细胞产生细胞毒性作用.     

不同浓度褪黑激素对新生大鼠海马神经元电压门控性瞬时外向钾电流的影响

目的 探讨不同浓度褪黑激素对新生大鼠海马神经元电压门控性瞬时外向钾电流(I_A)的影响.方法 原代培养新生Wistar大鼠(出生时间<12 h)海马锥体神经元7～12 d.配制褪黑激素溶液,终浓度依次为1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L和1 mmol/L,选择胞体清晰、光晕良好、轴突明显的锥体神经元采用膜片钳全细胞记录模式记录I_A的基本电生理特点,记录不同浓度褪黑激素作用下I_A的动力学.结果 与褪黑激素作用前比较,1、10 nmol/L褪黑激素作用后海马锥体神经元I_A幅度升高(P<0.05),其余浓度褪黑激素作用前后海马锥体神经元I_A幅度比较差异无统计学意义(P>0.05);10 nmol/L褪黑激素作用后海马椎体神经元电压门控性瞬时外向钾通道激活曲线的半数激活膜电位及曲线斜率因子与褪黑激素作用前比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 生理浓度褪黑激素可增加体外新生大鼠海马椎体神经元I_A.     

Intrasplenic transplantation of encapsulated hepatocytes decreases mortality and improves liver functions in fulminant hepatic failure from 90% partial hepatectomy in rats

BACKGROUND: Encapsulated cell therapy might be a promising approach to enable cell transplantation without immunosuppression. This study investigates the viability and hepatic function of hepatocytes encapsulated with alginate/poly-L-lysine in vitro and the effect of the intrasplenic transplantation of cultured encapsulated hepatocytes on survival in 90% hepatectomized rats as a preliminary step toward allogeneic hepatocyte transplantation without immunosuppression. MATERIALS AND METHODS: Rat hepatocytes were isolated and encapsulated using alginate/poly-L-lysine. Encapsulated hepatocytes were cultured for 28 days to measure cell viability, liver function, and morphology. Rats were treated with a 90% partial hepatectomy and then immediately underwent the intrasplenic transplantation of the cultured encapsulated hepatocytes, the capsule alone, or the allogeneic hepatocytes without the capsule. The survival rate, liver function, and cell morphology were assessed after transplantation. RESULTS: The cultured encapsulated hepatocytes maintained their viability and showed better metabolic activity than day 0 cultured encapsulated hepatocytes. The encapsulated cells strongly expressed albumin and were positive for periodic acid-Schiff staining. Electron microscopy demonstrated that the microencapsulated hepatocytes retained the structural elements of hepatic cytoplasm and nuclei. Intrasplenic transplantation of the encapsulated hepatocytes increased the survival rate and improved the hepatic function. Encapsulated hepatocytes transplanted into rat spleen survived well and retained their hepatic function. Moreover, dramatic liver regeneration was observed 48 hr after transplantation in the group that received intrasplenic transplantations of encapsulated hepatocytes. CONCLUSIONS: The intrasplenic transplantation of cultured encapsulated hepatocytes improved the survival rate of an acute liver failure rat model induced by a 90% partial hepatectomy.