人PINK1抗血清的制备及其免疫活性物质在大鼠脑组织中的表达

目的制备帕金森病相关蛋白PINK1抗血清并检测其在大鼠脑组织中的表达特征。方法制备人PINK1基因重组蛋白,免疫新西兰大耳白兔获得抗PINK1抗血清;通过盐析法初步纯化、Western blotting法鉴定抗血清的敏感性和特异性、免疫组化法检测PINK1在大鼠脑中的分布。结果人PINK1基因重组蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达;纯化蛋白制备兔抗血清经盐析纯化后,兔抗人PINK1抗血清特异性识别人PINK1基因重组蛋白及大鼠脑匀浆中40000和66000的蛋白质,与预期结果一致;免疫组化染色显示PINK1广泛分布在嗅球、皮质、海马、纹状体、小脑、黑质和红核。结论制备了一种兔抗人PINK1多克隆抗血清;PINK1广泛分布于大鼠中枢神经系统;为以后深入研究PINK1表达的组织分布、细胞内定位及其生物学功能提供了有效地实验工具。     

巢蛋白的克隆、表达、抗体制备及免疫组化分析

目的 在原核系统中克隆、表达并纯化巢蛋白（nestin）．制备特异性nestin抗体,用于研究nestin在中枢神经系统发育中的生物学特性．探索神经发育及再生规律。方法 采用RT—PCR方法由人神经干细胞中获取nestin cDNA,与原核表达载体pQE30连接,构建重组载体pQE30-nestin。测序后．将重组质粒转入大肠杆菌M15,IPTG诱导表达His融合蛋白。Ni-NTA亲和层析柱纯化后,SDS-PAGE电泳和Westem blotting鉴定。用此蛋白免疫BALB／c小鼠,获得抗血清。Westemblotting、ELISA和免疫组织化学分析鉴定获取的抗血清。结果 成功由人神经干细胞中克隆nestin cDNA片段。胛G诱导重组质粒pQE30-nestin表达出一相对分子质量约25000的His融合蛋白并被Ni．NTA成功纯化．Westem blotting证明其确为nestin蛋白。动物免疫后．经Westem blotting、ELISA和免疫组化鉴定,获得的抗血清可特异性结合重组nestin蛋白、发育期人及大鼠脑内的nestin蛋白。结论 获得了重组人nestin蛋白．制备的抗血清不仅可识别重组nestin蛋白,亦可识别人及大鼠脑组织内的nestin蛋白。     

人神经元特异性烯醇化酶蛋白表达及抗体制备

目的克隆和表达人的神经元特异性烯醇化酶(HuNSE)基因,制备HuNSE多克隆抗体,以期用于朊病毒病及相关疾病的临床诊断。方法经RT-PCR扩增HuNSE基因和测序验证后,将其克隆于原核表达载体pQE30,在大肠杆菌M15中诱导表达HuNSE蛋白,蛋白经Ni-NTA亲和纯化后,免疫兔子,所制备的抗血清用ELISA、Westernblotting和免疫组化鉴定。结果所表达的HuNSE蛋白相对分子质量约为22000,以其为抗原制备的HuNSE特异性抗血清具有良好的免疫反应性。Westernblotting和免疫组化结果显示抗血清可识别重组和不同哺乳动物脑组织中的NSE蛋白。结论NSE基因在大肠杆菌中获得了高效表达,所制备的NSE特异性抗血清可用于朊病毒病及其他神经退行性疾病的诊断和研究。     

电压门控型钾通道蛋白Kv1.5抗血清的制备及特性鉴定

目的 制备电压门控型钾通道蛋白Kv 1.5的多克隆抗体,对其特性进行鉴定.方法 利用生物信息学方法分析Kv 1.5蛋白的序列,根据亲水性结构、柔韧区、抗原指数及表面概率结构等指标选择一段8个氨基酸序列,据此合成Kv 1.5多肽片段,并将其与载体蛋白钥孔戚血蓝素(KLH)偶联作为免疫抗原,免疫新西兰白兔制备抗Kv 1.5抗血清.辛酸-硫酸铵法纯化抗血清,对纯化后的抗血清进行 ELISA、Western blot鉴定.结果 成功获得抗Kv 1.5合成肽的抗血清,该抗血清效价为1∶ 64 000,可与Kv 1.5合成肽及天然Kv 1.5蛋白出现特异性反应,该抗血清识别的相应抗原的相对分子质量(Mr)为59 kD.同时,Western blot结果显示,所制备的抗血清能识别大鼠心脏天然Kv 1.5蛋白.结论 合成的多肽-KLH复合物具有免疫原性,可用于制备相应的抗血清,并且制备的抗血清经 ELISA、Western blot鉴定后特异性较好.     

大鼠胃底腺胃蛋白酶原单特异性抗体的制备

目的：建立一种胃蛋白酶原的单特异性抗体的制备方法,进行胃蛋白酶原的研究。方法：从大鼠胃蛋白酶原氨基酸序列中选择第297－314号氨基酸,合成多肽链作为抗原免疫家兔,得到抗血清,用蛋白印记检测（Wnestern Blot),酶联免疫吸附测定（ELISA）及免疫组化染色检测抗体的特异性及效价。结果：Western Blot和免疫组化染色显示,得到的抗体对胃蛋白酶原有单特异性,抗体的效价ELISA反应达到1：100000,免疫组化染色可达到1：50000。结论：用合成多肽链为抗原制备的胃蛋白酶抗体,具有单特异性和较高的抗体效价,可用于免疫组化,Western Blot,ELISA等方法,进行大鼠胃底腺的相关研究。     

兔抗人心肌肌钙蛋白I抗体的制备与鉴定

目的制备兔抗人心肌肌钙蛋白I抗体并进行鉴定。方法用人工合成的cTnI蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA及Western blot方法检测制备的抗血清效价和特异性。结果此次获得的抗血清 ELISA方法检测抗体滴度达到了1:16 000,检测cTnI的灵敏度最低为10μg/L。Western blot检测表明该抗体可有效识别原核细胞表达及大鼠心脏组织提取物中存在的cTnI蛋白。结论应用该方法成功制备了人cTnI的多克隆抗体,为进一步研究cTnI的结构与功能打下基础,并为有效制备高特异性的单克隆抗体提供借鉴。     

杜氏盐藻葡萄糖-6-磷酸异构酶重组蛋白的纯化及其多克隆抗体制备

目的：纯化杜氏盐藻葡萄糖-6-磷酸异构酶（GPI）重组蛋白,制备多克隆抗体。方法：PCR扩增得到两端分别添加NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点的GPI基因,双酶切后插入原核表达载体pET28a（＋）,得到重组载体pET28a-GPI,经鉴定正确后,用该重组载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达后用镍离子柱纯化目的蛋白并免疫新西兰白兔,间接ELISA和Westernblot法检测抗体的效价和特异性。结果：杜氏盐藻GPI基因在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达,占总蛋白的41.6%。以高纯度的目标蛋白作为抗原免疫新西兰白兔,得到抗GPI的抗血清。间接ELISA检测抗血清效价达到1：512000,Westernblot检测证实抗血清能与目的蛋白特异性结合。结论：成功纯化了杜氏盐藻GPI重组蛋白并制备了特异性的GPI多克隆抗体。     

利用DNA免疫技术制备抗登革2型病毒NS2B蛋白多克隆抗体

目的构建登革2型病毒(dengue virus serotype2,DV2)非结构蛋白NS2B的真核表达质粒pCAGGS-P7/NS2B,进行DNA免疫,制备小鼠抗NS2B特异性多克隆抗体。方法PCR扩增DV2-NS2B基因片段,构建真核表达载体pCAGGS-P7/NS2B,采用脂质体介导的方法转染Vero细胞,检测目标蛋白的表达。用该表达质粒免疫BALB/c小鼠,制备抗NS2B抗血清。结果成功构建真核表达重组质粒pCAGGS-P7/NS2B,该重组质粒具有良好的免疫原性,免疫小鼠后所获的抗血清,抗体效价达1∶3200,Western blot和间接免疫荧光证实抗血清能特异性地识别DV2-NS2B蛋白。结论通过DNA免疫所制备小鼠抗DV2-NS2B抗血清能特异性地识别DV2-NS2B蛋白。     

小鼠组蛋白去乙酰化酶2多肽抗血清的制备

目的利用人工合成小鼠组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2,HDAC2)多肽制备特异性抗HDAC2抗血清,用于相关疾病的体内外诊断。方法根据HDAC2基因编码的氨基酸序列合成多肽,与载体偶联后免疫动物,所制备的抗血清用ELISA、Western blot及免疫组织化学方法鉴定。结果 ELISA检测表明所制备的抗血清可同多肽抗原发生阳性反应,效价1∶4 000;Western blot结果显示抗血清可与多肽抗原及APP/PS1转基因小鼠的脑组织发生反应;免疫血清1∶100,1∶200,1∶400,1∶800四个稀释度均能与小鼠脑组织中的HDAC2反应。结论所制备的多肽抗血清可识别组织及血清中的HDAC2,可应用于相关领域的体内外研究。     

不同免疫方案制备鼠抗PBP2a多克隆抗体的比较

目的制备针对青霉素结合蛋白（PBP2a）的抗血清,比较不同免疫方案的免疫效果。方法以基因工程重组PBP2a转肽酶区蛋白作为免疫原,采用多种注射途径（足垫、腹腔、足垫＋腹腔、足垫＋皮下）免疫BALB／C小鼠,ELISA和Western-blot法检测所制备的抗血清效价和特异性。结果足垫快速免疫组、腹腔免疫组、足垫和腹腔免疫组、足垫加皮下免疫组的效价依次为1：12800、1：25600、1：51200、1：102400。Western-blot显示所制备的抗血清能有效识别原核表达及耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）临床分离株中的PBP2a。结论重组PBP2a蛋白免疫BALB／c小鼠能有效刺激特异性抗体的产生,足垫加皮下多点免疫法是一种值得推崇的免疫方案。     

人I型谷丙氨酸氨基转移酶的原核表达及抗血清的制备

目的：构建人谷丙氨酸氨基转移酶（ALT1）的原核表达载体,并用纯化的ALT1重组蛋白免疫家兔,制备ALT1抗血清．方法：从HepG2细胞中提取总RNA,RT—PCR扩增alt1基因,并将其克隆人pMD19-T载体中测序,将测序正确的目的基因克隆至PET-32a（＋）表达载体中,并诱导其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达;所获得的包涵体蛋白经亲和层析纯化、透析复性、WesternBlot鉴定后,免疫家兔制备抗血清,抗体效价和特异性分别采用ELISA,WesternBlot进行检测．结果：测序证实克隆的基因序列与GenBank中的ALT1序列相符;SDS—PAGE,Westernblot结果证实获得Mr为75×10^3的ALT1融合蛋白,其表达形式为不溶性包涵体;此包涵体蛋白经Ni^2＋亲和层析能有效纯化,以该蛋白免疫家兔制备抗血清,抗体效价为1：100000,WesternBlot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合．结论：获得了ALT1重组蛋白及特异性多克隆抗体．     

人胱抑素C的原核表达纯化鉴定及抗血清的制备

目的 构建人胱抑素C(cystatin C, Cys C)的原核表达载体,并用纯化的Cys C重组蛋白免疫家兔,制备Cys C抗血清. 方法 从HL-60细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增Cys C基因,将测序正确的目的基因克隆至pET32 (a)表达载体中,并诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达;所获得的包涵体蛋白经亲和层析纯化、透析复性、Western blot鉴定后,免疫家兔制备抗血清,抗体效价和特异性分别采用ELISA、Western blot进行检测.结果 测序证实克隆的基因序列与GeneBank中的Cys C序列相符;SDS-PAGE、Western blot结果证实获得相对分子质量为35×103的Cys C 融合蛋白,其表达形式为不溶性包涵体;此包涵体蛋白经Ni2 亲和层析能有效纯化,以该蛋白免疫家兔制备抗血清,抗体效价为1∶8 000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合. 结论 获得了Cys C重组蛋白及特异性多克隆抗体.     

人CD96基因胞外区的原核表达及抗血清制备

摘要：目的原核表达并纯化人CD96胞外区蛋白,免疫家兔制备抗体。方法构建pET32-CD96重组质粒,转化大肠埃希
菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Ni2+-NTA树脂纯化蛋白并免疫家兔,以间接ELISA检测抗体效价,Western blot鉴定抗
体特异性。结果质粒pET32-CD96经测序鉴定,通过SDS电泳显示能在BL21(DE3)中高效表达,相对分子质量约37 000;
Western blot实验结果显示制备的多克隆抗体可与HL-60细胞提取蛋白及原核表达的人CD96蛋白胞外区特异性结合。
结论成功构建并表达人CD96胞外区蛋白,免疫家兔获得高滴度抗血清,为后续研究奠定了基础。     

小鼠ZP2抗体的制备及其免疫活性研究

目的制备抗小鼠ZP2（mZP2）抗体并研究抗血清的免疫活性。方法利用Rosetta宿主菌诱导表达mZP2重组蛋白,电泳
分离重组ZP2蛋白,切胶制备免疫抗原;利用乳化抗原主动免疫新西兰雄兔制抗血清;通过ELISA测定抗体应答水平;以免疫组
化测定抗血清特异性;通过精卵结合实验检测抗血清对小鼠卵子结合顶体反应后精子的影响。结果ELISA结果说明用重组蛋
白免疫新西兰雄兔诱发产生了抗血清。免疫组化实验证明抗血清与小鼠卵巢透明带发生了特异性反应,精卵结合实验显示抗
ZP2抗体能抑制顶体反应后精子与卵子结合。结论重组mZP2蛋白诱发产生了抗ZP2抗体,抗体能抑制顶体反应后的精子与
卵子结合。
     

新型半胱氨酰白三烯受体GPR17的多克隆抗体制备及其鉴定

目的：制备新型半胱氨酰白三烯受体GPR17的多克隆抗体（pAb）,并鉴定其免疫学特性。方法：以KLH偶联的GPR17多肽免疫家兔制备其pAb,用间接ELISA法测定抗体效价,阻断ELISA测定抗体敏感性及特异性,同时以新制备的抗体做Westernblot,检测GPR17的组织表达。结果：通过免疫家兔获得的抗GPR17pAb,ELISA测定显示其抗体效价最高可达到1／16364,并对CysLT1受体和CysLT2受体基本无交叉反应,具有较好的特异性。Westernblot结果显示,GPR17在大鼠脑和心脏组织中有较高的表达,其分子量在43kD左右。结论：制备的GPR17pAb具有较高的效价和较好的特异性,能满足Westernblot检测GPR17的要求。     

阴道毛滴虫肌动蛋白cDNA克隆与表达

目的克隆阴道毛滴虫肌动蛋白基因片段,表达及纯化肌动蛋白重组蛋白,免疫豚鼠获得抗血清,为进一步研究肌动蛋白在阴道毛滴虫体内定位及其在细胞衰老过程中的作用奠定基础。方法应用PCR方法获得阴道毛滴虫肌动蛋白基因部分片段,并克隆入表达载体pET-41a,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21,IPTG诱导重组质粒表达,亲和层析纯化表达产物,Brandford法测定重组蛋白含量并免疫豚鼠,用SDS-PAGE和Western-blot进行分析鉴定。结果肌动蛋白基因的PCR产物片段大小500bp;构建了阴道毛滴虫肌动蛋白基因重组表达质粒;表达了肌动蛋白重组蛋白;SDS-PAGE显示分离纯化的肌动蛋白重组蛋白为47000u;Western-blot结果表明所获得抗血清可与肌动蛋白重组蛋白在47000u及阴道毛滴虫总蛋白在41000u处特异性反应。结论重组肌动蛋白获得高效表达,其免疫豚鼠获得的抗血清可与阴道毛滴虫肌动蛋白重组蛋白反应,也可识别阴道毛滴虫虫体肌动蛋白,该抗血清可用于进一步的研究。     

人3型腺病毒纤突的原核表达及其免疫原性分析

目的克隆表达人3型腺病毒(HAdV-3)的纤毛蛋白纤突片段(knob),分析其免疫原性,为腺病毒临床诊断试剂及新型疫苗的研发奠定基础。方法 PCR扩增knob基因片段,克隆到表达载体pGEX-4T-3中进行诱导表达,SDSPAGE电泳分析表达产物,包涵体溶解复性后亲和层析纯化融合蛋白,Western blot鉴定,纯化的蛋白免疫小鼠制备抗血清,间接ELISA法检测小鼠血清的效价,Western blot鉴定抗血清特异性。结果成功构建了重组原核表达质粒pGEX-Ad3 knob,其在大肠杆菌中高效表达并纯化重组knob融合蛋白,融合蛋白免疫小鼠抗血清效价高达10~7,Western Blot证实此抗血清可识别人3型腺病毒纤维蛋白。结论成功获得了重组HAdV-3 knob蛋白,其具有强免疫原性,可以作为研发人3型腺病毒入侵机制研究、诊断试剂及疫苗研发的原料。     

Argonaute系列蛋白多克隆抗体制备和鉴定及组织定位

目的制备一系列Argonaute（简称AGO）蛋白多克隆抗体,并鉴定其特异性,应用组织芯片初步探讨其在人类组织中的分布。方法合成特异性AGO多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）作为载体构建多肽免疫原,通过致敏大白兔,制备系列兔抗人AGO多克隆抗体,然后用亲和层析法纯化抗体。用ELISA和western方法进行抗体验证,并应用人组织芯片进行AGO的免疫组化研究。结果通过构建系列AGO多肽-KLH载体复合物致敏大白兔,成功制备了3个兔抗人AGO蛋白多克隆抗体,经ELISA及Westernblot证实兔抗人AGO抗体可特异性识别AGO多肽,在人组织芯片中通过免疫组化染色显示该抗体在部分肿瘤组织上皮来源细胞胞浆中呈阳性染色。结论本项研究成功制备系列兔抗人AGO多克隆抗体,为进一步研究AGO在miRNA／RNAi通路中的作用及在人类疾病中的意义提供了有利工具。     

兔抗人RBBP10多克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备兔抗人RBBP10多克隆抗体并进行鉴定.方法 用人工合成的RBBP10蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA及Western blot方法检测制备的抗血清效价和特异性.结果此次获得的抗血清ELISA方法检测抗体效价达到1:16000,检测RBBP10的灵敏度最低为10μg/μ1.Western blot检测表明抗体效价高,特异性强.结论 应用该方法成功制备了人RBBP10多克隆抗体,此抗体可通过免疫组化方法检测RBBP10蛋白在各种肿瘤中的表达,具有一定的应用价值.     

人前列腺干细胞抗原在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

目的:克隆并在大肠杆菌中表达人前列腺干细胞抗原(PSCA)基因,制备其抗血清.方法:通过PCR方法扩增包含蛋白融合点的PSCA基因片段,经DNA测序证实后克隆至带有Trx.6His标签的原核表达载体pET32a,重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达结果,经Ni-NTA树脂亲和纯化的蛋白皮下注射免疫小鼠,ELISA检测抗血清的滴度,免疫组化鉴定其特异性.结果:PCR扩增得到241 bp的目的片段,序列测定证实与GenBank上登录的序列一致;成功构建了PSCA基因片段的原核表达载体pET32a-PSCA;在大肠杆菌中表达,于相对分子质量为20.4×103处有一蛋白新生带;PSCA融合蛋白免疫小鼠后,ELISA确认抗血清的滴度>1∶4 000.抗血清检测到前列腺癌组织中PSCA的表达. 结论:成功克隆、表达了人PSCA融合基因片段,并制备了相应的抗血清.