人脐血干细胞移植治疗大鼠脑缺血的实验研究

目的研究人脐血干细胞(HUCBCs)移植治疗脑缺血大鼠的疗效及HUCBCs在缺血大鼠脑内的状况。方法采集足月新生儿脐带血60～100ml,分离出其中的单个核细胞,体外培养并予5溴脱氧嘧啶尿苷(Brdu)标记48h。采用线栓法制作大鼠脑缺血再灌注模型,1d后将3×106HUCBCs经缺血侧侧脑室注射入大鼠脑内。在移植后不同时间对大鼠进行神经损害严重程度评分(NSS),用免疫组化技术观察移植后的HUCBCs的存活、迁徙、分化状况。结果HUCBCs在体外具有增殖能力;移植组大鼠自移植后3周起其NSS显著低于对照组(均P<0.05);移植后2周、4周、6周脑组织切片中均可见Brdu染色阳性细胞,缺血侧明显多于对侧(均P<0.05),移植后4周、6周明显多于移植后2周(均P<0.05);移植组各时间点脑组织切片中均可见神经巢蛋白阳性细胞;植入的HUCBCs在大鼠脑内能向损伤区域迁徙并能分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元。结论HUCBCs能在缺血大鼠脑内存活、迁徙和分化,并能改善其神经功能。HUCBCs移植可作为脑梗死的有效治疗手段。     

异体骨髓间充质干细胞对EAE大鼠神经再生保护作用的研究

目的观察异体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植后在EAE大鼠体内存活、增殖、分化,探讨BMSCs对EAE的神经再生的修复作用及迁徙分化情况。方法 SD雌性大鼠45只,随机分为3组,其中EAE模型组20只,正常对照组5只,EAE模型BMSCs移植组20只。重组免疫蛋白MBP68-86诱导建立EAE的动物模型,在免疫后早期第5天静脉输注Wistar大鼠的BMSCs(4×106/只,0.4mL)。观察输注后大鼠神经功能变化和组织学变化,利用免疫组化方法检测不同时间脑脊髓神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、2’,3’-环腺苷酸-3’-磷酸二酯酶(CNPase)表达,观察BMSCs移植后EAE大鼠体内神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞数量。结果 EAE大鼠免疫后早期移植BMSCs,神经功能评分无论是高峰期评分还是平均评分显著低于EAE模型组。BMSCs移植组在第7天NSE阳性细胞数较EAE模型组表达水平增多,但并无显著性差异,而第15天、第21天和第30天NSE阳性细胞数明显高于EAE模型组的表达水平(P0.05)。BMSCs移植组各时间点CNPase染色阳性细胞数明显高于EAE模型组的表达水平(P0.05),随着时间迁移,BMSCs移植组CNPase染色阳性细胞数表达逐渐增加。BMSCs移植组各个时间点GFAP阳性细胞数与EAE模型组比较无显著性差异。病理检查显示EAE大鼠免疫后早期移植BMSCs可使脑组织炎症反应减轻,脱髓鞘病灶的数目也明显少于EAE模型组。结论预防性静脉输注BMSCs可能通过免疫调节,抑制免疫反应所致的神经细胞损伤,减少神经元和少突胶质细胞的凋亡,从而发挥神经保护作用,但不能排除仍有部分BMSCs在局部微环境信号的诱导下向脱髓鞘区迁徙并分化为髓鞘形成细胞的可能。     

帕金森病大鼠海马区增殖神经干细胞分化情况的研究

目的探讨帕金森病(PD)大鼠海马区增殖神经干细胞(NSCs)的分化情况。方法将6羟基多巴(6OHDA)注入大鼠纹状体内制作PD动物模型。连续注射5嗅脱氧尿核苷(Brdu)14d后处死。分别用Brdu和神经核抗原(Neun)以及Brdu和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫双标组织化学方法检测增殖的NSCs向神经元和神经胶质细胞的分化情况。结果PD模型成功后7d,在海马区Brdu/GFAP、Brdu/Neun阳性细胞开始出现,14d后双标的阳性细胞数逐渐增加,28d后达高峰。在这些双标的细胞中,Brdu/GFAP阳性的细胞数较多,而Brdu/Neun阳性的细胞数较少。结论6OHDA纹状体内注射制作的PD大鼠模型海马区增殖的NSCs大部分分化为神经胶质细胞,少部分分化为神经元。     

人脐血细胞静脉移植对自发性高血压大鼠缺血再灌注脑损伤疗效及其机制探讨

目的探讨人脐血细胞(HUCBCs)静脉移植治疗自发性高血压(SHR)大鼠缺血再灌注脑损伤疗效及其相关机制。方法人脐血细胞体外分离、扩增并以4,6-2胺-2苯基吲哚(DAPi)标记。68只雄性SHR大鼠经线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,并随机分为2组:治疗组和对照组。术后48h后经尾静脉治疗组注射1×106HUCBCs,对照组注射HUCBCs细胞培养基。于移植后3、14、28d,Bederson评分观察大鼠神经功能状况;图像分析法检测计算各组TTC染色脑梗死面积;荧光显微镜对治疗组脑组织DAPi染色阳性细胞计数;免疫组化法检测脑组织内脑源性神经营养因子(BDNF)染色阳性细胞数以及逆转录聚合链式反应(RT-PCR)检测移植后14、28d缺血侧脑组织BDNFmRNA表达水平。结果(1)移植后3d2组Bederson评分无显著差别,移植后14、28d治疗组显著低于对照组(P<0.05)。(2)移植后3d两组脑梗死面积无显著差别,移植后14、28d治疗组显著低于对照组(P<0.05)。(3)治疗组移植后3d梗死侧见少量DAPi阳性染色细胞,移植后14、28d梗死侧DAPi阳性染色细胞增加(P<0.05)...     

实验性自身免疫性脑脊髓炎的视神经病理改变

目的 研究实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的视神经病理改变.方法 足垫皮下注射豚鼠脊髓匀浆和完全弗氏佐剂(CFA)混合物制作Wismr大鼠EAE模型,于发病后第6d将大鼠处死,取视神经、脑和脊髓,行HE和LFB染色,光镜和电镜下观察其病理改变.结果 病理检查发现EAE模型组大鼠脑、脊髓有不同程度的炎症反应和脱髓鞘改变;均有视神经病变,光镜主要表现为炎症反应和脱髓鞘,视神经髓鞘脱失重于炎症反应;电镜主要表现为髓鞘稀疏,少突胶质细胞数量减少、胞核固缩,其周围包裹的髓鞘板层松解,轴突髓鞘分离.结论 EAE大鼠存在明显的视神经病变,主要为视神经炎症反应和脱髓鞘改变.     

神经干细胞移植对脑出血模型大鼠神经功能的影响☆

背景：外源性神经干细胞具有神经修复作用，可能对脑出血后的神经功能恢复起到一定的作用。 目的：观察胎鼠神经干细胞的体外生长、分化及移植到脑出血大鼠后的存活、迁徙、分化情况，探讨神经干细胞对脑出血模型大鼠受损神经功能的修复作用。 设计：完全随机分组设计，对照动物实验。 单位：复旦大学附属华山医院神经外科 材料：选用健康雄性成年SD大鼠18只为受体，体质量280~320 g，由中国科学院上海实验动物中心提供。实验用鼠抗BrdU为Neomarkers产品, 鼠抗胶质纤维酸性蛋白和兔抗微管相关蛋白2 为Chemicon产品。 方法：实验于2006-02/12在复旦大学附属上海医学院解剖组胚实验室完成。从胎龄14 d的胎鼠海马中分离、培养、鉴定神经干细胞。16只受体SD大鼠被随机分为3组：对照组，PBS组和移植神经干细胞组。均通过尾状核内注射自体动脉血制作大鼠脑出血模型。移植NSC组在造模后30 min在血肿腔周围四点分别移植浓度为2×1011 L-1神经干细胞悬液5μL；PBS组于相同时间点在脑内相同部位注射PBS；PBS和神经干细胞的移植方法同自体血的移植方法。对照组大鼠在造模后30 min只造成四点损伤，不注射任何物质。 主要观察指标：在造模后立即，1，3，5，14，21，28 d采用前肢评分和转身评分对大鼠神经功能进行评估。大鼠于造模后28 d麻醉后取脑，并通过双标胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2、BrdU免疫组化来检测移植入脑的神经干细胞在体内的分化情况。 结果：①神经功能评分：造模后5 d，各组差异无显著性意义（P > 0.05）。造模后14~28 d，干细胞移植组较其他3组明显改善（P < 0.05）。②脑组织切片双免疫组织学双标染色结果：干细胞移植组血肿周围凋亡细胞少于PBS组。受体大鼠脑组织切片显示有BrdU, 微管相关蛋白2,胶质纤维酸性蛋白阳性细胞，说明神经干细胞可以在宿主脑内存活、迁徙和分化，可以分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞。 结论：神经干细胞移植可能通过分化为神经元样细胞和神经胶质细胞促进大鼠脑出血的神经功能恢复。     

人胚神经干细胞及人脐血干细胞移植治疗大鼠脑缺血的实验研究

目的 研究人胚神经干细胞（hNSCs）、人脐血干细胞（hUCBCs）移植治疗脑缺血大鼠的效果及其在缺血大鼠脑内的增殖、分化状况,并对两种干细胞移植的效果进行比较。方法 从自然流产的孕10～13周的人胚脑组织中分离、培养hNSCs;采集足月新生儿脐带血60～100ml,分离出其中的单个核细胞;移植前hNSCs、hUCBCs均经5–溴脱氧嘧啶尿苷（Brdu）标记48h。采用线栓法制作大鼠脑缺血模型,1d后经尾静脉移植未分化的hNSCs、hUCBCs入脑缺血大鼠体内,对移植后大鼠进行神经损害严重程度评分（NSS）,用免疫组化方法观察移植后hNSCs、hUCBCs的存活、迁移、分化状况。结果 从人胚脑中成功培养出hNSCs,培养条件下呈悬浮状态生长,形成神经球;hUCBCs在体外具有增殖能力。两移植组大鼠均自移植后21d起其NSS显著低于对照组（P<0.05）,两移植组移植前及移植后各时间点NSS分别比较未发现显著性差异（P>0.05）;移植后14、21、28、35d脑组织切片中均可见Brdu染色阳性细胞,缺血侧明显多于对侧（P<0.05）,移植后21、28、35d明显多于移植后14d（P<0.05）;hNSCs组Brdu染色阳性细胞数多于hUCBCs组（P<0.05）;移植组各时间点脑组织切片中均可见nestin染色阳性细胞;在Brdu阳性细胞群中,hNSCs组73.8%为胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色阳性细胞,16.7%为2,3–环核苷酸磷酸二脂酶（CNPase）染色阳性 细胞,9.5%为神经元特异性烯醇化酶（NSE）染色阳性细胞;hUCBCs移植组74.5%为GFAP染色阳性细胞,15.4%为CNPase染色阳性细胞,10.1%为NSE染色阳性细胞;两组比较差异无显著性（P>0.05）。结论 hNSCs、hUCBCs均具有多分化潜能,受缺血部位微环境信号的影响分化成3种主要类型的神经细胞;静脉移植hNSCs、hUCBCs能有效改善脑梗死动物的神经功能;除了hNSCs外,hUCBCs移植也是治疗缺血性脑血管病的一种可能手段。     

IFN-γ和caspase-3在实验性自身免疫性脑脊髓炎病程中动态表达及雷公藤多甙保护作用的探讨

目的观察EAE大鼠模型脊髓caspase-3和IFN-γ的表达,探讨雷公藤多甙对EAE大鼠的保护作用。方法将60只Wistar大鼠随机分成CON组、EAE组、TWP1组、TWP2组,建模后各组又分为第7天、第14天、第21天3个亚组,分别行神经功能评分,大鼠脊髓组织行HE染色,免疫组化检测脊髓中caspase-3和IFN-γ的表达情况。结果 (1)行为学观察:在第14天、第21天TWP1、TWP2组神经功能评分均小于EAE组(P<0.05);第14天TWP2组神经功能评分小于TWP1组(P<0.05)。(2)组织病理学观察:CON组大鼠脊髓无炎性细胞浸润;第14天、第21天,TWP1组和TWP2组血管袖套数目少于同期的EAE组(P<0.05)。(3)caspase-3和IFN-γ表达:TWP1组、TWP2组低于同期EAE组(P<0.05);EAE组中21d组、7d组分别与14d组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 EAE大鼠脊髓caspase-3和IFN-γ阳性表达的细胞数量与病情变化一致,雷公藤多甙干预能减轻EAE大鼠发病,减少大鼠脊髓内caspase-3和IFN-γ的表达。     

实验性变态反应性脑脊髓炎的病理学研究

目的用豚鼠脊髓匀浆诱发实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)大鼠模型。方法应用豚鼠脊髓匀浆加完全弗(氏)佐剂和百日咳杆菌免疫Wistar大鼠。结果免疫后8～14d大鼠发病,发病率为67%,病理学证实发病大鼠脑和脊髓内具有典型的脱髓鞘改变和炎性细胞浸润。结论以豚鼠脊髓匀浆为抗原免疫Wistar大鼠可诱发EAE,具有发病率较高,费用低廉,模型稳定的特点,可作为研究多发性硬化的动物模型。     

造血干细胞与神经生长因子联合移植治疗脑梗死

背景：目前采用外周血造血干细胞移植治疗脑缺血方面的研究还比较少,缺乏大量、系统的实验数据。神经生长因子可调控神经元再生所需的微环境,对神经细胞的存活、增殖起重要作用。 目的：观察造血干细胞移植后,神经生长因子对其在脑梗死大鼠脑内的存活、分化及神经功能的影响。 设计：随机对照动物实验。 材料：清洁级成年雄性SD大鼠120只,随机分为3组：单纯细胞移植组、细胞移植+神经生长因子组、模型对照组,40只/组。神经生长因子为北大之路药业有限公司产品。 方法：大鼠颈部皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子后,密度梯度离心法分离培养造血干细胞,移植前行Brdu标记。3组大鼠根据改良Longa线栓法建立大脑中动脉闭塞模型,造模后7 d,大鼠麻醉后暴露前囟,选取注射位点：前囟后方1.2 mm,中线向右旁开3 mm,硬膜下4 mm。单纯细胞移植组缓慢注入1×106个造血干细胞,细胞移植+神经生长因子组注入1×106个造血干细胞+200 ng神经生长因子,模型对照组给予等量磷酸盐缓冲液。 主要观察指标：采用神经功能缺损评分检测神经功能的改善情况,免疫组化染色观察梗死半球Brdu/CD34、Brdu/Nestin、Brdu/NSE、Brdu/vWF双阳性细胞的分布,TCC染色观察梗死体积的变化。 结果：与移植前比较,移植后1,2周仅细胞移植+神经生长因子组神经功能缺损评分均明显下降(P < 0.05),移植后3,4周各组神经功能缺损评分均明显下降(P < 0.05或0.01),且细胞移植+神经生长因子组下降幅度尤为显著(P < 0.01)。移植后1周,细胞移植+神经生长因子组Brdu/CD34、Brdu/Nestin、Brdu/NSE、Brdu/vWF双阳性细胞数明显多于单纯细胞移植组(P < 0.01);第4周两组未见Brdu/CD34双阳性细胞,Brdu/Nestin较1周时减少,Brdu/NSE、Brdu/vWF双阳性细胞均明显增多(P < 0.05),且细胞移植+神经生长因子组明显多于单纯细胞移植组(P < 0.01);模型对照组始终未见Brdu双阳性细胞。 结论：神经生长因子对外源性移植的造血干细胞在局灶性脑梗死大鼠脑内存活、分化以及神经功能的恢复具有明显促进作用。