1-磷酸鞘氨醇对体外培养的人视网膜色素上皮细胞α-SMA表达的影响

目的研究1-磷酸鞘氨醇对人视网膜色素上皮细胞α-平滑肌肌动蛋白表达的影响。方法对RPE细胞常规培养,取传3～4代生长良好的细胞用于实验,以10~6个/ml接种于24孔培养板中,加入含1-磷酸鞘氨醇无血清培养液,使1-磷酸鞘氨醇终浓度为1、1×10~(-1)、1×10~(-2)、1×10~(-3)、1×10~(-4)μg/ml,加入不含1-磷酸鞘氨醇的无血清培养液为对照组,采用免疫荧光法分析1-磷酸鞘氨醇对α-平滑肌肌动蛋白表达的影响。结果 1、1×10~(-1)、1×10~(-2)μgm 1-磷酸鞘氨醇组中表达α-平滑肌肌动蛋白阳性的细胞与对照组相比差异具有明显统计学意义(P=0.000、0.000、0.000);而1×10~(-3)、1×10~(-4)μg/mI组表达α-平滑肌肌动蛋白阳性细胞与对照组相比差异无明显的统计学意义(P=0.832、0.781)。结论α-平滑肌肌动蛋白主要在RPE细胞的胞浆中表达。随着1-磷酸鞘氨醇浓度的增加,RPE细胞α-平滑肌肌动蛋白的表达增强。     

羊膜对培养的人视网膜色素上皮细胞增殖影响的实验研究

目的　观察羊膜是否对视网膜色素上皮细胞 (Retinalpigmentepithelial ,RPE)的生长有影响 ,探讨羊膜用于治疗增殖性玻璃体视网膜病变 (Proliferativevitreoretinopathy ,PVR)的潜在可能性。方法　运用MTT比色法 ,观察羊膜匀浆在不同浓度 (4 0、80、160 μg ml)及不同作用时相点 (2 4、48、96h)对人RPE增殖的影响。 结果　①在第 2 4小时 ,3个浓度羊膜匀浆均对人RPE增殖起抑制作用 ,而且随浓度增加抑制作用减弱 ,抑制率 (5 0 774%、2 7 3 87%、14 80 2 % )间相差显著 (P <0 0 5 ) ;在第 48、96小时 ,羊膜匀浆在低浓度时 ,对人RPE增殖起抑制作用 ,而在中、高浓度为促增殖作用 ,其中在第 48小时抑制率 (4 494%、-0 944 %、-3 693 % )间相差不显著 (P >0 0 5 ) ,在第 96小时时抑制率 (8 3 88%、-9 42 5 %、-17 65 1% )间相差显著 (P <0 0 5 )。②羊膜匀浆浓度为 40 μg ml ,各时相点对人RPE均为抑制增殖 ,抑制率间相差非常显著 (P <0 0 1) ;在浓度为 80 μg ml、160 μg ml时 ,随着作用时间延长 ,羊膜匀浆对人RPE增殖的作用逐渐由抑制变为促进作用 ,抑制率间相差显著 (P <0 0 5 )。结论　羊膜匀浆在低浓度 ,短时间内对人RPE增殖有抑制作用 ,而在高浓度、长时间则对RPE增殖有促进作用。羊膜匀浆用     

子宫内膜癌鞘氨醇激酶-1与1-磷酸鞘氨醇的表达和意义

目的 探讨鞘氨醇激酶-1（sphingosine kinase 1,SphK1）与1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate,S1P）在子宫内膜癌的表达和意义.方法 收集正常子宫内膜和子宫内膜癌患者血浆,行子宫全切手术的子宫内膜癌和子宫肌瘤旁组织,ELISA法检测血浆或组织匀浆液S1P的表达,Western blot法检测组织SphK1的表达,组织SphK1激酶活性定量检测试剂盒测定SphK1酶活性.结果 和正常对照组相比,子宫内膜癌患者血浆S1P的水平和组织S1P的表达明显增加（P＜0.01）,子宫内膜癌SphK1酶活性约是正常子宫组织的2.6倍.结论 被激活的SphKl/S1P信号通路可能参与子宫内膜癌的发生发展.     

1-磷酸鞘氨醇受体2抑制小鼠血管通透性研究

目的 研究1-磷酸鞘氨醇受体2（S1PR2）对小鼠血管通透性的作用。方法 将野生鼠和S1pr2-/-鼠(S1pr2基因缺乏)气管内滴注脂多糖（LPS）制备急性肺损伤模型（LPS组）,以气管内滴注生理盐水为对照。通过检测肺伊文思蓝色素漏出,异硫氰酸荧光素（FITC）标记的葡聚糖肺血管渗漏,以及肺组织湿质量/干质量比值,观察S1PR2对血管通透性的影响,并通过Miles分析,观察血管内皮细胞生长因子（VEGF）对皮肤血管内皮通透性亢进反应。结果 与生理盐水组比较, LPS注射增加野生鼠和S1pr2-/-鼠伊文思蓝漏出（P 均<0.01）、FITC标记葡聚糖肺血管外漏出（P 均<0.01）和引起肺水肿。LPS组中S1pr2-/-鼠与野生鼠比较,伊文思蓝漏出量、FITC标记葡聚糖肺血管外漏出更多（P 均<0.01）,肺水肿更重（P <0.001）;LPS组野生型和S1pr2-/-鼠均增加VEGF剂量依赖性的伊文思蓝漏出,在50、100 ng的VEGF诱导下,与野生鼠比较,S1pr2-/-鼠伊文思蓝漏出量均较高（P 均<0.01）。结论 S1PR2参与内皮细胞屏障保护,抑制血管通透性。     

苏拉明对培养的人视网膜色素上皮细胞DNA合成的影响

目的 探讨苏拉明(suramin)对体外培养的人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cell,aPE)DNA合成的影响，为防治增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)提供理论依据。方法 将不同浓度的苏拉明加入培养的人RPE细胞，分别于48h、96h后用氚-标脱氧胸苷(tritium—labelled thymidine deoxyri-bose，^3H—TdR)掺入法测定DNA合成抑制率；以300mg／L苏拉明作用于RPE细胞，用流式细胞仪(flowe,cytometry，FCM)分析RPE细胞周期。结果 苏拉明在100～400mg／L范围内对培养的人RPE细胞DNA合成有明显的抑制作用，且具有剂量-效应及时间-效应关系；FCM显示苏拉明将RPE细胞阻抑于G2／M期。结论 苏拉明能抑制RPE细胞DNA合成，可作为防治PVR的药物进一步研究。     

氚-标记胸腺嘧啶核苷掺入法测定转化生长因子β1对视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的：：用氚-标记胸腺嘧啶核苷(3 H-TdR )掺入法观察转化生长因子β1( TGF-β1)对人视网膜色素上皮细胞( retinal pigment epithelium cells,RPE)增殖的影响,探讨TGF-β1和RPE细胞在增殖性玻璃体视网膜病变发病机制中的作用。方法：RPE细胞体外培养,用不同浓度的TGF-β10.1、1.0、5.0、10.0和100.0μg/L对细胞进行处理,3 H-TdR掺入法测定细胞放射性强度。结果：TGF-β10.1、1.0、5.0、10.0μg/L 作用后 RPE 活细胞数增加,细胞3H-TdR 摄入量均较对照组显著增加,TGF-β1100.0μg/L对RPE作用相反,细胞3H-TdR摄入量明显低于对照组(P<0.01)。结论：TGF-β1对人RPE细胞增殖有双相调节性,其不同作用的发挥依赖TGF-β1的浓度,其中TGF-β1促RPE细胞增殖作用是诱导增殖性玻璃体视网膜病变发生的可能机制之一。     

转移生长因子β2对培养的人类视网膜色素上皮细胞DNA合成增殖影响的研究

目的：为研究转移生长因子β2（TGF－β2）对培养的人类视网膜色素上皮细胞DNA合成与增殖的作用。方法：取自愿者贡献的眼球并游离其视网膜色素上皮细胞，用DMEM加10％血清及MEM氨基酸和庆大霉素，进行细胞传代培养。用溶血磷脂酸、转移生长因子β2（TGF－β2）及TGF－β2＋LPA进行视网色素上皮细胞增殖试验，用细胞染色法进行细胞计数，提取视网膜色素上皮细胞DNA，用Spectrophotometer进行DNA定量测定。结果：含有和／或缺乏1％小牛血清的两种LPA（10uM）均明显刺激视网膜色素上细胞增殖，但这种细胞的增殖被2nG/ml的转移生长因子－β2所阻滞。结论：增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）是一种以细胞增殖为主的疾病，参与增殖的主要细胞为视网膜色素上皮细胞，转移生长因子－β2能阻滞体外培养的人类视网膜色素上皮细胞DNA合成与增殖，应用TGF－β2治疗由RPE细胞引起的PVR疾病，仍需进一步深入研究。     

1-磷酸神经鞘氨醇对大鼠骨骼肌成肌细胞分化的影响

【目的】观察1-磷酸神经鞘氨醇(S1P)对大鼠骨骼肌成肌细胞向成熟肌细胞分化?形成肌管的作用,探索定向诱导肌分化的途径及其分子机制?【方法】 分离和培养大鼠骨骼肌成肌细胞,含不同浓度S1P的高糖DMEM培养基培养,收集细胞,在相差显微镜和共焦显微镜下观察形态变化,并通过免疫细胞化学方法分别检测成肌细胞分化的早期特异性标志-肌球蛋白和生肌素表达的改变?使用磷酸神经鞘氨醇激酶(SphK)活性抑制剂DMS和HACPT后观察S1P对骨骼肌成肌细胞的生肌素表达的作用?【结果】 S1P能明显促进骨骼肌成肌细胞细胞形成肌小管,诱导2 ~ 3 d开始有肌管形成,之后肌管越来越多,到6 ~ 7 d达高峰;同对照组相比随S1P浓度增高,细胞核生肌素阳性率逐渐增高(P <0.01);SphK活性抑制剂抑制S1P促进骨骼肌成肌细胞生肌素阳性率的增高(P < 0.01)?【结论】体外S1P可能通过提高SphK活性调节成肌细胞向成熟肌细胞分化?     

复明片对兔视网膜脱离后视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的研究复明片对兔实验性视网膜脱离后视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)增殖的影响。方法用有色家兔96只设正常对照组(A组),制作视网膜脱离模型后分模型组(B组)、西药对照组(C组)、复明片组(D组)。并于造模后7、14、21 d分别取视网膜组织制备细胞悬液,流式细胞仪检测各兔增殖细胞核抗原(PCNA)在视网膜神经上皮层的表达。结果脱离后视网膜神经上皮层PCNA阳性细胞表达均呈上升趋势,7d后开始下降,且复明片组相较其余各组比较均有统计学意义(P<0.05)。结论复明片通过恢复视网膜色素上皮与神经上皮之间的接触,阻止RPE的增殖即PCNA的表达。     

人参皂苷Rg3对培养人视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

目的 研究人参皂苷Rg3(Ginsenoside-Rg3)对体外培养视网膜色素上皮(RPE)细胞增生的直接抑制作用及可能机制。方法 通过活细胞计数法与MTT比色法分别检测不同浓度(10、20、50、80、100、150mg/L)Rg3和Rg3 80mg/L在不同作用时间(6-120h)对RPE细胞增生及代谢的影响。结果 Rg3组细胞增殖受到抑制并出现细胞脱落，Rg3 100mg/L具有最强的抑制效应，其明显抑制效应在6h即出现，96h达高峰。Rg3组A值明显低于对照组，RPE细胞生存率下降。结论 Rg3可能通过抑制钙内流促进钾外流改变细胞膜电位、干扰RPE细胞代谢，对RPE细胞增殖具有剂量依赖和时间依赖方式的抑制作用。     

人参皂甙Rb2对培养人视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

目的：研究人参皂甙Rb2(Ginsenoside-Rb2)对体外培养视网膜色素上皮细胞增生的直接抑制作用及可能机制。方法：通过活细胞计数法与MTT比色法分别检测不同浓度（250、200、120、100、50、10μg/ml）Rb2t Rb2 150μg/ml在不同作用时间（6－120h)对RPE细胞增生及代谢的影响。结果：Rb2组细胞增殖受到抑制并出现细胞脱落，Rb2 200μg/ml具有最强的抑制效应，其明显抑制效应在6h即出现，96h达高峰。Rb2组A值明显低于对照组，RPE细胞生存率下降。结论：Rb2可能通过阻滞钙通道降低细胞内钙浓度、干扰RPE细胞代谢对RPE细胞增殖具有剂量依赖和时间依赖方式的抑制作用。     

人视网膜色素上皮细胞培养方法的改进

目的:建立一种简单有效的人视网膜色素上皮细胞培养的改进方法。方法:先采用机械分离法将晶状体、玻璃体及视网膜神经上皮层剥离干净,去除前眼杯,然后用胰蛋白酶消化后眼杯,后再用机械分离法分离RPE层,将分离下的RPE层分散置入培养瓶中。结果:组织块1d后贴壁,7d后可见有黑色、圆形的RPE细胞缓慢爬出,10d后细胞变成扁平不规则多角形,约13d后细胞基本单层融合长满瓶底,形成典型的鹅卵石样。传代细胞生长活跃5～6d后达融合状态,细胞呈梭形及不规则形。Keratin免疫组化鉴定显示,所获细胞的纯度接近100%。结论:用此改良的方法,可以有效提高RPE细胞培养的数量和纯度。     

血小板源性生长因子对人视网膜色素上皮细胞的作用

目的　观察血小板源性生长因子 (PDGF)对人视网膜色素上皮细胞 (hRPE)增殖和移行能力的影响 .方法　将体外培养的第 46代人视网膜色素上皮细胞分为DMEM组(改良型Eagle培养液 )和含有 2 0mL·L-1小牛血清的DMEM组(2 0 g·L-1DMEM ) ,每组分别加入不同浓度 (0 .1,1,5 ,10 ,5 0和 10 0 μg·L-1)的PDGF ,然后采用MTT比色法观察分析其对hRPE的增殖作用 ;应用hRPE损伤模型 ,计数进入缺损区的细胞 ,定量观察PDGF对hRPE移行的影响 .结果　①增殖作用 :0 .110 0 μg·L-1的PDGF均能促进hRPE的增殖 ,DMEM组 10 μg·L-1时促增殖作用最明显 ,增殖率达15 3% ;2 0 g·L-1DMEM组 5 0 10 0 μg·L-1的增殖率为 174% ,作用最强 .②移行作用 :PDGF能够显著促进hRPE的移行 ,并呈剂量依赖性 ,5 0 10 0 μg·L-1时促移行能力最强 ,DMEM组移行率为 5 10 % ,2 0mL·L-1FBS +DMEM组达 6 40 % .结论　PDGF能够促进hRPE的增殖和移行 ,有血清时可以加强这种作用 ,提示它在PVR的发病过程中可能发挥了重要作用     

人视网膜色素上皮细胞条件培养液对视网膜干细胞生物学特性的影响

目的 观察人胚视网膜色素上皮细胞条件培养液(HRPE-CM)对人胚视网膜干细胞(HRSCs)体外生物学特性的影响.方法 利用HRPE-CM模拟体内环境,分为对照组、表皮生长因子(EGF)+碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)组和HRPE-CM组.体外培养HRSCs,通过细胞计数方法比较不同环境条件对HRSCs体外生物学特性的影响,并进一步鉴定其神经干细胞特性.结果 与对照组比较,HRPE-CM对HRSCs有明显的促增殖作用(P<0.01);与EGF+bFGF组相比较,HRPE-CM的促增殖作用也更为强大(P<0.01).在HRPE-CM中培养的原代和子代HRSCs均表达Nestin,具有自我更新能力和多向分化潜能.结论 HRPE-CM对HRSCs的增殖能力具有明显的促进作用,并且能很好地维持其神经干细胞特性.     

人视网膜色素上皮细胞条件培养液对视网膜干细胞生物学特性的影响

目的观察人胚视网膜色素上皮细胞条件培养液(HRPE-CM)对人胚视网膜干细胞(HRSCs)体外生物学特性的影响。方法利用HRPE-CM模拟体内环境,分为对照组、表皮生长因子(EGF) 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)组和HRPE-CM组。体外培养HRSCs,通过细胞计数方法比较不同环境条件对HRSCs体外生物学特性的影响,并进一步鉴定其神经干细胞特性。结果与对照组比较,HRPE-CM对HRSCs有明显的促增殖作用(P<0.01);与EGF bFGF组相比较,HRPE-CM的促增殖作用也更为强大(P<0.01)。在HRPE-CM中培养的原代和子代HRSCs均表达Nestin,具有自我更新能力和多向分化潜能。结论HRPE-CM对HRSCs的增殖能力具有明显的促进作用,并且能很好地维持其神经干细胞特性。     

人胎视网膜色素上皮细胞的冻存和复苏

目的：冻存和复苏人胎视网膜色素上皮细胞，为视网膜色素上皮移植治疗视网膜色素变性提供组织来源。 方法：取第3代胰酶消化法获取的人胎儿视网膜色素上皮细胞进行冻存，复苏后经台盼蓝染色测定细胞存活率，角蛋白抗体免疫细胞化学染色鉴定细胞。 结果：复苏后的视网膜色素上皮细胞在体外生长良好，抗角蛋白反应阳性，细胞具有较高的存活率［(84.9%±3.2)%］。 结论：冻存和培养RPE细胞为细胞移植提供了一个良好的来源。     

视网膜色素上皮单细胞层的培养

目的：利用微孔滤膜培养小室及双室联合培养系统培养视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞，为视网膜色素上皮细胞转运等功能的研究提供体外模型。方法：将ARPE-19细胞接种到底部为层黏蛋白包被的微孔滤膜的小室（内室）中，并将此小室放到6孔培养板（外室）内进行培养。用吉姆萨染色观察细胞生长情况，并用含有台酚蓝的培养液检测细胞间的紧密连接。结 果：将1.0×10⁵•mL^-1的ARPE-19细胞混悬液1.5 mL接种于内室的层黏连蛋白包被的微孔滤膜上进行培养，大约第5天细胞长满滤膜，经吉姆萨染色，在光学显微镜下确认视网膜色素上皮细胞充分融合，在层黏连蛋白表面形成一整齐的单细胞层，且台酚蓝不能通过该单细胞层。结论：培养在层黏连蛋白包被的微孔滤膜上的视网膜色素上皮细胞，如同体内的视网膜色素上皮细胞一样形成单 细胞层，细胞间形成功能性的紧密连接，可作为视网膜色素上皮细胞转运等功能研究的体外模型。     

PKC信号传导通路对缺氧人视网膜色素上皮细胞表达VEGF的作用

目的 :探讨蛋白激酶C(PKC)信号传导通路对缺氧状态下培养的视网膜色素上皮 (retinalpigmentepithelium ,RPE)细胞表达VEGF的作用 .方法 :在缺氧状态下分别培养人RPE细胞 6 ,1 2和 2 4h ;将不同浓度的PKC激动剂佛波醇 1 2 豆蔻酰 1 3乙酸 (phorbol 1 2 myristate 1 3 acetate,PMA)及PKC抑制剂Chelerythrine分别加入人RPE细胞培养液 ,在缺氧状态下培养 2 4h .用免疫组化方法检测各组RPE细胞中VEGF的表达 ,经计算机图像处理 ,定量分析 .结果 :在缺氧状态下 ,RPE细胞对VEGF的表达较非缺氧组RPE细胞显著增加 (P <0 .0 1 ) ;较对照组 ,PMA可增强缺氧状态下RPE细胞VEGF的表达 (P <0 .0 1 ) ,Chelerythrine则减弱VEGF的表达 (P <0 .0 1 ) .结论 :缺氧诱导VEGF在RPE细胞中的表达 ,其信号传导途径部分是通过PKC通路实现的