人血浆DNA双重实时荧光定量PCR检测法的建立

目的 建立带有内参照的双重实时荧光定量PCR方法检测血浆DNA含量.方法 构建重组质粒DNA作为内参照物,采用共用下游引物的双重实时荧光定量PCR技术同步扩增人看家基因β-actin和重组质粒载体中人工合成DNA序列,定量检测健康成年人血浆DNA含量.结果 本法能在同一个反应管中对目的基因和内参照进行同步扩增,两者的扩增无相互干扰,特异性好;重组质粒DNA的平均扩增效率达90%,β-actin基因的平均扩增效率接近100%;本法批内变异系数（CV）11%,批间CV17%.结论 成功建立含有内参照的双重实时荧光定量PCR方法,可对血浆DNA进行定量检测.     

多重聚合酶链反应法检测质粒介导AmpC酶的优化及应用

目的 建立快速检测质粒介导AmpC酶的分子生物学方法.方法 采用多重聚合酶链反应(PCR)法并优化反应体系,检测21株头孢西丁耐药大肠杆菌质粒型AmpC酶基因型.结果 反应体系中dNTP和引物浓度、循环参数中退火温度对多重PCR的扩增效果有影响;反应体系中缓冲液、Mg2 浓度、反应体积、循环参数中延伸温度、循环次数对多重PCR的扩增效果影响很小;21株头孢西丁耐药大肠杆菌中8株质粒AmpC酶基因型阳性,其中DHA基因型5株,ACC基因型3株.结论 多重PCR技术检测质粒介导AmpC酶效果较好,具有可行性.为临床提供了简单易行、快捷有效、敏感、特异性高的方法.     

Wipe Test在HLA组织配型实验室污染监测及预防管理中的应用

目的建立人类白细胞抗原(HLA)组织配型实验室常规DNA污染监测试验体系,预防和消除可能会干扰检测准确性的PCR产物或基因组DNA的污染。方法设计含多种阴阳性对照和各关键监测点的完整反应链,针对HLA-Ⅰ类和Ⅱ类基因扩增区域内的非多态区进行引物特异性PCR,琼脂糖凝胶电泳测定扩增产物;对被污染监测点进行局部灭活处理后对相应监测点重新采样进行灭活验证;同时采取不定期抽查监测与定期全面监测相结合的方式确保实验过程零污染。结果灭活处理及整改后,所监测HLA基因分型实验过程中的核酸抽提区、PCR加样区、PCR扩增区、下游产物处理区4个区域的主要监测点污染监测结果均合格。结论该研究建立的以Wipe Test为核心的DNA防污染监测实验体系能够有效监测和灭活验证可能会干扰检测准确性的PCR产物或基因组DNA的污染,是HLA组织配型实验室质量控制管理程序的重要组成部分。     

牛血清清蛋白在小鼠骨肉瘤模型PCR基因分型中的应用

摘要：目的：验证在PCR反应体系中加入牛血清清蛋白（BSA）可否提高小鼠骨肉瘤模型floxed Rb1基因杂合子和纯合子的检出率与准确率。 方法：以小鼠骨肉瘤模型子代小鼠基因组DNA为模板,进行Rb1基因的PCR基因分型。对在PCR反应体系中添加适量浓度(0.16 mg/mL)的BSA与不加BSA的PCR基因分型结果相比较。PCR引物序列涵盖Rb1基因外显子19两侧或3′端的LoxP序列。 结果：反应体系中添加BSA后,可成功获得PCR扩增条带：单一650 bp 或247 bp（野生型）、单一700 bp 或295 bp（floxed Rb1基因纯合型）以及650 bp和700 bp（或247 bp 和295 bp）混合条带（floxed Rb1基因杂合型）,而反应体系中未加BSA的则无PCR扩增条带产生。 结论：BSA可显著提高floxed Rb1基因的扩增效率,增加了该基因杂合子和纯合子的检出率并排除了假阴性结果,对于难以扩增的靶基因序列的PCR基因分型具有借鉴意义。     

多重PCR在瘢痕疙瘩Fas基因突变分析中的应用

目的:建立瘢痕疙瘩Fas基因常见突变外显子的多重PCR扩增反应体系,以利进行批量瘢痕疙瘩基因突变的筛选和检测。方法:取正常皮肤、增生瘢痕和瘢痕疙瘩组织DNA样本,根据瘢痕疙瘩Fas基因易发突变的外显子6,8,9之序列,按照多重PCR引物设计原则,建立3对相应引物,先分别找出各外显子的最佳扩增条件,再进行综合分析,最终找到一个理想的多重PCR扩增条件。结果:各外显子单一扩增片段和多重PCR扩增条带均清晰,产量较高,无非特异性扩增,产物长度与理论值一致;DNA测序证实,各扩增产物即各外显子基因片段。结论:成功建立了瘢痕疙瘩Fas基因常发突变外显子的多重PCR扩增体系,与以往单基因分次扩增相比,实现了一次同时扩增3个基因片段,为瘢痕疙瘩基因诊断和进一步相关的分子生物学研究提供了一个经济、快捷的方法,对于瘢痕疙瘩Fas基因的突变研究具有较高的应用价值。     

纳米金辅助不对称PCR扩增幽门螺杆菌23S rRNA基因的优化和建立

目的:建立纳米金辅助不对称PCR方法扩增幽门螺杆菌23S rRNA基因,为建立基因芯片法检测幽门螺杆菌耐药基因提供试验平台.方法:将幽门螺杆菌23S rRNA基因转化至感受态大肠杆菌JM109,小量抽提阳性构建质粒DNA,以质粒DNA为模板,设计引物对23S rRNA基因进行不对称PCR扩增.对PCR条件中引物浓度及浓度比例、纳米金浓度等进行优化.结果:限制性引物与非限制性引物浓度比例为1 ∶ 60,限制性引物与非限制性引物浓度分别为0.04 pmol/L、2.4 pmol/L时可获得理想的单链和双链DNA,纳米金浓度为0.8 nmol/L时非特异性产物最少,PCR的扩增效率最高.结论:通过对PCR扩增条件的优化,确立了扩增幽门螺杆菌23S rRNA基因纳米金辅助不对称PCR方法的最佳条件,为建立基因芯片法检测幽门螺杆菌耐药基因奠定基础.     

多重PCR在瘢痕疙瘩Fas基因突变分析中的应用

目的：建立瘢痕疙瘩Fas基因常见突变外显子的多重PCR扩增反应体系，以利进行批量瘢痕疙瘩基因突变的筛选和检测。方法：取正常皮肤、增生瘢痕和瘢痕疙瘩组织DNA样本，根据瘢痕疙瘩Fas基因易发突变的外显子6，8，9之序列，按照多重PCR引物设计原则，建立3对相应引物，先分别找出各外显子的最佳扩增条件，再进行综合分析，最终找到一个理想的多重PCR扩增条件。结果：各外显子单一扩增片段和多重PCR扩增条带均清晰，产量较高，无非特异性扩增，产物长度与理论值一致；DNA测序证实，各扩增产物即各外显子基因片段。结论：成功建立了瘢痕疙瘩Fas基因常发突变外显子的多重PCR扩增体系，与以往单基因分次扩增相比，实现了一次同时扩增3个基因片段，为瘢痕疙瘩基因诊断和进一步相关的分子生物学研究提供了一个经济、快捷的方法，对于瘢痕疙瘩Fas基因的突变研究具有较高的应用价值。     

建立实时荧光LAMPA法检测肺炎支原体

目的:建立实时荧光环介导等温扩增(LAMP)法检测肺炎支原体。方法:在LAMP体系中添加适量荧光染料SYTO-9,通过实时定量PCR仪监测LAMP反应结果。以肺炎支原体P1基因重组质粒制备一系列浓度标准品,分别使用实时荧光LAMP法和SYBR GreenⅠ染料LAMP法检测,比较2种方法的检出限。肺炎支原体M129标准株菌液以10倍梯度稀释,分别以实时荧光LAMP法和肺炎支原体荧光PCR试剂盒检测,比较2种方法灵敏度。以实时荧光LAMP法检测常见呼吸道感染病原体肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌基因组DNA,评估该方法特异性。采集疑似肺炎支原体感染患儿咽拭子标本,分别以实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测,比较2种方法检出率差异。结果:实时荧光LAMP法可以检出P1基因最低限为103 copies/μL,当基因拷贝数大于104 copies/μL时,反应30 min样本组即可出现明显荧光信号。SYBR GreenⅠ染料LAMP法可以检出P1基因最低限为104 copies/μL,反应需1 h才可获得足够产物用于显色。实时荧光LAMP法灵敏度高于实时定量PCR法100倍,且对常见呼吸道病原体DNA无扩增。实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测疑似肺炎支原体感染咽拭子标本的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论:实时荧光LAMP法可以有效避免因开盖检测造成的气溶胶污染,反应时间短,灵敏度高,适于在基层医院中推广使用。     

优化PCR条件扩增人IL-10 cDNA及其原核表达载体构建

目的：探讨PCR扩增人IL—10基因片段的最佳反应条件并构建人IL—10原核表达载体。方法：运用降落PCR扩增5端GC含量高的人IL—10基因片段，主要对退火温度和热启动等因素进行优化选择；载体和PCR产物经拓扑TA克隆技术连接，常规方法转化、筛选阳性重组质粒。结果：PCR反应的最佳退火温度为68.5℃，此时扩增出的DNA片段大小符合预期设想，并通过茵落PCR和DNA测序得到证实。结论：在上述条件下获得的PCR产物纯度高、非特异性产物少，成功地构建了人IL—10原核表达载体。并提示降落PCR是一种潜在的一步找到最佳扩增条件的方法。     

建立实时荧光LAMP法检测肺炎支原体

目的建立实时荧光环介导等温扩增(LAMP)法检测肺炎支原体。方法在LAMP体系中添加适量荧光染料SYTO-9,通过实时定量PCR仪监测LAMP反应结果。以肺炎支原体P1基因重组质粒制备一系列浓度标准品,分别使用实时荧光LAMP法和SYBR GreenⅠ染料LAMP法检测,比较2种方法的检出限。肺炎支原体M129标准株菌液以10倍梯度稀释,分别以实时荧光LAMP法和肺炎支原体荧光PCR试剂盒检测,比较2种方法灵敏度。以实时荧光LAMP法检测常见呼吸道感染病原体肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌基因组DNA,评估该方法特异性。采集疑似肺炎支原体感染患儿咽拭子标本,分别以实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测,比较2种方法检出率差异。结果实时荧光LAMP法可以检出P1基因最低限为10~3 copies/μL,当基因拷贝数大于10~4 copies/μL时,反应30 min样本组即可出现明显荧光信号。SYBR GreenⅠ染料LAMP法可以检出P1基因最低限为10~4 copies/μL,反应需1 h才可获得足够产物用于显色。实时荧光LAMP法灵敏度高于实时定量PCR法100倍,且对常见呼吸道病原体DNA无扩增。实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测疑似肺炎支原体感染咽拭子标本的阳性率差异无统计学意义(P0.05)。结论实时荧光LAMP法可以有效避免因开盖检测造成的气溶胶污染,反应时间短,灵敏度高,适于在基层医院中推广使用。