硫氧还蛋白融合表达系统表达的小鼠内皮抑素之纯化和生物学活性鉴定

目的:将硫氧还蛋白融合表达系统表达的小鼠内皮抑素(endostatin)进行纯化并对其生物学活性进行测定.方法: 将含有pThioHis-endo重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物为包涵体,将包涵体纯化后通过镍柱亲和层析得到纯化的、可溶性的小鼠内皮抑素,经SDS-PAGE分析鉴定.将纯化的蛋白质通过鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验和内皮细胞抑制实验对纯化的蛋白质进行生物学活性测定.结果:经SDS-PAGE电泳分析获得了高纯度的小鼠内皮抑素重组融合蛋白,纯度可达95%,得率为0.27 g/L.纯化的重组蛋白在体外能抑制鸡胚囊膜血管生成及具有抑制血管内皮细胞增殖的活性,加入重组蛋白内皮抑素5 μg组与10 μg组血管生成抑制率分别为(22.3±2.0)%和(47.1±4.0)%,P<0.05,和对照组经过方差分析,差异都有显著性意义;内皮细胞抑制实验可见不同剂量重组蛋白内皮抑素对内皮细胞的生长具有抑制作用[抑制率分别为(49.6±4.1)%,(53.2±2.3)%,(55.0±3.6)%,(67.1±5.7)%],经过方差分析和相关性分析,具有剂量依赖效应(r＝0.984,P<0.05).结论: 用硫氧还蛋白融合表达系统在大肠杆菌中表达的小鼠内皮抑素重组融合蛋白易纯化并具有高活性.     

用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素的方法研究

目的探索用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素(endostatin)重组蛋白的最佳生产工艺路线.方法用pThioHis-endo重组质粒转化不同的大肠杆菌BL21、JM109、DH5α,经几种不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthio-galactoside,IPTG)诱导表达重组融合蛋白,或诱导表达不同时间后,采用SDS-PAGE分析表达产物;按所优化的条件进行重组内皮抑素的表达、包涵体的提取、洗涤、变性和复性,最后经Ni 柱纯化,再通过SDS-PAGE分析纯化的结果.结果3种大肠杆菌表达效果相差无几,最佳IPTG的浓度0.9 mmol/L,最佳诱导时间为5 h,经Ni 柱纯化后可获得可溶性的重组内皮抑素.结论利用本实验的优化条件可获得高产量、高纯度、可溶性的小鼠内皮抑素重组蛋白.     

硫氧还蛋白系统与中枢神经系统疾病

有关中枢神经系统疾病发病机制的学说很多，自由基学说一直倍受关注。即如果中枢神经系统产生的自由基过多且未能及时清除，将会引起细胞结构的破坏进而功能丧失，最终导致中枢神经系统疾病的发生。广泛存在于各种组织细胞中的硫氧还蛋白(thioredox in，Trx)与疏氧还蛋白还原酶(thioredoxinreductase，TR)和NADPH一起组成     

硫氧还蛋白及硫氧还蛋白相互作用蛋白在结肠息肉癌变中的表达及意义

【摘要】 目的 探讨硫氧还蛋白（thioredoxin,Trx）与硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin interacting protein,TXNIP）在结肠息肉、结肠腺瘤及结肠癌中的表达,分析Trx、TXNIP在结肠息肉癌变中的作用。 方法 收集河北北方学院附属第一医院2019年1月～2019年10月就诊的结肠息肉（结肠息肉组）20例、结肠腺瘤（结肠腺瘤组）40例、结肠癌（结肠癌组）20例以及正常结肠(正常结肠组)20例,通过ELISA法检测血清Trx、TXNIP的含量,采用胰岛素还原法检测血清Trx活性,苏木精-伊红染色（HE）法观察各组织的形态学,应用免疫组织化学法检测组织中Trx、TXNIP的表达,实时荧光定量PCR检测组织中Trx mRNA与TXNIP mRNA的表达水平。 结果 与正常结肠组比较,结肠腺瘤组与结肠癌组患者血清中Trx含量和活性明显升高,结肠息肉组、结肠腺瘤组患者与结肠癌组患者血清中TXNIP含量较正常结肠组明显下降,差异均有统计学意义（P＜0.05）;在结肠腺瘤组和结肠癌组组织中Trx阳性表达率明显高于正常结肠组,而TXNIP阳性表达率明显低于正常结肠组,差异均有统计学意义（P＜0.05）;与正常结肠组比较,结肠息肉组、结肠腺瘤组及结肠癌组组织中Trx mRNA的表达水平均明显上调,TXNIP mRNA的表达水平均明显下调,差异具有统计学意义（P＜0.05）。 结论 Trx在结肠息肉癌变中高表达,而TXNIP表达降低,表明两者都参与结肠癌前病变与癌组织的发生及发展,两者均在结肠息肉癌变过程中起着重要的作用。     

硫氧还蛋白在凋亡途径中的作用机制

硫氧还蛋白(Trx)是体内广泛存在的氧化还原蛋白,其家族中两种重要的硫氧还蛋白:硫氧还蛋白1(thioredoxin1,Trx1)和硫氧还蛋白2(thioredoxin2,Trx2)都含有保守的-Cys-Gly-Pro-Cys-还原序列。由于Trx具有调节细胞生长增殖和抗凋亡的作用,因此Trx在凋亡途径中的作用机制就成为了对抗肿瘤的研究热点。     

硫氧还蛋白与阿尔茨海默病的研究进展

硫氧还蛋白（Thioredoxin,Trx）是一种高度保守且广泛表达的小分子蛋白,具有维持体内细胞内外氧还原平衡、清除自由基、抑制细胞凋亡以及调节转录因子活性等功能,在细胞信号转导中也发挥重要的作用。阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease,AD）发病机理与体内自由基清除能力下降、神经元的丢失与凋亡有紧密的联系,近年来有关Trx与AD的发病机理的研究日渐增多。本文拟对Trx与AD的关系进行综述,理清Trx在AD中的作用,旨在为AD的治疗挖掘新途径。     

人硫氧还蛋白还原酶cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：克隆人硫氧还蛋白还原酶(TR)基因并构建原核表达载体，获得TR蛋白。方法：采用反转录聚合酶链式反应(RT—PCR)技术，从人胚脑组织中扩增出TRcDNA片段，克隆至pGEM—T载体并转化大肠杆菌DH5α，获得重组质粒pGEM—TR；经序列分析证实后，提取pGEM—TR重组体，由双酶切得到目的片段，并插入pET9c原核表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组质粒pET—rhTR。异丙基硫代—β—D—半乳糖苷(IPTG)诱导pET—rhTR在BL21中表达，用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及免疫蛋白印迹(Western blot)分析重组蛋白。结果：克隆的TRcDNA与人胎盘组织TRcDNA同源性为99％；pET—rhTR在大肠杆菌中高效表达，目的蛋白占菌体总蛋白量的36％，其分子质量为55ku。TRcDNA序列被GenBank收录，登录号为AF208018。结论：成功克隆了人脑组织来源的TR基因，该基因在大肠杆菌中得到高表达，为进一步研究其功能奠定基础。     

硫氧还蛋白2的研究进展

硫氧还蛋白2(Trx2)是特异位于线粒体的小分子蛋白,它在抗氧化应激、阻止线粒体介导的细胞死亡、调节某些基因的表达等方面起着关键作用。最新研究表明,Trx2还可促进血管再生、减少高血压病理生理改变,抑制神经退行性变、保护脑细胞,且高表达Trx2的细胞对致癌剂有更强的抵抗力。因此,Trx2与心血管、神经系统、肿瘤等疾病的发病机制密切相关。现综述Trx2的结构、生物学功能和有关机制,以及该蛋白在相关疾病中的基础研究。     

大鼠内皮抑素在大肠杆菌中的融合表达及活性鉴定

目的获得有活性的内皮抑素融合蛋白。方法利用已成功转化的pthiohis-Endo融合表达重组子的大肠杆菌TOP10,在IPTG诱导下表达融合蛋白,亲和层析方法纯化,纯化产物经EK酶酶切后行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western-blot鉴定;MTT法鉴定其对人脐静脉内皮细胞增殖的影响。结果纯化后的内皮抑素的融合蛋白经EK酶酶切行聚丙烯酰胺电泳和Western-blot鉴定与预期相符,并能抑制人脐静脉内皮细胞增殖。结论大鼠内皮抑素基因在大肠杆菌中获得成功表达,表达的融合蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖。     

硫氧还蛋白互作蛋白在乳腺癌中的研究进展

硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)可以与硫氧还蛋白(TRX)直接结合,作为其内源性抑制蛋白,参与调节细胞内氧化应激水平。TXNIP作为一种抑癌蛋白,在人乳腺癌组织细胞中处于低表达状态,并且与细胞增殖、凋亡、患者预后等相关。本文就乳腺癌中TXNIP的结构、调节氧化应激的功能及抑癌机制做一综述,以证明TXNIP作为乳腺癌分子治疗的新靶点具有潜在价值。     

小鼠内皮抑素基因真核表达载体的构建和表达

目的 构建小鼠内皮抑素（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）ｃＤＮＡ的真核表达载体并将其在体外培养的脑胶质瘤细胞内表达。方法 将带有分泌信号的小鼠ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎｃＤＮＡ克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,构建ＣＭＶ启动子控制的载体ｐｃＤＮＡ－ｓＥｎｄｏ,并将上述载体转染体外培养的脑胶质瘤细胞（ＳＨＧ４４）,采用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定其表达,应艇牛微血管内皮细胞抑制实验检测其活性,结果 成功地构建了真核表达     

含小鼠分泌型内皮抑素基因重组质粒的构建及表达

目的:克隆小鼠分泌型内皮抑素(sEndostatin)cDNA,构建pCMV-分泌型内皮抑素和pEgr-分泌型内皮抑素重组质粒,检测重组质粒在B16细胞中的表达. 方法:用RT-PCR方法从鼠肝脏中扩增出内皮抑素cDNA,经测序证实后,连入信号肽,构建pCMV-分泌型内皮抑素和pEgr-分泌型内皮抑素重组质粒,以脂质体转染小鼠B16细胞,用Western blot方法检测B16细胞上清中内皮抑素的表达.结果:测序表明扩增的分泌型内皮抑素序列与报道完全一致, Egr-1启动子和分泌型内皮抑素cDNA正确插入表达载体pcDNA3.1,Western blot证实转染B16细胞上清中有目的蛋白表达.结论:小鼠内皮抑素基因成功地被克隆和表达,为今后检测pEgr-分泌型内皮抑素的辐射诱导表达和恶性肿瘤的基因-放射治疗奠定基础.     

人Api6融合蛋白原核表达系统的构建

目的:本研究拟采用蛋白原核表达的方法,诱导表达人Api6(Apoptosis inhibitor 6)融合蛋白,为进一步研究Api6在凋亡抑制、脂质代谢和肿瘤发生中的作用奠定基础.方法:利用PCR技术扩增人Api6基因,将其克隆至原核表达载体ppSUMO,构建重组质粒ppSUMO-Api6;重组质粒转化原核表达宿主菌E...     

Endostatin基因真核表达载体的构建及活性鉴定

目的：构建endostatin基因的真核表达载体,并将其转染C6脑胶质瘤 细胞,探讨其体外抑制血管内皮细胞生长的活性。方法：利用PCR将大鼠血清蛋白分泌信号连接在endostatin基因的碳末端,构建成真核表达载体pcDNA3-Sendostatin,利用Lipofectamine法将其转染C6脑胶质瘤细胞,采用细胞增殖实验进行endostatin表达蛋白体外活性鉴定。结果：成功构建了endostatin基因真核表达载体,转染该载体的C6脑胶质瘤细胞可分泌表达抑制血管内皮细胞增生的endostatin蛋白。结论：endostatin是一种有效的血管生成抑制剂,可进一步用于在体肿瘤的抗血管生成治疗。     

GST－IL－1融合基因表达的研究

为研究基因表达的影响因素，将人白细胞介素－１（ＩＬ－１）ｃＤＮＡ的不同片段分别重组入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ中ＧＳＴ基因３￣’端，形成ＧＳＴ－ＩＬ－１融合基因，经ＩＰＴＧ诱导后，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测表达情况，结果发现ＧＳＴ与全长８１６ｂｐ完整的ＩＬ－１ｃＤＮＡ的融合基因未见有相应蛋白质的表达，且亦未见ＧＳＴ的表达，而ＧＳＴ与５￣’端缺失１８９ｂｐ的ＩＬ－１ｃＤＮＡ的融合基因则看到有相应蛋白质的表达，表达量占细菌蛋白总量的３０％．表明ＩＬ－１ｃＤＮＡ５￣’端１～１８９ｂｐ的序列影响了整个融合基因的表达，即目的基因中远离翻译起始码ＡＵＧ的下游序列也可显著影响该基因的表达．此结果为基因工程中克隆基因表达调控的研究提供了有益的资料     

Expression of GST-IL-1 fusion gene

ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＳＴ－ＩＬ－１ｆｕｓｉｏｎｇｅｎｅＣｈｅｎＭｅｉｈｏｎｇ（陈梅红）；ＷａｎｇＺｉｌｉｎｇ（王字玲）；ＤｅｎｇＪｉａｎｂｅｉ（邓健蓓）；ＺｈａｏＺｈｏｎｇｌｉａｎｇ（赵忠良）；ＣｈｅｎＮａｎｃｈｕｎ（陈南春）；ＳｕＣｈｅｎｇｚ...     

用谷胱甘肽－S－转移酶融合蛋白系统表达人肿瘤坏死因子

将人肿瘤坏死因子基因插入表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ的谷胱甘肽－Ｓ－转移酶基因下游，转化Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９．挑选正确克隆培养，用异丙基硫代半乳糖苷诱导后，在Ｔａｃ启动子作用下，可表达出一条４３ｋＤ（Ｍｒ４３０００）的融合蛋白，表达量占细菌总蛋白的１６．７％。用粗制凝血酶消化未经纯化的细菌蛋白，取上清可溶性组分进行活性鉴定，表明用此系统每升细菌培养可得肿瘤坏死因子活性５×１０６Ｕ．     

GST-hCAP融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的:构建GST标签的人c-Cbl相关蛋白(GST-hCAP)融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导其表达.方法:从COS-1细胞中提取mRNA,反转录为cDNA.用PCR方法扩增出hCAP基因全长,通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点将其定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-hCAP,并转化E.coli DH5α,通过限制性内切酶酶切电泳和DNA测序鉴定正确后,转入E.coli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷大量诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定.结果:酶切电泳及测序结果证明,原核表达质粒GST-hCAP构建成功,用Western blot方法也证实了GST-hCAP融合蛋白的表达.结论:成功地构建了GST-hCAP原核表达载体,证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化CAP及研究其结构与功能提供了前提基础.