三种组织线粒体对小鼠原代神经元存活及轴突再生的影响

目的:比较研究肝脏、心肌和骨骼肌来源的线粒体对小鼠原代神经元存活及轴突再生的影响。方法:采用差速离心法分别提取C57BL/6小鼠肝脏线粒体、心肌线粒体和骨骼肌线粒体。分离和培养孕14～17 d的C57BL/6胎鼠大脑皮质神经元，培养7 d后进行划痕损伤，然后分别加入等量的三种组织来源线粒体进行共培养。采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位缺口末端标记法(TUNEL)、活细胞碘化丙啶(PI)标记观察神经元死亡。采用Western Blot和免疫细胞化学染色检测神经元中生长相关蛋白43(GAP-43)的表达。采用分光光度计测量线粒体体复合体酶活性和ATP水平。结果:TUNEL染色、PI染色显示：三种线粒体处理后，肝脏线粒体处理组的神经元死亡最少，提示肝脏线粒体的促神经元存活能力最强。肝脏线粒体处理组神经元GAP-43的表达水平最高。进一步分析发现：相同数量的肝脏线粒体产生更高水平的ATP。并且肝脏线粒体可显著促进神经元线粒体呼吸链复合体酶的活性。结论:与心肌线粒体、骨骼肌线粒体相比，肝脏线粒体具有更强大的促神经元存活和促轴突再生的能力，可用于体内线粒体移植修复神经损伤。     

Notch/JNK信号在低氧致大鼠皮层神经元损伤中的作用研究

目的:探讨Notch1/JNK信号通路在缺氧引起的神经元损伤中的作用。方法:原代培养新生SD大鼠皮层神经元,利用低氧条件培养建立缺氧模型。利用CCK-8实验检测在低氧诱导的不同时间,神经元的活性及siRNA干扰后神经元的活性;利用RT-q PCR与Western Blot检测对照组与低氧组神经元中NICD,p-JNK,Caspase-3mRNA与蛋白的表达情况;利用siRNA转染技术转染Notch1 siRNA或JNK siRNA至神经元中后,利用Western Blot检测低氧组与转染组神经元中NICD,p-JNK,Caspase-3蛋白的表达情况。结果:缺氧情况下神经元活性较低,具有时间依赖性;缺氧情况下,神经元的NICD,p-JNK,Caspase-3 mRNA及蛋白的表达均显著升高。抑制神经元中Notch1的活性,可进一步抑制JNK,Caspase-3的表达,改善神经元活性。结论:缺氧导致神经元Notch1信号被激活,Notch信号调节JNK的磷酸化,磷酸化的JNK进一步促进Caspase-3的激活,从而降低神经细胞的活性或促进神经细胞的死亡。     

低氧复合运动对大鼠骨骼肌线粒体含量的影响

 目的：探讨低氧复合运动对线粒体含量的影响及线粒体生物合成和自噬在其中的作用。方法：雄性SD大鼠随机分为常氧对照（NC）组、常氧运动（NT）组、低氧对照（HC）组和低氧复合运动（HT）组。低氧干预为常压低氧帐篷,11.3%氧浓度持续暴露4周。运动干预为跑台训练（5°,15 m/min）,60 min/d,每周5 d,共4周。JC-1荧光探针检测线粒体膜电位;萤光素酶法检测线粒体ATP合成能力;Western blotting检测骨骼肌过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1（PGC-1α）、线粒体转录因子A（Tfam）、Bcl-2/腺病毒E1B 19kD相互作用蛋白3（Bnip3）、苄氯素1（beclin-1）、细胞色素C氧化酶亚基IV（COXIV）和电压依赖性阴离子通道1（VDAC-1）蛋白表达量。结果：HC组与NC组比较,线粒体膜电位、ATP合成能力及COXIV、VDAC-1、PGC-1α和Tfam蛋白表达显著降低（P<005或P<001）,Bnip3和beclin-1蛋白表达显著升高（P<005）。HT组与HC组比较,线粒体膜电位、ATP合成能力及COXIV、VDAC-1、PGC-1α、Tfam、Bnip3和beclin-1蛋白表达均显著升高（P<005或P<001）。结论：慢性低氧暴露提高了线粒体自噬但抑制了线粒体生物合成,导致线粒体含量减少。低氧复合运动促进低氧状态下骨骼肌线粒体自噬,并促进线粒体生物合成,从而提高线粒体含量及功能。     

急、慢性低氧对大鼠脑线粒体蛋白翻译合成的影响

目的:探讨模拟高原低氧对大鼠脑线粒体蛋白合成功能的影响。方法:雄性wistar大鼠随机分为急性低氧组、慢性低氧组和平原对照组。急、慢性低氧组动物分别连续暴露于模拟4000m高原3d和40d, 分离脑线粒体, 用[³H]-亮氨酸掺入法测定线粒体体外翻译活性, [³⁵S]-蛋氨酸掺入并对翻译后产物经SDS-PAGE和放射自显影进行分子量鉴定。结果:急性低氧脑线粒体蛋白翻译活性明显低于对照组60%(P<0.01), 慢性低氧时线粒体翻译活性与对照组无显著差异(P>0.05), 但显著高于急性低氧组(P<0.05).急性与慢性低氧暴露均未发现线粒体蛋白体外翻译产物与平原对照组有质的差异。结论:低氧可影响线粒体DNA编码蛋白合成, 并且与低氧暴露时间有关。     

低氧刺激结缔组织生长因子表达与肾间质纤维化

目的：观察低氧对结缔组织生长因子（CTGF）表达的影响，探讨低氧致肾间质纤维化的机制。方法： 单侧输尿管结扎（UUO）9 d大鼠动物模型，用RT-PCR方法检测肾组织中低氧标记分子-低氧诱导因子（HIF-1α）的mRNA水平，免疫组化方法观察假手术组及模型组肾组织中HIF-1α和CTGF的表达及部位，Western蛋白印迹技术检测肾组织CTGF的蛋白水平。体外实验，正常大鼠肾间质成纤维细胞（NRK-49F）分别置于低氧（1%O2）和正常氧条件下培养6 h，应用RT-PCR和Western蛋白印迹检测CTGF mRNA和蛋白表达水平。结果： 对照组肾组织未能检测到HIF-1α mRNA和HIF-1α蛋白表达；模型组肾组织有高水平HIF-1α mRNA，并出现HIF-1α蛋白表达，主要分布在小管-间质细胞；CTGF蛋白与HIF-1α蛋白表达部位及程度一致；低氧（1% O2）培养刺激NRK-49F细胞表达CTGF mRNA和蛋白。结论： 低氧刺激的CTGF的表达增加与肾间质纤维化的发生有关。     

慢性低氧大鼠骨骼肌线粒体的蛋白质组学研究

目的： 采用蛋白质组学方法研究慢性低氧大鼠线粒体蛋白表达变化并讨论其病理生理学意义。方法： Wistar大鼠随机分为2组：慢性低氧组和对照组。动物麻醉后取双侧腓肠肌标本，分离纯化线粒体蛋白进行二维电泳和ImageMaster分析，对差异蛋白质用MALDI-TOF-MS质谱仪进行肽指纹图谱测定。结果： 建立了大鼠腓肠肌线粒体蛋白质二维凝胶图像；与对照组相比，慢性低氧组大鼠线粒体350-450个蛋白点中共有35个蛋白表达显著改变，其中27个表达下调，8个表达上调；并对低氧相关的线粒体蛋白进行了鉴定。结论： 慢性低氧可诱导低氧相关线粒体蛋白表达改变，其作用可能与线粒体氧化磷酸化、物质转运和脂代谢有关。     

MPTP对小鼠中脑α-突触核蛋白线粒体表达和线粒体形态改变的影响

目的:观察MPTP对中脑黑质神经元线粒体表达α-突触核蛋白及线粒体形态改变的影响。方法:运用腹腔注射MPTP诱导C57/BL小鼠中脑黑质神经元损伤,以生理盐水腹腔注射小鼠作为对照组。运用线粒体纯化结合Western Blot分析线粒体α-突触核蛋白的水平,运用免疫组织化学标记结合激光共聚焦方法观察线粒体结构的改变。运用MPP+干预原代培养的多巴胺能神经元,观察线粒体形态的改变。结果:MPTP可以诱导小鼠中脑线粒体α-突触核蛋白的水平升高,并导致线粒体出现碎片化,碎片化的线粒体结构与α-突触核蛋白共定位。运用MPP+处理原代培养的中脑腹侧神经元,发现MPP+可以选择性地诱导多巴胺能神经元的线粒体碎片化。定量研究显示:多巴胺能神经元经MPP+处理后,线粒体的长度显著降低(P0.01)。结论:MPTP可以在体诱导多巴胺能神经元的线粒体碎片化,线粒体α-突触核蛋白水平的升高可能与其碎片化密切相关。     

背侧抑制性轴突导向蛋白对鸡胚后脑内23C10阳性神经元轴突投射的影响

目的:初步探讨背侧抑制性轴突导向蛋白即draxin对鸡胚后脑23C10阳性神经元轴突投射过程中的调控作用。方法:对HH13-14发育阶段的正常鸡胚后脑内进行跨膜型和分泌型draxin质粒转染,通过免疫组织化学染色方法,观察HH25-26发育阶段鸡胚23C10阳性神经元轴突的投射情况;应用活组织离体培养方法,检测draxin对鸡胚后脑神经元轴突生长的影响。结果:跨膜型draxin过表达后,有较多23C10阳性神经元的轴突异常投射到同侧后脑背侧部;分泌型draxin过表达后,有少部分23C10阳性神经元的轴突异常投射到同侧后脑背侧部;正常鸡胚和空白质粒过表达对照组均未观察到异常投射的神经元轴突。鸡胚后脑活组织离体培养中,draxin显著抑制体外培养组织内树突的生长,而对照组可见体外培养的组织内有大量树突形成。结论:draxin对鸡胚后脑内23C10阳性神经元的轴突投射具有抑制性导向作用。     

低氧培养小鼠肝细胞膜蛋白的蛋白质组学研究

目的: 采用蛋白质组学方法研究低氧条件下培养小鼠肝细胞膜蛋白表达的变化情况并探讨其病理生理学意义。方法: 直接消化法分离C57BL/6小鼠肝细胞,于低氧条件下(5% CO₂, 4.5 mg/L O₂)培养8 h后提取膜蛋白,然后采用双向电泳法分离差异表达的蛋白,凝胶银染后切取差异蛋白点进行MALDI-TOF 质谱检测,对获取的数据采用Mascot软件在NCBInr数据库内检索,并采用Western blottng方法验证差异蛋白的表达。结果: 发现低氧组小鼠肝细胞膜蛋白图谱中有28个蛋白点表达量与对照组有显著差异(P<0.05),根据数据库检索结果,鉴定了低氧时低表达的膜蛋白9个和低氧时高表达的膜蛋白7个。Western blotting验证结果与蛋白质组学分析一致。结论: 低氧时,抑素、细胞色素b-c1复合体亚单位1和血红素结合蛋白p22HBP可能在细胞感受外界环境的氧变化及随后的细胞内低氧信号传递的过程中起到了非常重要的作用。     

低氧预适应对小鼠海马神经元中TSC1表达的影响

目的:在体视显微镜下分割ICR小鼠海马CA1区和CA3区,研究结节性硬化症因子1(TSC1)在小鼠海马低氧中的神经保护作用。方法:ICR小鼠分为对照组(control)、低氧对照组(hypoxia)及低氧预适应组(HPC),在体视显微镜下观察海马形态并分割CA1区和CA3区;采用real time RT-PCR和Western Blot的方法分别检测小鼠海马组织TSC1 mRNA和蛋白的表达;采用免疫荧光检测小鼠海马组织TSC1荧光强度。结果:大脑冠状切片清晰显示出海马CA1区、CA3区和DG区;CA1区TSC1 mRNA在低氧组降低而在低氧预适应组增高;Western Blot和组织免疫荧光显示:与对照组相比,低氧预适应组CA1区TSC1表达增加;而CA3区TSC1在低氧组和低氧预适应组均增加。结论:TSC1的差异性表达可能提示TSC1可能参与了低氧预适应对低氧敏感的CA1区神经细胞的保护。     

氯化钴对小鼠海马神经元细胞缺氧损伤的影响

目的:研究氯化钴(CoCl_2)对小鼠海马神经元细胞系HT22细胞缺氧损伤的影响。方法:实验分为3组,分别为低浓度氯化钴组(CoCl_2-L)、中浓度氯化钴组(CoCl_2-M)和高浓度氯化钴组(CoCl_2-H)。利用不同浓度CoCl_2处理HT22细胞建立细胞缺氧损伤模型,通过HE染色观察HT22细胞轴突损伤情况,CCK-8法检测HT22细胞体外增殖活性,Western Blot检测HT22细胞中低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和tau蛋白的表达情况。结果:HE染色显示CoCl_2可致HT22细胞轴突断裂,CCK8检测显示CoCl_2对HT22细胞的增殖有明显抑制作用。Western Blot结果显示CoCl_2-H组细胞中HIF-1α表达显著上调,tau蛋白表达显著降低。结论:CoCl_2可致轴突损伤,并且上调HT22细胞的HIF-1α表达、降低tau的表达。     

Wnt/β-Catenin对低氧诱导绿色荧光蛋白小鼠神经干细胞体外增殖的影响

目的:体外观察低氧对绿色荧光蛋白(GFP)小鼠神经干细胞(NSCs)增殖的影响,并探讨Wnt/β-catenin通路在此过程中的作用。方法:经低氧(3±2)%O_2和常氧205O_2培养GFP小鼠海马组织NSCs,通过NSCs克隆形成率检测、BrdU掺入法和四唑盐比色法(MTT)法检测细胞增殖情况;脂质体介导法将NSCs转染β-catenin,通过免疫细胞化学染色、Western印迹法检测β-catenin表达情况,MTT法检测转染β-catenin后低氧对NSCs增殖的影响。结果:低氧组细胞克隆球形成率、BrdU阳性细胞数量、NSCs增殖活性、NSCs内β-catenin表达均显著高于常氧组;转染β- catenin的NSCs经低氧培养后,NSCs增殖活性明显高于未转染组。结论:体外低氧培养能促进NSCs增殖和NSCs内β-catenin表达;增加NSCs中β-catenin表达能促进低氧培养下NSCs的增殖。表明Wnt/β-catenin通路具有促进低氧诱导NSCs增殖的作用。     

原代培养海马神经元Drebrin和Synaptophysin的表达与动态变化

目的:观察原代海马神经元不同时期树突棘的变化以及树突棘蛋白Drebrin和突触囊泡膜蛋白SYN的表达水平。方法:光镜观察原代培养7、14和20 d的海马神经元的形态改变。应用免疫荧光对Drebrin和SYN进行染色,观察树突棘形态和数量的改变。进一步应用Western Blot检测Drebrin和SYN蛋白的表达变化。结果:培养7 d的海马神经元,未见树突棘结构,SYN斑点状阳性产物较少。随着海马神经元培养时间的加长,突起数量逐渐增加,14 d和20 d的树突棘数量和SYN阳性产物均显著增加。Drebrin和SYN蛋白表达水平也随培养时间的加长而显著增加。结论:原代培养的海马神经元在14 d已有树突棘形成,20 d显示出成熟树突棘的形态和数量。Drebrin和SYN的蛋白表达水平反映了树突棘和突触的形成和功能状态。     

低氧对大鼠大脑皮层神经干细胞增殖和分化的影响

目的:观察和分析不同低氧浓度对大鼠大脑皮层神经干细胞(neural stem cells,NSC S)增殖和分化的影响。方法:在1%O2、4%O2和常氧环境(20%O2)下培养新生SD大鼠神经干细胞,对神经球计数并测量其直径,分析不同低氧对神经干细胞增殖效率和增殖速度的影响;分化48 h后行β微管蛋白Ⅲ(β-tubulin III)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫细胞荧光染色,对神经元和星形胶质细胞进行计数并分别计算各占的比例。结果:(1)低氧对神经干细胞增殖效率和增殖速度的影响:1%低氧组神经球数量明显低于常氧对照组,具有显著性差异(P<0.05);4%低氧组神经球数量高于对照组,具有显著性差异(P<0.05)。在24 h、36 h和48 h,1%低氧组神经球的直径都小于对照组,在24 h和36 h时具有显著性差异(P<0.05),在48 h具有非常显著性差异(P<0.01);在24 h、36 h和48 h,4%低氧组神经球的直径都大于对照组,在36 h时具有显著性差异(P<0.05),在48 h具有非常显著性差异(P<0.01)。(2)1%低氧组神经元的比例(0.614±0.056)显著高于其对照组(0.471±0.067)(P<0.01);而1%低氧组星形胶质细胞的比例(0.241±0.051)低于其对照组(0.322±0.067)(P<0.05)。4%低氧组神经元的比例(0.625±0.072)显著高于其对照组(0.513±0.032)(P<0.05);而4%低氧组星形胶质细胞的比例(0.237±0.053)显著低于其对照组(0.285±0.042)(P<0.05)。结论:和常氧对照组相比,4%O2促进大鼠大脑皮层神经干细胞的增殖,而1%O2抑制了神经干细胞的增殖;1%O2和4%O2都促进神经干细胞向神经元方向分化,同时抑制向星形胶质细胞分化,1%O2的这种作用更为显著。     

慢性寒冷暴露与线粒体数量改变

目的建立慢性寒冷暴露模型,观察冷应激对线粒体数量、形态学调控蛋白及生物合成的影响并对其机制进行初步探讨。方法选取8周龄健康雄性C57BL/6J小鼠40只,随机分为对照组和寒冷组,每组各20只。寒冷组于-4~0℃环境中饲养4周建立慢性寒冷暴露模型。采用Mito Tracker在体标记小脑皮质颗粒细胞线粒体的方法统计线粒体的数量,同时应用免疫荧光染色法和Western blotting技术,检测线粒体分裂、融合蛋白及转录辅激活因子过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α(PGC-1α)的表达情况。结果与对照组相比,寒冷组线粒体数量增多(P0.01),线粒体分裂、融合蛋白及转录辅激活因子PGC-1α表达均显著增多(P0.01)。结论慢性寒冷暴露可能通过诱导PGC-1α的高表达增强线粒体生物合成,增加线粒体数量;活化的PGC-1α协同冷应激促进线粒体形态学调控蛋白表达,构建新的分裂和融合的动态平衡,为机体适应低温环境提供高效率的产能机制。     

白藜芦醇缓解低氧/复氧诱导的TCMK1细胞线粒体自噬

目的 研究白藜芦醇(Res)对低氧/复氧(H/R)导致小鼠肾小管上皮细胞系TCMK1内线粒体功能及线粒体自噬的影响。方法 体外建立H/R细胞模型,经Res或(和)线粒体自噬抑制剂1 (Mdivi-1)预处理TMCK1细胞2 h,采用CCK8法检测TCMK1细胞存活率;试剂盒法检测钙离子超负荷情况;流式细胞测量术测定线粒体膜电位(MMP)变化和活性氧(ROS)含量;Western blot检测线粒体融合蛋白(OPA)、分裂蛋白(DRP)以及凋亡相关蛋白cleaved caspase-3,Bax, Bcl2表达;免疫荧光检测线粒体外膜转位酶(TOMM20)和自噬溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)共定位情况。结果 与对照组相比,H/R组TCMK1细胞存活率显著减低(P<0.05),细胞内钙离子、ROS及MMP含量显著减低(P<0.05),OPA表达显著减低(P<0.05),同时DRP表达显著增高(P<0.05),线粒体与LAMP2共定位的细胞数目显著减少;与H/R组相比,10μmol/L Res可以显著增加TMCK1细胞的存活率(P<0.05),抑制细胞内ROS的...     

大鼠肌源性干细胞分化为神经样细胞过程中Hes1蛋白的表达差异

目的:研究Hes1蛋白在大鼠肌源性干细胞(MDSCs)体外诱导分化为神经样细胞过程中的表达差异。方法:大鼠乳鼠骨骼肌消化后体外培养增殖,第5代传代后细胞分为两组:对照组完全培养基培养,实验组加入诱导剂培养。6d后观察两组细胞的形态变化,并进行神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)免疫细胞化学鉴定。然后通过免疫荧光和Western Blot技术观察Hes1蛋白的表达差异。结果:实验组细胞呈NSE染色阳性,对照组基本不表达;免疫荧光和Western Blot结果显示,与对照组比较,实验组Hes1蛋白表达较强(P0.05)。结论:在体外,大鼠肌源性干细胞分化为神经样细胞过程中Hes1蛋白表达降低。     

CREB-shRNA对氧糖剥夺/复氧皮层神经元线粒体形态和凋亡的影响

目的:探讨沉默CREB基因对氧糖剥夺/复氧神经元线粒体形态及细胞凋亡的影响。方法:3条靶向CREB基因的shRNA片段插入慢病毒载体pLenti Lox3.7(PLL),与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞包装病毒颗粒后感染原代皮层神经元,Western blot检测CREB蛋白的沉默情况;分别用Mito Tracker red、TUNEL和Western blot实验检测氧糖剥夺/复氧诱导CREB基因沉默后神经元的线粒体形态、细胞凋亡和Bcl-2、Bax的表达情况。结果:pLL-CREB-shRNA1为最有效的shRNA,其抑制皮层神经元CREB基因表达率高达80%。CREB基因沉默促进氧糖剥夺/复氧诱导的皮层神经元线粒体向点状、片段化形态改变,同时降低Bcl-2表达、促进Bax的表达并加重细胞凋亡(P0.05)。结论:CREB-shRNA重组慢病毒载体可特异性抑制神经元CREB基因的表达,CREB基因沉默加重氧糖剥夺/复氧诱导的皮层神经元线粒体形态改变,促进细胞凋亡。     

GABA能中间神经元在运输应激大鼠躯体感觉皮质的分布

目的:探讨运输应激对大鼠躯体感觉皮质γ-氨基丁酸(GABA)能中间神经元分布的影响。方法:采用摇床加束缚建立大鼠运输应激模型，将24只SD雄性大鼠随机分为对照组(Control)、运输应激1 d组(TS1d)、运输应激3 d组(TS3d)、运输应激7 d组(TS7d)。应用尼氏染色、免疫组织化学染色法观察运输应激状态下大鼠躯体感觉皮质GABA能不同亚型中间神经元的表达及分布。结果:在躯体感觉皮质，运输应激之后小清蛋白(PV)阳性神经元、生长抑素(SOM)阳性神经元、钙视网膜蛋白(CR)阳性神经元数量显著减少，在TS7d时下降最明显；PV阳性神经元数量在第Ⅱ～Ⅳ层显著减少；SOM阳性神经元数量在第Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ层显著减少；CR阳性神经元数量在第Ⅰ～Ⅵ层显著减少。结论:运输应激后，大鼠躯体感觉皮质GABA能中间神经元显著减少，其中PV和CR这两种钙结合蛋白类中间神经元数量下降最明显，提示钙结合蛋白在调节应激方面起关键作用。     

瞬时感受器电位阳离子通道V2活动促进损伤轴突再生的体外研究

目的:在体外探讨瞬时感受器电位阳离子通道V2(TRPV2)的活动对损伤神经元轴突再生的作用。方法:原代培养小鼠胚胎背根节神经元,制备划伤模型。用全细胞膜片钳记录损伤神经元的自发放电活动。实时定量PCR和免疫细胞化学观察神经元损伤后TRPV2的表达。免疫细胞化学法观察TRPV2的激动剂Cannabidiol及siRNA对体外神经元轴突生长的作用。结果:划伤后,神经元自发性放电增加;神经元突起的TRPV2表达增加。10μmol/L TRPV2激动剂Cannabidiol可显著促进神经元存活和突起生长。针对TRPV2的siRNA可显著抑制突起生长。结论:在体外,神经元损伤可诱导TRPV2表达升高,后者参与损伤神经元的轴突再生。