BMP-2通路对病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化的影响

目的 探讨骨形态发生蛋白2(BMP-2)通路对病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化的影响。方法 选取8周龄SD大鼠1只,培养其骨髓间充质干细胞(BMSCs)并进行传代,采用携带BMP-2的慢病毒感染第3代BMSCs,进行骨向诱导。将BMSCs分为Lenti-BMP-2感染组(研究组),空慢病毒载体感染组(对照组)及未感染组(空白组)。通过碱性磷酸酶(ALP)染色检测ALP表达及钙沉积情况。使用Western Blot检测成骨细胞定向分化及细胞黏附能力,同时检测桥蛋白(OPN),胶原蛋白I(Col-I),骨钙素(OCN)表达水平。使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测三组患者smad转录水平。结果 免疫荧光检测及RT-PCR检测显示,BMP-2可成功感染骨髓间充质干细胞,研究组BMP-2高于对照组及空白组,IL-11水平低于其余两组(P<0.05)。染色后发现ALP、钙沉积明显增多,细胞黏附能力增强,且研究组OPN、OCN、Col-I表达水平较对照组及空白组更高(P<0.05)。研究组Smad转录水平高于对照组和空白组(P<0.05)。结论 BMP-2通路能促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞的定向分化,增强细胞黏附能力,同时能增强碱性磷酸酶、钙沉积及OPN、OCN、Col-I等相关成骨分化因子的表达,与机体感染应答亦有一定关系。     

大鼠脂肪和骨髓来源间充质干细胞成骨分化比较的体外研究

目的对骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞（AMscs）成骨能力进行比较。方法采用钙钴法染色、四环素荧光标记、Ⅰ型胶原染色、茜素红染色、碱性磷酸酶测定，比较脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞成骨能力。结果两种细胞诱导3周后，茜素红染色出现淡红色钙结节；四环素荧光染色出现明亮黄色荧光钙结节。改良钙钴法染色，细胞胞浆中出现黑色颗粒。结论（1）AMSCs向成骨诱导后，可表达Ⅰ型胶原、ALP，并出现钙结节。（2）AMSCs经过诱导后，可向成骨细胞方向分化。     

人骨髓间充质干细胞诱导成骨分化

目的探讨人骨髓间充质干细胞(hMSCs)在体外诱导培养分化为成骨细胞的方法,并研究其生物学特性。方法采用成年人hMSCs传代培养2～3代,经条件培养液诱导培养后,进行形态学观察及MTT实验,RT-PCR分析,蛋白质印迹实验,茜素红染色方法分析细胞矿化作用,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,骨钙素(osteocalcin,OCN)、RUNX2和BMPR2的检测。结果 hMSCs细胞,在诱导培养条件下,细胞碱性磷酸酶ALP活性明显增高,并出现了矿化结节。经过体外成骨诱导的hMSCs表现出增殖、聚集、结节和矿化期的阶段性形态特征。在矿化期骨钙素mRNA OCN表达升高,RUNX2和BMPR2蛋白表达增高。结论 hMSCs易于体外分离培养及扩增,体外成骨定向诱导的hMSCs具有典型的成骨细胞的形态和功能性特征,可以定向分化为成骨细胞。     

白藜芦醇在ST2细胞增殖及成骨分化过程中的作用研究

目的探讨白藜芦醇(resveratrol,RES)对ST2细胞(小鼠骨髓间充质干细胞)增殖及成骨分化的作用,以期为颞下颌关节骨关节炎的治疗提供思路。方法对第3代ST2细胞分别用0、5、10、15和20μmol/L的RES培养,48 h后采用MTT检测细胞的增殖,采用Real time RT-PCR和Western blot检测成骨特异性蛋白Runx2、Osterix的表达。结果不同浓度RES对ST2细胞无显著的促增殖作用,但RES能增强ST2细胞的成骨分化能力,且具有剂量依赖性。结论 RES可促进ST2细胞的成骨分化,可能为颞下颌关节骨关节炎的治疗提供新的思路。     

人骨髓间充质干细胞向肝系细胞分化的实验研究

目的探讨肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)诱导人骨髓间充质干细胞在体外向肝系细胞分化的可能性。方法人骨髓间充质干细胞来自成人骨髓,采用密度梯度离心法分离和反复贴壁法纯化。为有效地促进其向肝细胞分化,本实验使用了HGF和bFGF联合诱导的方法,于0、7、14、21、28d采用细胞免疫荧光法检测肝细胞表面标志甲胎蛋白(alpha_fetoprotein,AFP),细胞角蛋白(cytokeratin 18,CK_18)和细胞角蛋白(cytokeratin 19,CK_19),同时采用Periodic Acid_Schiff(PAS)染色检测诱导细胞糖原合成及贮存功能,并留取不同时段的培养上清液,用放射免疫荧光法(radioimmunoassay,RIA)法检测AFP的分泌量。结果在诱导14d后可观察到诱导细胞变成短梭形和多角形,随诱导时间延长多角形细胞增多,并可形成肝细胞样细胞集落。第14天时AFP,CK_18表达阳性,第21天诱导细胞糖原染色阳性,第28天CK_19表达阳性。培养上清液中14d时,检测到AFP的分泌,浓度为0.1ng/ml;17d时分泌量最高,为0.4ng/ml;21d时下降至0.3ng/ml。结论HGF和bFGF能够诱导人骨髓间充质干细胞在体外分化为肝细胞,这将为肝脏疾病的细胞替代治疗提供新的细胞来源。     

辛伐他汀促大鼠BMSCs成骨分化作用机制的研究

[目的]研究辛伐他汀(aimvastatin,SIM)促进大鼠骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)向成骨细胞分化的作用机制.[方法]取4周雌性SD大鼠双侧股骨、胫骨骨髓细胞进行体外成骨诱导培养,并干第一次传代后(d 8)加入浓度为10-7mol/L SIM(给药组,SIM组)或等量溶剂培养(对照组,N组),d 16行碱性磷酸酶(ALP)染色,d 28行von Kossa染色观察细胞外基质矿化,并采用realtime RT-PCR法子上述两个时间点检测b-catenin、BMP-2、Smad1、ALP、OCN、mRNA的表达.[结果]①辛伐他汀可促进成骨诱导分化大鼠BMSCs的ALP表达及细胞外基质的矿化能力.②mRNA表达水平:d 16 SIM组ALP的表达显著高于N组;d 28 SIM组BMP-2、Smad1、OCN表达水平均明显高于N组,b-catenin的表达显著低于N组(P<0.05).[结论]辛伐他汀可促进大鼠BMSCs向成骨细胞分化,其作用机制可能与调节TGFβ/BMP、WNT信号途径相关基因的表达水平有关.     

大黄素和rhTGF-β1联合诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

目的 探讨不同的方法对人骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化的影响.方法 采用不同方法诱导第三代人骨髓MSCs向成骨细胞分化,对照组：采用基础诱导培养液：地塞米松（10^-8 mol/L）、β-甘油磷酸钠（10 mmol/L）、L-抗坏血酸（50 μg/L）;大黄素组：基础诱导培养＋大黄素（10^-6 mol/L）;大黄素rhTGF-β1组：基础诱导培养液＋大黄素（10^-6 mol/L）＋重组人转化生长因子-β1（recombinant human transforming growth factor-beta1,rhTGF-β1）5 ng/ml.结果 大黄素和rhTGF-β1对人骨髓MSCs增殖的影响：对照组和大黄素组与大黄素＋rhTGF-β1组比较均具有显著差异（P〈0.05）.大黄素和rhTGF-β1对人骨髓MSCs分化的影响：对照组、大黄素组与大黄素＋rhTGF-β1组比较均具有显著差异（P〈0.01）.结论 基础诱导培养液加rhTGF-β1 5 ng/ml和大黄素（10-6 mol/L是理想的具有临床实用价值的成人骨髓MSC体外诱导为成骨细胞的培养体系.     

骨髓间充质干细胞体外分化过程中细胞周期蛋白的表达变化

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外定向分化为多巴胺(DA)能神经元过程中细胞周期相关蛋白的表达变化。方法:体外分离、扩增和鉴定大鼠骨髓MSCs。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预诱导24 h后,用1μmol/L全反式维甲酸(ATRA)和50 ng/ml GDNF联合诱导6 d,检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、酪氨酸羟化酶(TH)、增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK2)、细胞周期蛋白(Cyclin)B1的表达。结果:诱导后大鼠骨髓MSCs能分化为具有典型神经元形态的细胞,大鼠MSCs经诱导后PCNA、CDK2、Cyclin B1的表达均较对照组明显减弱,Bcl-2表达与对照组无明显差别。结论:骨髓间充质干细胞体外开始分化后细胞增殖力下降。     

绿色荧光蛋白报告基因转染示踪体内骨髓间充质干细胞的分化

目的用绿色荧光蛋白(GFP)标记技术,观察组织工程化骨中种子细胞的变化与转归。方法用腺病毒载体Adeno-XTM将GFP基因转染新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),成骨诱导培养3周后将其接种于磷酸钙/纤维蛋白胶复合支架材料,构建成组织工程化骨,回植于供体兔皮下。术后4周,激光共聚焦显微镜下示踪观察GFP,测定碱性磷酸酶(ALP)活性,免疫组化检测Ⅰ型胶原、骨钙素(OCN)和HE染色观察组织结构。结果4周后,大体可见组织工程化新骨形成;组织学显示新生骨围绕材料孔隙生成,磷酸钙/纤维蛋白胶复合材料部分降解;ALP活性明显增高;Ⅰ型胶原、OCN免疫组化染色阳性;新生组织内见GFP标记细胞。结论组织工程化骨组织结构与松质骨小梁类似;新生组织表达GFP,证实组织工程化骨组织的形成来源于接种细胞。     

与盆底韧带成纤维细胞间接共培养对大鼠骨髓间充质干细胞弹性蛋白、LOX及Fibulin-5mRNA表达的影响

目的:研究与盆底韧带成纤维细胞间接共培养对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化的影响,探索在体外条件下诱导BMSCs向韧带成纤维细胞分化微环境的创建并检测诱导分化细胞内弹性蛋白、LOX、Fibulin-5的表达。方法:选择7天SD大鼠,利用密度梯度离心法体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞并对其进行鉴定;取大鼠盆底韧带组织,自行分离传代,获得大鼠盆底韧带成纤维细胞;取纯化的第四代盆底韧带成纤维细胞与纯化培养后的第四代骨髓间充质干细胞间接共培养;实时定量RT-PCR检测弹性蛋白、LOX及Fibulin-5在不同共培养天数BMSCs中mRNA的表达情况。结果:与相应天数阴性对照组相比,3天共培养组弹性蛋白、LOX、Fbulin-5 mRNA的表达量增加,但均无显著变化(P>0.05),6、12天共培养组mRNA的表达量均显著增高(P<0.05);与3天对照组相比,6天对照组和12天对照组的表达量均无显著变化(P>0.05);与3天共培养组相比,6天共培养组的表达量增高,但差异无统计学意义(P>0.05),12天共培养组的表达量均有显著增高(P<0.05)。结论:与盆底韧带成纤维细胞间接共培养可以促进BMSCs弹性蛋白、LOX、Fbulin-5mRNA的表达,这一结果为BMSCs作为韧带组织工程的种子细胞在体外诱导分化条件的探索提供了一条新的研究思路。     

脂肪干细胞在骨组织工程中的应用研究

脂肪干细胞由于具有与骨髓间充质干细胞类似的自我更新能力与多向分化潜能,成为骨组织工程的种子细胞。本文主要介绍脂肪干细胞的生物学特性、成骨分化潜能以及在骨组织工程领域中的研究进展。     

辛伐他汀对人骨髓基质细胞成骨、成脂分化的作用及其机制

[目的]研究辛伐他汀对体外培养的成人骨髓基质细胞成骨分化和成脂分化的影响,并探讨其作用机制。[方法]分离健康成人骨髓基质细胞进行培养,传代后骨分化诱导组和脂肪分化诱导组分别添加10-7mol/L的辛伐他汀,同时进行空白对照。实时荧光定量PCR检测转录因子Cbfa1在成骨细胞中的分化,PPARγ2和LPL在脂肪细胞分化过程中的表达;碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒检测成骨细胞ALP比活性;流式细胞仪、油红O(oilredO)染色检测细胞成脂分化能力。[结果]骨分化诱导组Cbfa1表达(P﹤0.01)、ALP比活性(P﹤0.05)均高于对照组,脂肪分化诱导组PPARγ2(P﹤0.01)、LPL(P﹤0.05)表达均低于对照组;流式细胞仪脂肪细胞计数及脂肪细胞形成脂滴能力实验组均低于对照组。[结论]10-7mol/L辛伐他汀能促进Cbfa1的表达,增强成骨细胞ALP比活性和细胞外基质矿化;抑制PPARγ2、LPL的表达及脂肪细胞分化。     

从成骨分化的角度探讨富血小板血浆在膝骨关节炎中的应用价值

目的观察富血小板血浆(PRP)对膝骨关节炎(KOA)患者膝关节功能及滑膜液成骨分化标志物水平的影响。方法将89例KOA患者随机分为2组,对照组44例关节腔注射透明质酸,观察组45例同时注射透明质酸和自体PRP,治疗10周。对比临床疗效与治疗前后的膝关节功能;抽取患者关节腔滑膜液,采用ELISA试剂盒检测成骨分化标记物骨钙素(OCN)、骨保护素/核因子k B受体活化子配体(OPG/RANKL)、碱性磷酸酶(ALP)水平。结果观察组优良率高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。治疗前,2组IKDC评分、WOMAC评分及Lequesne指数差异无统计学意义(P0.05);治疗后,观察组IKDC评分高于对照组,WOMAC评分及Lequesne指数低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。治疗前,2组滑膜液OCN、OPG/RANKL及ALP水平差异无统计学意义(P0.05);治疗后,观察组OCN、OPG/RANKL及ALP水平高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论 PRP能促进KOA患者局部成骨分化,缓解软骨组织的退化,具有较高的临床应用价值。     

骨髓间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞及其功能的研究

目的体外诱导分化骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)为胰岛样细胞,鉴定诱导细胞并检测其功能。方法取周龄大鼠骨髓细胞,进行MSC培养纯化扩增,用bFGF、EGF、条件培养液、高糖培养液、B27、地塞米松、胰岛素等培养体系诱导MSC向胰岛细胞转化。双硫腙染色鉴定胰岛样细胞;免疫细胞化学鉴定胰岛素抗原表达;Western blot检测胰岛样细胞胰岛素的表达。结果体外诱导的MSCs由长梭形变成多角形并逐渐聚集成团。双硫腙染色细胞团成亮红色,初步表明为胰岛样细胞。诱导的细胞具有胰岛素抗原表达;Western blot检测诱导分化为胰岛样细胞的胰岛素表达阳性。结论骨髓间充质干细胞能够分化成胰岛样细胞,并具有分泌胰岛素的功能。     

中药骨碎补水煎液对间充质干细胞成骨分化的作用

目的:探讨中药骨碎补水煎液对脐带血来源的间充质干细胞成骨分化的作用。方法:脐带血干细胞进行基础成骨分化培养后,以0.5mg/ml的骨碎补进一步诱导,检测细胞外液的碱性磷酸酶含量。结果:基础成骨诱导组和骨碎补组诱导成骨10d后,碱性磷酸酶含量较对照组显著增加,虽骨碎补组碱性磷酸酶均数高于基础成骨组,但是差别无统计学意义。结论:骨碎补未起到显著的促骨化作用,可能与本所用的骨碎补浓度较低(0.5mg/ml)有关,也可能骨碎补本身对干细胞成骨无直接作用有关。     

氟暴露对小鼠骨髓间充质干细胞增殖、凋亡及成骨分化的影响

目的探讨氟暴露对小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)增殖、凋亡及成骨分化的影响。方法自C57BL/6小鼠(6 ～ 8周)股骨分离、培养得到BMSCs, 取第3代细胞采用流式细胞术分析干细胞表面标志物。用氟终浓度分别为0.0、0.1、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、40.0 mg/L的培养基培养BMSCs, 检测不同浓度氟对BMSCs细胞增殖(CCK8法)、凋亡(流式细胞术分析)、成骨分化能力[茜素红及碱性磷酸酶(ALP)染色]的影响;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测凋亡相关蛋白[聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)]、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路成员蛋白[细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2), c-Jun氨基末端激酶(JNK), p38及磷酸化ERK、JNK、p38(p-ERK、p-JNK、p-p38)], 成骨分化相关蛋白[Runt相关转录因子2(Runx2)、ALP]与Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路成员蛋白[糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)、磷酸化GSK3...     

阿仑膦酸钠对人骨髓间充质干细胞体外骨向诱导的研究

目的：探讨不同浓度阿仑膦酸钠对人骨髓问充质干细胞体外骨向诱导增殖和成骨诱导分化能力的影响。方法：取生长状态良好的第四代细胞,分为实验组（不同浓度的阿仑膦酸钠,A—F组）、空白对照组（L—DMEM,G组）和阳性对照组（地塞米松,H组）各自诱导成骨分化。观察细胞形态,放射免疫法检测各组hBMSCs骨钙素的分泌能力,实时荧光定量PCR检测各组细胞培养液中Runx2和OsxmRNA的表达情况,并检测经成脂肪细胞诱导分化后细胞内脂蛋白脂酶（LPL）mRNA的表达情况。结果：hBMSCs诱导分化至第7天时,A—F组大部分细胞仍呈长梭形,c组部分细胞开始出现形态学改变;各组细胞培养基中骨钙素均随诱导分化时间推移而增多;各组细胞表达Osx和Runx2mRNA也随诱导分化时间推移而增多;hBMSCs经诱导分化21d时,A—F组细胞Osx和Runx2mRNA表达量进一步增加,E组和F组超过半数细胞阳性表达,高于其他阿伦磷酸钠工作液诱导组;在阴性对照组,始终未见有细胞形态学改变、骨钙素表达和Osx和Runx2mRNA表达。结论：ALN能促进hBMSCs增殖和骨向分化,1×10^-6mol／L为其诱导分化的合适浓度。     

大鼠骨髓间充质干细胞在子宫内膜组织中迁移分化的研究

目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞在子宫内膜组织的迁移分化情况。方法:第2代雄性大鼠骨髓间充质干细胞行PKH26标记,实验组5只雌性大鼠尾静脉注射1×107/mlPKH26标记BMSCs 1 ml,对照组5只雌性大鼠尾静脉注射生理盐水1 ml。6周后切下子宫制成冰冻切片,荧光显微镜下观察标记细胞在子宫内膜组织的分布情况,并进行免疫荧光染色检测标记细胞角蛋白的表达。结果:实验组大鼠子宫内膜组织均可见标记细胞散在分布于子宫内膜组织中,腺上皮中少数标记细胞角蛋白染色阳性。对照组子宫内膜均未见标记细胞。结论:BMSCs可以迁移至子宫内膜,可以向腺上皮细胞分化,参与子宫内膜的增生。     

体外诱导月经血间充质干细胞分化为成肌细胞

目的探讨月经血间充质干细胞在体外可否分化为成肌细胞。方法提取并用10%FBS的DMEM培养液培养人月经血间充质干细胞和SD大鼠的肌卫星细胞;诱导组用肌卫星细胞培养的上清液和5-氮杂胞甙对月经血间充质干细胞进行诱导,对照组用10%FBS的DMEM培养液培养细胞;诱导后,用免疫荧光和RT-PCR方法检测成肌细胞标记蛋白Pax7蛋白和mRNA的表达。结果经免疫荧光检测,诱导组细胞Pax7阳性率为80.36%,与对照组比较,具有统计学意义(F=15.237,P=0.000 1);经RT-PCR检测,诱导组与对照组比较,Pax7基因呈现具有统计学意义的阳性表达(F=14.339,P=0.000 1)。结论月经血间充质干细胞在体外可分化为成肌细胞。     

人脐血间充质干细胞分离培养方法的优化

目的探索脐血来源的间充质干细胞体外分离培养的更优方法。方法无菌条件下抽取正常足月剖宫产胎儿的脐带血,肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞。50份脐血分为对照组和改良组,每组25份,分别以1.5×10^7/ml的细胞密度接种于25 cm^2培养瓶中。对照组贴壁3 d后弃上清,去除未贴壁细胞,更换新鲜培养液;改良组贴壁0.5 h后弃上清,去除未贴壁细胞,更换新鲜培养液。结果对照组杂细胞较多,最终成功培养出8份脐血间充质干细胞;改良组杂细胞较少,最终成功培养出18份脐血间充质干细胞。经流式细胞仪检测脐血间充质干细胞的免疫表型,结果显示,所培养出的脐血间充质干细胞不表达或极弱表达CD34、CD106等造血细胞标志,稳定地高表达CD29、CD44、CD105等间充质细胞相关的表面抗原标记物。结论采取脐血单个核细胞贴壁0.5 h弃上清更换新鲜培养液可以明显提高脐血间充质干细胞的培养成功率,其结果优于脐血单个核细胞贴壁3 d弃上清更换新鲜培养液。