微RNA调控骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展

目前,对于大面积骨坏死及骨代谢疾病临床仍没有合适的治疗方法。治疗这些疾病的关键在于如何促进成骨分化,而微RNA(miRNA)作为真核细胞内的特异性调节因子,参与了大量基因的编码,在转录、翻译过程中发挥重要作用,其通过对多种信号通路的调节,促进间充质干细胞的成骨分化和骨再生。同时,miRNA的异常表达也是导致骨质疏松、骨性关节炎等骨代谢疾病的重要因素。由于miRNA数量较多,故其在调节骨代谢过程的作用机制仍不明确,未来需进一步研究,以为骨代谢疾病的特定治疗提供理论依据。     

微小RNA-23a调控大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化的实验研究

目的:研究微小RNA-23a(microRNA-23a,miR-23a)调控大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成软骨分化的作用和分子机制。方法:分离大鼠BMSCs并转染miR-23a基因后,通过RT-PCR和番红O染色法检测miR-23a调控大鼠BMSCs成软骨分化的作用,并进一步利用Western blot研究番红O调控BMSCs成软骨分化的分子机制。结果:转染miR-23a组和未转染组相比,成软骨分化相关基因如Sox9、二型胶原(CollagenⅡ)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)发生明显上调,而软骨肥大相关基因十型胶原(CollagenⅩ)表达发生下调。番红O染色显示转染miR-23a组和未转染组相比,硫酸软骨素表达亦发生明显上调。Western blot检测显示转染miR-23a能明显促进大鼠BMSCs的Sox9蛋白表达而抑制其Runx2蛋白表达。结论:miR-23a可能通过上调Sox9表达及抑制Runx2表达来达到促进BMSCs成软骨分化并抑制其进一步肥大的作用。     

miR-338-3p通过靶向RUNX2负调控人骨髓间充质干细胞成骨分化且促进骨质疏松

目的:探讨miRNA-338-3p在骨质疏松症进展中的作用及其对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化的影响.方法:选择60例骨质疏松症患者为研究对象,另选同期60名非骨质疏松者作为对照组.检测两组血清miR-338-3p表达水平.采用RT-qPCR检测miR-338-3p、骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)和Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ)水平.Western blot检测miR-338-3p对RUNX2蛋白表达的影响;采用碱性磷酸酶(ALP)测定法和茜素红染色评估miR-338-3p和RUNX2对成骨分化和矿化能力的影响;采用生物信息学和荧光素酶报告基因检测验证miR-338-3p和RUNX2之间的关系.结果:骨质疏松患者血清miR-338-3p水平相比对照组表达量明显上升(P<0.05),且其表达随着成骨诱导时间的延长而逐渐降低(P<0.05).与对照组比较,miR-338-3p表达情况影响OCN、OPN和Collagen Ⅰ mRNA的水平(P<0.05).与对照组相比,miR-338-3p过表达削弱了hBMSCs矿化能力和ALP活性(P<0.05).双荧光素酶报告基因检测证实,RUNX2是miR-338-3p的直接靶点,miR-338-3p过表达降低了RUNX2蛋白及其mRNA的表达水平(P<0.05).RUNX2过表达可逆转miR-338-3p对hBMSCs成骨分化的抑制作用.结论:miR-338-3p通过靶向RUNX2负调控hBMSCs的成骨分化,从而促进骨质疏松的进展.     

人骨髓间充质干细胞体外诱导培养成骨的实验研究

目的 观察人骨髓间充质干细胞的生长特点及诱导条件下的成骨能力。方法 抽取人骨髓组织，梯度离心后，保留贴壁细胞传代，稳定传代后改用含地塞米松、β—甘油磷酸钠和维生素C的诱导培养液，通过倒置显微镜观察、碱性磷酸酶染色、骨钙素免疫组化染色等方法进行观测。结果 原代人骨髓间充质干细胞10～12d左右即可长满，并可稳定传代，传代细胞5～6d即可传代，在诱导培养液中2周形成多层结构，并聚集成细胞钙化结节。诱导培养细胞碱性磷酸酶染色，骨钙素免疫组化染色阳性。结论 人骨髓间充质干细胞经合理的体外诱导培养后，符合成骨细胞的形态特征和生物学特性，可为体外构建组织工程化骨提供自体种子细胞。     

骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展

骨髓间充质干细胞是一种多能干细胞,具备向成骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成纤维细胞等多种细胞分化的能力,其来源较为丰富,异体移植也不会引发明显的排斥反应,因此被广泛应用于组织工程、干细胞移植、骨质疏松症以及骨折不愈合等多种疾病的治疗,成为骨科研究重点.了解骨髓间充质干细胞的分离培养方法及鉴定、成骨向分化诱导方式...     

去分化间充质干细胞成骨再分化潜能的实验研究

目的:研究去分化间充质干细胞(de－differentiated mesenchymal stem cells,De－MSCs)成骨再分化能力?方法:以MSCs为对照,分别采用Cell Count Kit(CCK8)法?实时定量PCR(qPCR)?碱性磷酸酶(ALP)活性和茜素红染色法检测De－MSCs增殖能力?成骨相关基因?成骨再分化能力等?结果:De－MSCs可表达干细胞表面标志,在成骨培养基中增殖能力高于MSCs(P < 0.05),成骨相关基因(Runx2?Osterix?Bmp2)表达明显增加(P < 0.05),ALP活性检测发现De－MSCs明显高于MSCs组(P < 0.05),28 d后茜素红染色可见红色结节?结论:De－MSCs具备某些MSCs特征,但是体外再次成骨效率明显提高,De－MSCs可作为更优质种子细胞,为再生医学开拓新的思路?     

miR-125b通过靶向抑制Smad4调控骨髓间充质干细胞成骨分化

目的: 研究miR-125b是否通过调控其预测的靶基因Smad4表达而调节骨髓间充质干细胞(MSCs)成骨分化。方法: 构建Smad4 3'-UTR-荧光素酶报告载体,通过荧光素酶报告检测观察miR-125b对Smad4 3'-UTR-荧光素酶活性的影响;分离培养人骨髓MSCs,在MSCs中转染miR-125b mimics并进行成骨诱导,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western印迹检测Smad4表达水平;Smad4 siRNA转染MSCs并进行成骨诱导,通过检测碱性磷酸酶(AKP)活性及RUNX2 mRNA表达水平变化考察Smad4下调对MSCs成骨分化的影响。结果: 双荧光素报告检测显示miR-125b能特异性地与Smad4 mRNA的3'-UTR结合,抑制其荧光素酶活性(P<0.05)。过表达miR-125b能抑制MSCs成骨分化过程中Smad4表达水平。干扰Smad4表达能抑制AKP活性及RUNX2 mRNA表达水平,它能部分模拟miR-125b调控MSCs成骨分化的功能。结论: miR-125b通过抑制靶基因Smad4的表达调控MSCs成骨分化。     

全反式视黄酸抑制大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化及其机制

目的：探索全反式视黄酸（all-trans retinoic acid,at-RA）对大鼠骨髓间充质干细胞（rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs）成骨分化的影响及其机制。方法：成骨诱导培养基诱导rBMSCs,加入不同浓度（0.1、1.0、5.0 μmol/L）at-RA,诱导第7天用组织化学染色法和检测试剂盒检测各组碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性,第21天用茜素红染色后倒置显微镜观察并经提取法后检测钙盐沉积。于诱导第7、14、21天采用real-time PCR检测骨钙素（osteocalcin,OCN）、骨桥素（osteo－pontin,OPN）,在上述时间点的基础上,再增加第1、3天2个时间点检测Runx2、Osterix以及视黄酸受体RARs（?琢、?茁）mRNA表达。结果：rBMSCs在成骨培养基诱导下经形态和茜素红染色观察证实能分化为成骨细胞,加入at-RA后培养7 d,ALP活性较对照组增加（F=107.177,P=0.000）,与对照组比较,at-RA为1.0、5.0 μmol/L 2组明显升高（P<0.05）。然而经茜素红染色测定,ALP升高组其钙盐沉积与对照组比较反而减少（F=57.554,P=0.000）。选at-RA浓度5.0 μmol/L做real-time PCR检测,与对照组相比在上述3个时间点OCN（F=211.145,P=0.000）、OPN（F=30.835,P=0.005）表达均降低,Runx2（F=106.536,P=0.000）、Osterix（F=452.546,P=0.000）、RAR?琢（F=253.159,P=0.000）的表达在第21天均下降,除Osterix表现为全程下调外,其他2个基因也在多个时间点有统计学差异;而RAR?茁表达则全程明显上升（F=2 294.377,P=0.000）。结论：at-RA抑制rBMSCs成骨分化,其机制可能与RAR?琢的下调和RAR?茁的上调,进而影响Runx2、Osterix的表达有关。     

骨质疏松症抑制人间充质干细胞的成骨分化

摘 要: 【目的】 为研究患者来源干细胞成骨分化的差异性,选取临床诊断为骨质疏松症患者的骨髓干细胞进行成骨分化诱导? 【方法】 采用密度梯度离心法,从临床6名患者(骨质疏松症3人,非骨质疏松症3人)的腰椎骨髓血液中分离获得原代骨髓间充质干细胞,并体外扩增至3-4代后进行实验?成骨诱导液的成分包括地塞米松(100 nmoL/L),二磷酸抗坏血酸(0.05 mmoL/L),β-甘油磷酸钠(10 mmoL/L)溶解于含有100 mL/L胎牛血清的低糖DMEM中?通过测定hMSC的增值与碱性磷酸酶(ALP)含量反应干细胞成骨分化活性?定量PCR检测Runx-2?ALP及成骨标志基因osteocalcin(OC)和osteonectin(ON)表达水平;通过矿化结节茜素红染色确认并定量检测钙离子浓度?【结果】 比较两组干细胞增殖差异,骨质疏松组较非骨质疏松组降低,而ALP含量无显著差异?Q-PCR检测显示在第3?7天时,骨质疏松组Runx-2?ALP的mRNA表达水平均显著低于非骨质疏松组?骨质疏松组的成骨相关基因OC在3?7?14 d时mRNA表达水平均显著低于非骨质疏松组,而ON仅在第7天表达具有显著差异;矿化结节染色及钙离子定量检测显示,较之非骨质疏松组,骨质疏松组矿化结节染色浅,钙定量降低?【结论】 使用成骨诱导干细胞分化方案(地塞米松?二磷酸抗坏血酸?β-甘油磷酸钠)结果提示骨质疏松症患者的干细胞成骨分化能力较非骨质疏松患者降低?因此,选取有骨质疏松症患者自身的骨髓间充质干细胞作为治疗的种子细胞可能并不适用于临床?     

不同代次骨髓间充质干细胞成骨分化潜能的体外研究

目的观察不同代次人骨髓间充质干细胞(MSC)体外成骨分化能力,为优化组织工程种子细胞提供更多参数。方法应用全骨髓直接贴壁法分离培养10例健康志愿者MSC,依照年龄将MSC分为4组,<20岁,20岁～,30～40岁,>40岁组。取P1(passage 1)～P5诱导成骨分化,诱导分化14d予以碱性磷酸酶染色,21d茜素红染色,Image-Pro Plus软件分析细胞染色阳性区域平均吸光度值。结果 <20岁组P1～P5成骨分化能力无显著差异(P>0.05);30～40岁组P3分化能力低于P1、P2(P<0.05);>40岁组P3分化能力下降更明显(P<0.05or P<0.01),P4、P5几乎分化受阻。结论不同代次的MSC分化能力具有异质性,与年龄有关。>40岁组MSC在超过P3代时,细胞倍增时间明显延长,诱导成功率降低,成骨分化潜能明显下降,选择P2代作为种子细胞更有利于细胞治疗的安全及质量控制。     

骨髓间充质干细胞成骨细胞分化研究进展

骨髓间充质干细胞(BMSCs)的基础研究和临床应用广泛,BMSCs具有良好的成骨分化潜能,同时具有多向分化的能力,可向脂肪、骨、软骨细胞分化。BMSCs在合适的生长因子作用下可以快速地向成骨细胞分化和增殖,并且具有容易取材、容易分离、容易扩增、多谱系转化而不发生明显免疫排斥反应等优点,在骨组织工程领域拥有广泛的应用价值。但是,随着使用增多,存在的问题也日益突出,如生物学特性、分离鉴定、诱导分化和临床应用进展等问题还有待进一步解决。     

不同糖浓度对颌骨骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的 研究不同糖浓度对颌骨骨髓间充质干细胞（orofacial bonemesenchymal stem cells, OFMSCs）增殖和成骨分化的影响。方法 体外分离、培养OFMSCs,成骨、成脂、成软骨分化诱导及鉴定,并使用不同含糖量培养基（5.5、11、16.5、25、44 mmol/L）培养OFMSCs,以5.5 mmol/L基准糖浓度为对照组,其余组为实验组。采用CCK-8及流式细胞仪检测各组OFMSCs的增殖活性及增殖指数,OFMSCs成骨诱导后4、7 d检测碱性磷酸酶（ALP）活性,21 d进行茜素红染色及矿化定量分析,同时用RT-PCR检测3、7、14及21 d相关成骨基因Runx2、Osterix的表达。结果 培养的OFMSCs成骨诱导21 d后茜素红染色可见钙结节,成脂诱导14 d 后油红O染色可见红色脂滴,成软骨诱导14 d 后阿利新蓝染色可见蓝色胞浆;糖浓度在5.5～25 mmol/L促进OFMSCs的增殖,但随着糖浓度的继续增加（25～44 mmol/L）,OFMSCs的增殖活性受抑制;成骨诱导时,随着培养液糖浓度升高,ALP活性呈剂量依赖性降低（P Runx2、Osterix mRNA 表达量高于实验组（P Runx2、Osterix mRNA 表达量均出现先上调再下调的趋势。结论 在一定范围的糖浓度内,糖浓度升高可促进OFMSCs的增殖;而糖浓度升高对成骨分化呈抑制效应。     

蛋白激酶CβⅡ负调控小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

目的观察蛋白激酶C(PKC)各亚型在小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化中的作用。方法Western blot检测小鼠BMSCs成骨分化中PKC各亚型的活化情况;利用PKC阻断剂GFX分析PKC在BMSCs体外成骨分化中的作用;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测成骨早期分化指标ALP的活性;茜素红染色检测BMSCs体外矿化能力;实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测成骨分化相关基因Runx2、Ⅰ型骨胶原a1(ColⅠa1)和ALP的表达情况。结果小鼠BMSCs成骨分化过程中,仅检测到PKCβⅡ亚型活化,其他亚型均无明显活化。利用PKC阻断剂GFX抑制PKCβⅡ活化后,茜素红染色结果显示BMSCs的成骨分化过程受到促进;PCR结果显示成骨分化相关基因Runx2、ColⅠa1和ALP的mRNA水平均有不同程度增加;ALP活性检测结果也显示BMSCs的成骨分化过程受到促进。结论PKCβⅡ可负调控小鼠BMSCs的成骨分化。     

中药提取物诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展

对近年来单味中药提取物诱导骨髓间充质干细胞成骨分化研究进展进行了概述,参考文献20篇。     

miR-124-3p阻断Wnt/β-catenin信号抑制骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化

目的 探讨miR-124-3p对Wnt/β-catenin信号的调控作用及对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响.方法 培养BMSCs细胞,诱导其成骨分化.将miR-124-3p模拟物(miR-124-3pmimics组)及miR-124-3p阴性对照(miR-124-3p NC组)转染至BMSCs细胞中,并采...     

微小RNA-22-3p调控Kruppel样因子6表达对骨髓间充质干细胞心肌样分化的影响

目的 探究微小RNA-22-3p(miR-22-3p)调控Kruppel样因子6(KLF6)表达对骨髓间充质干细胞(BMSC)心肌样分化的影响。方法 分离并培养大鼠BMSC,将第3代BMSC分为对照组、5-氮杂胞苷(5-AZA)组、模拟物阴性对照组、miR-22-3p模拟物组、miR-22-3p模拟物+空载质粒组、miR-22-3p模拟物+KLF6过表达质粒组;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中miR-22-3p及KLF6表达;免疫荧光化学染色法检测细胞结蛋白(Desmin)、肌钙蛋白T(cTnT)、间隙连接蛋白43(Cx43)表达;Western blot检测Desmin、cTnT、Cx43、KLF6蛋白表达;流式细胞术检测BMSC凋亡情况;采用双荧光素酶报告基因实验分析miR-22-3p和KLF6的靶向关系。结果 与对照组比较,5-AZA组BMSC中miR-22-3p(q=7.971,P<0.001)、Desmin(q=7.876,P<0.001)、cTnT(q=10.272,P<0.001)、Cx43表达(q=6.256,P<0.001)以及细...     

EphB6在小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的初步研究

目的探讨EphB6在小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSC)成骨分化中的作用及其可能机制。方法将BMSC通过双相接种法接种于脱钙骨基质,分为4组:成骨诱导5、14 d(A、B组),普通培养5、14 d(C、D组),茜素红染色检测钙结节,定量检测各组碱性磷酸酶活性,Runx2、Osterix和EphB6的mRNA表达,采用游离态配体ephrinB1-Fc激活EphB6并重复检测上述指标。结果 ALP活性、Runx2和Osterix在A、B组增高,且B组检测到最高的ALP活性[(7.32±2.02)金氏单位/100 ml]、Runx2(3.442 6±0.258 5)倍和Osterix(2.482 3±0.329 2)倍。EphB6的表达水平在A、B组降低,且在B组最低(0.754 3±0.023 5)倍。以ephrinB1-Fc激活EphB6后,茜素红染色显示钙结节明显减少,ALP活性显著下降(P<0.05),在高浓度配体作用后ALP活性[(12.20±1.30)金氏单位/100 ml]较低浓度配体[(15.40±1.03)金氏单位/100 ml]有进一步下降(P=0.008)。配体作用后,BMSC成骨分化中Runx2和Osterix的表达显著下降。结论 EphB6通过调控Runx2和Osterix抑制BMSC成骨分化。     

氯化锂通过抑制糖原合酶激酶3β维持缺氧心肌的缝隙连接

目的 在心肌慢性缺氧环境下,研究氯化锂对心肌间缝隙连接的影响.方法 将25只C57BL/6J小鼠分为常氧组、缺氧组、常氧对照组、缺氧+生理盐水组和缺氧+氯化锂组.缺氧组采用10％氧浓度缺氧4周.缺氧+生理盐水组和缺氧+氯化锂组分别腹腔注射生理盐水和氯化锂.用电生理和心导管检查,评价心律失常情况、心率和射血分数.用免疫荧光观察连接蛋白43(Cx43)的分布情况,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Cx43、磷酸化糖原合酶激酶3β(p-GSK-3β)和糖原合酶激酶3β(GSK-3β)的水平.结果 与常氧组比,缺氧组小鼠心率较快[(448±18)次/min vs.(401±13)次/min,P＜0.05],左心室射血分数降低[(56±5)％ vs.(73±4)％,P＜0.05],心律失常评分增加[(3.4±0.5)分vs.(0.6±0.5)分,P＜0.05],Cx43表达减少.与缺氧+生理盐水组比,缺氧+氯化锂组的小鼠心率降低[(412±11)次/min vs.(454±18)次/min,P＜0.05],射血分数增加[(69±3)％vs.(55±4)％,P＜0.05],心律失常评分减少[(1.8±0.4)％vs.(3.0±0.7)％,P＜0.05],Cx43增加,p-GSK-3β与总GSK-3β的比值增加.结论 在心肌慢性缺氧中,氯化锂能通过抑制GSK-3β信号,维持缝隙连接,降低心律失常发生率.     

低表达NIPBL抑制骨髓间充质干细胞成骨并促进β连环蛋白磷酸化

目的：探讨NIPBL低表达对骨髓间充质干细胞在成骨方面的影响及可能的机制。方法：NIPBL+/-、空载体慢病毒转染BMSCs并观察荧光表达量,RT-PCR分别检测空白组、空载体组、NIPBL沉默组NIPBL mRNA的表达。将三组细胞(空白组、空载体组、NIPBL沉默组)成骨诱导21 d后茜素红染色,并检测β连环蛋白、磷酸化β连环蛋白以及Lrp-5 mRNA的表达情况。结果：三组细胞(空白组、空载体组、NIPBL沉默组)中,沉默组NIPBL mRNA的表达水平显著低于其余两组,差异有统计学意义(P<0.001);三组细胞在成骨分化过程中形态发生明显变化,诱导第21天茜素红染色发现沉默组的红色钙结节形成较空白组及阴性组少并且沉默组β-catenin蛋白、P-β-catenin蛋白以及Lrp-5mRNA表达水平均低于空白组和空载体组,差异有统计学意义(P<0.001)。结论：低表达NIPBL抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨能力并促进β-catenin蛋白磷酸化。