大规模单细胞测序数据揭示结直肠癌中肠道内分泌细胞生理机制的改变与潜在临床应用价值

研究从大规模单细胞转录组测序数据出发，获得结直肠癌(colorectal cancer, CRC)中肠道内分泌细胞(enteroendocrine cell, EEC)的单细胞转录组图谱；对此转录组测序数据作差异表达、功能以及拟时序分析，结果提示肿瘤微环境中EEC发育与激素合成/分泌相关功能不全有关；结合肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)和肿瘤药敏多组学数据库(Genomics of Drug Sensitivity in Cancer, GDSC)中CRC的bulk转录组测序数据、随访信息和药物测试数据，筛选出对CRC患者生存具有积极影响的生物学标志物——胰高血糖素(glucagon,GCG)基因；利用肿瘤细胞系药物测试数据探究了GCG基因在CRC治疗中的潜在应用价值。该研究为CRC的治疗提供了新的思路。     

基于单细胞转录组测序分析人肋来源软骨细胞的异质性

背景:肋软骨是人体组织中一类重要的软骨来源,常作为软骨自体移植和组织工程构建的种子细胞来源。单细胞测序是分析细胞异质性的强大工具,可针对肋软骨细胞进行细胞异质性的深入研究。目的:通过单细胞转录组测序分析人肋软骨组织细胞分群情况,以及每个细胞亚群参与的生物学过程。方法:临床获取1例31岁小耳重建手术后废弃的肋软骨组织制成原代细胞悬液,经10X Genomics平台进行单细胞分离,使用Gel Bead Kit V3构建单细胞RNA-seq文库,Illumina Novaseq6000测序仪对文库进行测序,并利用主成分分析和T分布随机邻域嵌入进行降维,获得4个亚群细胞,进而获得不同亚群细胞的标记基因,再对每个细胞亚群的标记基因进行GO和KEGG分析,分析这些基因可能参与的生物学过程。结果与结论:测序共获取6 634个细胞,符合质控标准。将肋软骨细胞划分为4个细胞亚群,分别为以COL10A1、S100A2为标记基因的肥大软骨细胞群;以BMP2、COL2A1为标记基因的软骨细胞群;以FOS、JUN为标记基因的增殖性细胞群;以MYLK、CD146为标记基因的干细胞群。将肋软骨细胞进一步划分细胞亚群...     

单细胞测序技术在预测肺癌免疫疗效中的研究进展

肺癌是世界各地癌症死亡的主要原因。尽管在过去的几十年里生存率有所提高, 但肺癌的生存率还没有达到其他常见恶性肿瘤的水平。近年来, 免疫检查点抑制剂(ICIs)在临床试验中已显示出巨大的前景, 并迅速被纳入晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的标准治疗方案中, 然而许多患者并未从治疗中受益。研究结果表明, 肿瘤微环境(TME)的异质性与ICIs疗效密切相关。单细胞测序是一种能够在单细胞水平上对细胞群体从基因组和转录组层面进行特异性分析的技术, 该技术为探究ICIs疗效的影响因素进而找到ICIs的适用人群提供了保障。对单细胞测序技术在预测肺癌免疫疗效中的潜在价值进行了综述。     

神经元逆行荧光标记技术

七十年代后期在神经解剖学研究领域中出现了一种新的追踪神经连系的方法——神经元逆行荧光标记法。此法基于神经元轴浆逆行运输的生理特性。注射到神经元未梢周围的逆行荧光标记物能被末梢非特异性摄入并逆向运送至胞体,从而在荧光显微镜下能观察到这些含荧光标记物的细胞。此法简便,敏感度高,能作双或三标记研究。此外,它又易与酶组化、荧光组化、免疫组化等方法相结合,是目前研究神经核团定位联系、侧支投射和神经元化学通路最为理想工具之一。此技术问世以来,深受神经解剖学工作者的重视并用于神经元发育、侧支投射和化学通路的研究,     

大鼠延髓背角Ⅲ层深部内GFP基因重组病毒标记神经元的形态学特点

目的　观察大鼠延髓背角 (MDH)Ⅲ层深部内绿色荧光蛋白 (GFP)基因重组病毒标记神经元的形态学特点。　方法　将GFP基因重组病毒注入Ⅲ层深部后感染并标记神经元 ,标记结果用免疫组织化学染色显示 ,重塑后观察神经元形态。　结果　在远离注射区的MDHⅢ层深部可见少量单个GFP标记的神经元。根据GFP标记神经元的形态学特征 ,尤其是其轴突及其分支的特点 ,可将标记神经元分为投射神经元和中间神经元。投射神经元的轴突分支向Ⅲ层浅部、Ⅱ层和 或延髓网状结构延伸。中间神经元的轴突分支较密集且主要集中于Ⅲ层。　结论　根据GFP标记神经元的轴突及其分支特点 ,可将MDHⅢ层深部的神经元分为投射神经元和中间神经元 ;GFP基因重组病毒标记技术是研究神经元形态的有效手段     

小鼠胚胎脑组织移植块中选择性荧光标记神经元的发育和投射

目的:建立选择性荧光标记小鼠胚胎脑组织移植块移植模型并观察选择性荧光标记的神经元在成体脑组织中的存活、发育和投射。方法:将孕龄14～15 d选择性荧光标记的胎鼠脑组织块移植到受损的普通小鼠大脑皮层中,2个月后用荧光显微镜和共聚焦显微镜结合Nissl染色的方法观察胚胎脑组织移植块内选择性荧光标记的神经元在受体大脑中的生长发育情况。结果:在胚胎脑组织移植块内观察到只有少部分神经元被标记,这些类似于Golgi染色模式的选择性荧光标记的神经元有大量的神经纤维投射到受体鼠的不同脑区。通过Nissl染色和共聚焦成像发现胚胎脑组织移植块内神经元能分化并形成典型的突触结构-树突棘和突触终扣。结论:胚胎脑组织移植块内选择性荧光标记的神经元在受体脑内能够存活并特异性地表达荧光,这些标记的神经元具有正常的形态结构,可以投射到各个脑区并参与神经回路的重建。     

气道抽吸液标本单细胞转录组测序前细胞处理技术的比较

目的探索适用于气道抽吸液标本单细胞转录组测序的细胞前处理方法。方法从4例急性呼吸道感染患者中新鲜采集4份气道抽吸液标本, 用痰消化液消化后过细胞滤网制备成单细胞悬液, 分别用新鲜细胞直接建库(direct emulsion, DE)、用10×Genomics的单细胞RNA固定试剂固定后混合建库(direct-fix, DF)、将细胞冻存复苏再固定后(frozen-fix, FF)混合建库3种方法操作, 3种方法均以104个细胞进行油包水处理, 用10×Genomics平台进行单细胞测序, 对获取的细胞数量、数据质量、注释的细胞种类、标记基因的表达水平进行比较分析, 用Pearson相关性分析3种前处理方法获得的同种细胞亚群高变基因表达差异。比较3种前处理方法获得的同一细胞亚群的差异基因在不同方法之间的表达水平。通过Pearson相关分析研究3种前处理方法获得的同一细胞亚群之间差异基因表达的相关性。结果 DE、FF、DF方法获得的单细胞数量中位数分别为2 733、1 140和5 897个(P>0.05), 唯一分子识别符高于500, 基因中位数分别为801、887、1 259(P&...     

病毒示踪法研究小鼠丘脑中央内侧核内谷氨酸能神经元的传出和传入纤维联系

目的:明确丘脑中央内侧核(CMNT)内谷氨酸能神经元的传入及传出投射联系,为CMNT的相关功能性环路研究奠定解剖学基础。方法:利用狂犬病毒(RV)的逆行跨单级突触的能力及携带增强型黄色荧光蛋白(EYFP)的腺病毒顺行标记突触末梢的能力,采用核团微量注射方式分别将Cre依赖的两种病毒注射到VGLUT2-Cre小鼠的CMNT内,待病毒表达之后灌注小鼠,取脑进行全脑切片成像。结果:CMNT内的谷氨酸能神经元主要接受来自运动皮层、岛叶皮层、丘脑网状核、下丘脑背内侧核、黑质、臂旁核的投射,并发出投射纤维至岛叶、尾状核、基底外侧杏仁核、丘脑网状核及嗅觉相关皮层。结论:CMNT内的谷氨酸能神经元在接受广泛的来自于皮层和丘脑核团投射的同时又投射至众多大脑核团和皮质,并且与岛叶、丘脑网状核之间存在着较多的往返投射联系,这表明CMNT可能参与到上、下游核团的相关行为的调控当中。     

敲低小鼠中脑神经元多巴胺D2受体使其生脂基因表达上凋

目的研究小鼠中脑神经细胞多巴胺D2受体(DRD2)对神经元生脂基因的调节作用。方法构建针对DRD2短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体,特异性下调小鼠原代中脑神经元的DRD2表达;神经元分为阴性病毒对照组和DRD2-shRNA病毒感染组,进行高通量转录组测序,分析两组差异基因并以共表达网络筛选核心基因;实时荧光定量PCR及Western blot法验证该差异基因表达并检测神经元脂肪酸含量变化。结果成功培养小鼠中脑神经元并下调DRD2;高通量转录组测序发现中脑神经细胞DRD2下调对多个生脂基因有调节作用,主要包括δ(14)-固醇还原酶、乙酰辅酶A合成酶、胰岛素诱导基因1蛋白、硬脂酰辅酶A去饱和酶等,其中硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)上调最显著(上调4倍),并经实时定量PCR和Western blot结果得到验证。同时脂肪酸含量检测发现与SCD1关系密切的游离脂肪酸在DRD2下调组显著增加。结论下调小鼠中脑神经元DRD2可以显著上调SCD1的表达,SCD1上调可以加速饱和脂肪酸向单不饱和脂肪酸转化,防止脂毒性对细胞的损伤。     

基于10×Genomics技术对蓖麻毒素中毒后中性粒细胞的转录组分析

目的 探究中性粒细胞在蓖麻毒素(Ricin Toxin,RT)致毒过程中的作用,寻找解毒的有效策略.方法 采用10x Genomics单细胞转录组测序技术对中毒小鼠外周血单个核细胞(PBMCs)进行转录组测序及分析,并通过流式细胞术测定目的细胞亚群.结果 经降维聚类、差异基因、拟时序分析结果显示CD177-CD121b...     

基于单细胞转录组测序分析描绘人类早期胚胎红细胞发育图谱

目的 利用单细胞转录组测序(scRNA-seq)在单细胞水平系统描绘人早期红系发育的细胞图谱及分子轨迹。方法 通过对人妊娠第36天CS15后期的胚胎卵黄囊组织scRNA-seq数据进行主成分分析(PCA);聚类分析以及拟时序分析；观察标记基因在不同细胞群体中的表达情况；预测红系细胞发生时间和发育路径。结果 在CS15的卵黄囊的不同细胞群体中，红细胞及其祖细胞、前体细胞等的标记基因存在差异性表达，不同细胞的发生时序不同，且卵黄囊内的红细胞存在一定的异质性。CS15的卵黄囊内存在类型丰富的细胞，可能包括血管内皮细胞、造血前体细胞、粒细胞、不同状态的红细胞以及单核细胞等。结论 推测人早期红系发育路径大致为血管内皮细胞分化产生造血前体细胞，进一步分化成为红髓祖细胞，最终产生巨核细胞和红细胞。     

成年大鼠基底前脑隔-斜角带复合体的巢蛋白免疫阳性神经元至海马的纤维投射

目的 观察大鼠基底前脑巢蛋白(nestin)免疫阳性神经元的纤维投射。方法 先用荧光素逆行追踪法显示基底前脑内投射至海马的荧光素标记神经元，观察摄片后再进行nestin免疫组织化学染色。对比荧光照片和免疫组织化学染色照片，辨认荧光素和nestin双标神经元。结果 在基底前脑注射侧的内侧隔核(MS)和斜角带核的垂直支(vDB)和水平支(hDB)均存在荧光素标记细胞，其中一部分为nestin免疫阳性。在MS、vDB和hDB，双标细胞占逆行标记细胞的比例分别为21．3％、25％和20．6％；占nestin阳性细胞的比例分别为26．6％、15．7％和16．3％。结论 大鼠基底前脑的nestin免疫阳性神经元发出神经纤维向海马投射。提示在基底前脑有一个平行于隔-海马胆碱能投射和GABA能投射的第3条通路。     

银杏内酯B对成年大鼠神经干细胞向神经元分化的促进作用

目的 探讨银杏内酯B对神经干细胞分化为神经元的促进作用。方法 采用无血清培养和单克隆实验技术在体外分离培养出大量来源于同一细胞的单细胞克隆球，并将其均匀种植于24孔培养板中，分3组分别加入含银杏内酯B、BDNF和不加任何细胞因子的完全培养液。培养7d和14d后终止，用神经元特异性标记物微管相关蛋白-2(MAP-2)的单克隆抗体进行免疫荧光标记，荧光显微镜下观察和计数．MAP-2标记的阳性细胞并对细胞面积和周长进行图像处理。结果 两个时期银杏内酯组MAP-2阳性细胞数均明显多于单纯对照组而少于BDNF组；分化7d和14d时银杏内酯组MAP-2阳性细胞的面积和周长明显大于单纯对照组，而略小于BDNF组。结论 银杏内酯B亦具有类似BDNF促进神经干细胞分化为神经元的作用。     

脑干神经元向前扣带回皮质中部区域的投射(英文)

目的:用逆行标记方法观察脑干神经元向皮质扣带回中部(the middle portion of the cingulate cortex,MCC)的纤维投射。方法:立体定位注射法将0.06~0.08μl的4%荧光金(Fluoro-gold,FG)注射至MCC(Bregmma:+0.2,-0.3,-0.8 mm)部位,7 d后处死大鼠,含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液(PB)灌注固定,取脑组织,制作30μm厚度的冰冻切片,荧光显微镜下观察FG逆行标记神经元的定位分布并计数。结果:MCC与皮质间有广泛的联系,包括与同侧、对侧和扣带回内部的联系。在脑干中缝核簇、蓝斑、被盖腹侧区、被盖背内侧区及中脑中央灰质(α部)均可观察到FG逆标神经元的分布,以上FG标记神经元以同侧为主,对侧较少。结论:以上核团向MCC的投射表明MCC接受来自脑干神经元的广泛投射,提示MCC神经元的活动受到脑干众多结构的调控。     

单细胞转录组测序在中枢神经系统研究中的应用

大脑细胞类型的复杂性众所周知,只有对中枢神经系统组织中各种成分和细胞类型的相互作用进行彻底了解,才能更好地理解中枢神经系统的生理功能与病理状态.现有细胞分类方式在标记的选择上限制了细胞类型的分辨率,难以体现中枢神经系统的异质性.单细胞转录组测序技术通过无偏见的获取单细胞使得组织异质性得到最大程度的体现.本文将对单细胞转...     

单细胞转录组测序溃疡性结肠炎脾虚湿蕴证患者的免疫细胞分子特征

背景：免疫细胞介导的组织破坏对溃疡性结肠炎的发生和发展至关重要,但其机制尚未阐明,同时溃疡性结肠炎脾虚湿蕴证患者缺乏客观的生物标志物。目的：基于单细胞转录组测序技术探讨溃疡性结肠炎脾虚湿蕴证患者的免疫细胞分子特征,寻找溃疡性结肠炎脾虚湿蕴证患者的生物标志物,为其临床诊断及治疗提供参考依据。方法：临床获取2例溃疡性结肠炎患者和2例健康对照者的结肠活检组织,建库后进行单细胞转录组测序,并对单细胞转录组测序数据进行聚类和降维分析、细胞类型注释、差异表达分析和细胞通讯分析等。结果与结论：(1)单细胞转录组测序数据聚类鉴定出29个细胞亚群,组成9种细胞类型;(2)对比健康对照组,溃疡性结肠炎组CD4⁺细胞毒性T细胞、初始CD8⁺T细胞、生发中心、S100A^highB细胞、活化B细胞、NK＿C2细胞和单核细胞的表达增高(P<0.05);溃疡性结肠炎患者的Tfh细胞、NKT细胞和NK细胞的表达减少(P <0.05);(3)差异表达基因的功能富集显示,溃疡性结肠炎患者的免疫调控增加,NK细胞、浆细胞和Th17细胞存在代谢重编...     

小鼠丘脑室旁核至边缘系统部分区域的分支投射参与痒信息的传递

目的:观察小鼠丘脑室旁核(PVT)向边缘系统部分区域的分支投射，并为其参与痒信息的传递提供形态学证据。方法:小鼠分为两组。将荧光金(FG)分别注入第1组动物的内侧前额叶皮质(mPFC)、岛叶(IC)或杏仁中央核(CeA);将FG和霍乱毒素B亚单位(CTB)分别注射到第2组小鼠的两个不同核团(mPFC/IC、mPFC/CeA和IC/CeA);灌注固定前2 h再给予动物急性痒刺激。结合免疫荧光组织化学染色技术观察小鼠PVT内向mPFC、IC或CeA投射、分支投射神经元的分布及其表达FOS蛋白的状况。结果:PVT内存在向mPFC、IC和CeA投射、分支投射并表达FOS的神经元，这些标记神经元在PVT内的分布和比例存在差异。结论:PVT内具有定位分布倾向的部分神经元借助分支投射同时向边缘系统的不同区域传递痒信息。     

含CCK脊神经节细胞的皮肤-内脏分支投射——荧光双标和免疫组织化学结合三重标记法研究

用荧光素逆行双标和免疫组化结合三标技术,研究脊神经节含CCK-8的感觉神经元的皮肤-内脏分支投射。将fast blue(FB)和nuclear yellow(NY)分別注入大鼠左侧腹腔神经节和左侧第9～11肋间神经皮支内。灌注固定,取左侧胸9～11脊神经节,恒冷箱切片。在Nikon荧光显微镜下观察,激发光波长为365nm。镜下可见三种不同标记的神经元:NY标记神经元,胞核发黄色荧光;FB标记神经元,胞浆发蓝色荧光;NY+FB双标神经元(具有分支投射的神经元),胞浆发蓝色荧光和胞核发黄色荧光。双标神经元约占所有荧光标记神经元的2.8％。含有双标神经元的切片,用CCK-8抗血清孵育,用改良的PAP法显色。镜下可见CCK免疫反应阳性神经元。在CCK免疫反应阳性神经元中,可以区分:1.被CCK标记的NY神经元(NY+CCK)。2.被CCK标记的FB神经元(FB+CCK)。3.被CCK标记的NY+FB双标神经元(NY+FB+CCK)。4.单纯CCK免疫反应阳性神经元。NY+FB+CCK三标神经元约占NY+FB双标神经元的11.5％,仅占CCK阳性神经元的0.4％。以上结果表明:脊神经节中有些感觉神经元的周围突具有分支,分别投射到内脏和皮肤;这类神经元中,有些神经元含有CCK-8。从而提示:内脏牵涉性痛的会聚可在脊神经节进行;CCK可能参与内脏和皮肤感觉会聚的调节。因此,本文为牵涉性痛的发生机制和躯体-内脏反射提供了重要的化学神经解剖学资料。     

单细胞RNA测序揭示星形胶质细胞的异质性

背景：星形胶质细胞是中枢神经系统含量最丰富的细胞，存在多种亚型具有很强的异质性，执行着多种特殊功能。近年来，单细胞RNA测序技术从转录组分析的角度扩展了人们对星形胶质细胞异质性的理解。目的：综述单细胞RNA测序技术对星形胶质细胞在不同物种、不同时空以及不同疾病状态异质性研究的进展，扩展对星形胶质细胞异质性在分子和功能层面的认识。方法：检索PubMed、Elsevier及中国知网数据库收录的星形胶质细胞异质性及单细胞RNA测序研究相关文献，中文检索词为“星形胶质细胞、单细胞RNA测序、异质性、阿尔茨海默综合征、脊髓损伤、多发性硬化症”；英文检索词为“astrocytes,scRNA-seq,heterogeneity,Alzheimer disease,spinal cord injury,multiple sclerosis”等，经过入组标准筛选，最终纳入74篇文献进行综述。结果与结论：星形胶质细胞的单细胞RNA测序相关研究显示，星形胶质细胞在不同物种、发育阶段、中枢神经系统区域和病理状态4个方面均存在明显的异质性。(1)不同物种的星形胶质细胞出现某些基因的独特表达，物种特异基因的发现...     

单细胞RT-PCR实验方法研究

目的探索建立稳定可靠的单细胞RT-PCR实验体系。方法以人β-actin和DPH2L基因为靶基因,通过各实验条件的比较优化,对单细胞RT-PCR扩增单个细胞中特异性目的基因和全细胞mRNA两种方法的扩增效果进行深入研究,并结合琼脂糖凝胶电泳和DNA测序技术,分析该方法的灵敏性、特异性、重复性和可靠性。结果单个细胞中的全部mRNA均得到了扩增,扩增成功率为75%,产物经核酸定量均可达到μg水平,足够常规分子生物学实验之用。β-actin和DPH2L基因均得到特异性扩增产物,未见基因组DNA污染,经BLAST比对为100%吻合,不同条件下扩增成功率在30%～90%之间。结论单细胞RT-PCR是一种行之有效的单细胞基因表达的研究工具,提高Mg~(2 )反应浓度并采用巢式引物有利于提高扩增成功率。