动态分析铜绿假单胞菌实验及临床联合用药的耐药性

目的 探讨铜绿假单胞菌实验及临床联合用药的耐药性,指导临床合理应用抗生素。方法 用法国生物梅里埃全自动微生物鉴定/药敏VITEK32系统对铜绿假单胞菌的实验资料进行分析,并通过调查与实验菌株相对应的临床联合用药病案资料,统计分析其临床联合用药的耐药性。结果 多重耐药性铜绿假单胞菌分离率逐年上升,其耐药率也逐年上升,对6种主要抗菌药的耐药率增加20%以上。从2004年1月开始出现全耐药株,至2005年6月该院已出现全耐药铜绿假单胞菌18株,其MIC值均有明显增加。临床联合用药方案中,以舒巴坦/丁胺卡那,舒巴坦/环丙沙星,他唑巴坦/丁胺卡那,亚胺培南/丁胺卡那耐药率较低。结论 铜绿假单胞菌多重耐药情况十分严重。临床要根据药敏试验的MIC结果选择联合用药。     

某ICU病房内铜绿假单胞菌交叉感染调查分析

目的 调查ICU病房铜绿假单胞菌医院交叉感染发生的危险因素和传播规律。方法 应用生物、血清、耐药谱和质粒谱等分型方法对某ICU病房从患者和周围环境分离到的7株铜绿假单胞菌进行同源性分析。结果 铜绿假单胞菌的四种分型结果显示,质粒谱分型和血清分型的一致性较好,7株菌具有相同的血清型和质粒谱型,说明此次医院内铜绿色假单胞菌感染来源于氧气湿化瓶液体,并通过患者周围物品及陪护人员手接触发生交叉感染的同一克隆菌株。结论 质粒分型和血清分型用于铜绿假单胞菌医院感染流行病学调查追溯传染源,是一种较实用的方法,生物分型和耐药谱分型有不足,但作为实验室的常规方法对早期发现流行株和抗菌药物的合理应用具有重要参考价值。本次调查结果显示,加强医疗器具及周围环境消毒和陪护人员管理是预防医院交叉感染的重要措施。     

外科重症监护室多重耐药铜绿假单胞菌的对比基因组学研究

目的 对比分析外科重症监护室多重耐药铜绿假单胞菌的基因组差异,探索其与多重耐药性的关系.方法 琼脂稀释法检测49株铜绿假单胞菌对临床常用9种抗菌药物的敏感性,应用4种稀有位点核酸内切酶结合的脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)对临床分离的株铜绿假单胞菌进行基因组分型.结果 多重耐药铜绿假单胞菌菌株占外科重症监护室铜绿假单胞菌临床分离株的85.7%;PFGE基因组型A菌株占全部铜绿假单胞菌分离株的61.2%,为主导基因组型,该基因组型全部对阿米卡星和头孢吡肟敏感,对左旋氧氟沙星和美洛培南耐药;PFGE基因组型H、P菌株对6种以上抗生素耐药;PFGE基因组型I和J菌株对所测9种抗生素均敏感.结论 4种稀有位点核酸内切酶结合的PFGE基因组分型可以作为临床多重耐药铜绿假单胞菌监控和鉴定的有效手段.     

医院铜绿假单胞菌的分布及耐药性分析

目的 研究2019年我院临床分离铜绿假单胞菌的分布及耐药性,为临床合理使用抗菌药物提供参考。方法 收集我院2019年临床分离的422株铜绿假单胞菌,对其标本来源分布,科室分布和耐药性进行分析。结果 共分离出422株铜绿假单胞菌。痰液、脓液、肺泡灌洗液分别占71.1%、7.3%、5.2%;科室分布以重症监护室最多(19.9%),其后依次为呼吸内科(17.1%)、胸外科病房(8.5%)。2019年铜绿假单胞菌对阿米卡星耐药率最低,为0.2%;对多粘菌素、妥布霉素等药物耐药率较低,分别为0.3%和1.7%;而对替卡西林/克拉维酸的耐药率最高,为17.7%。结论 应加强细菌耐药监测,采取有效措施控制耐药菌株传播。     

重症监护病房铜绿假单胞菌随机扩增多态性DNA研究

目的建立随机扩增多态性DNA(RAPD)基因分型方法监测重症监护病房(ICU)铜绿假单胞菌医院感染。方法收集2005年1月~6月从各科ICU内分离出的21株铜绿假单胞菌,提取DNA后进行RAPD分型,同时进行抗生素敏感性试验。结果全部菌株均能产生指纹图谱,分型率100%。21株铜绿假单胞菌共分为14型,其中9株6型分布于脑外科,3株同型分布于神经内科,4株4型分布于呼吸科,5株3型分布于普外科。抗生素敏感性试验表明21株铜绿假单胞菌均为多重耐药菌株,对哌拉西林、头孢菌素类、喹诺酮类及阿米卡星等耐药,仅对亚胺培南/西司他丁、头孢哌酮/舒巴坦等敏感。结论ICU内存在铜绿假单胞菌感染局部流行,RAPD分型技术分型率高、简便快速。     

铜绿假单胞菌耐药表型与基因分型的关系

目的探讨铜绿假单胞菌耐药表型与基因分型的关系。方法 K-B法检测18株铜绿假单胞菌对4种抗生素的耐药性,随机扩增多态性DNA（RAPD）方法对菌株进行基因分型。结果 18株铜绿假单胞菌具有三种基因型,基因型1的菌株对环丙沙星和庆大霉素双重耐药,基因型2的菌株均对环丙沙星耐药。结论对铜绿假单胞菌进行基因分型,可以获得菌株的耐药表型信息,指导临床用药,还可以追溯耐药菌株流行规律。     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶基因及耐消毒剂基因研究

目的 分析金属β-内酰胺酶基因及耐消毒剂基因与耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药的相关性。方法 采用琼脂二倍稀释法测定246株铜绿假单胞菌对14种抗菌药物的敏感性,Etest法进行金属酶表型的筛选,PCR检测金属β-内酰胺酶基因及耐消毒剂基因。结果 检出102株多重耐药株,21株广泛耐药株,分别占41.5%和8.5%;亚胺培南耐药组筛选出金属酶表型阳性24株,阳性率为37.5%,敏感组未检出;亚胺培南耐药组经PCR扩增金属酶阳性21株,阳性率为32.8%,其中8株为IPM-1,9株为IPM-2,4株为NDM-1,未检出VIM-1、VIM-2;敏感组株未检出金属酶基因,两组的检出率差异具有统计学意义(P<0.05);21株金属酶阳性和表型结果一致;耐药组耐消毒剂基因qacE?1阳性率为81.25%,敏感组阳性率为75%,两组间的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。 结论 耐亚胺培南铜绿假单胞菌表现为多重耐药;金属β-内酰胺酶基因的存在和其产生的金属酶是本地区铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的机制之一,其基因型主要为IPM-1、IPM-2和NDM-1,铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药还存在其他的主要机制;NDM-1阳性铜绿假单胞菌对头孢类抗生素、呋喃妥因、碳青霉烯类等多种抗菌药物耐药;合理使用有效的消毒剂将有利于控制NDM-1阳性菌的传播。     

辽宁省结核分枝杆菌可变串联重复序列体系的初步建立

目的 通过对24位点可变串联重复序列（Variable number of tandem repeats, VNTR）和日本12位点VNTR(日本JATA12位点)的应用,探索适合辽宁省基因分型的相关位点,初步建立本省的VNTR分型体系。方法 采用实验菌株为省级保存的2011—2013年采集自辽宁省14个市的75株菌株。以PCR为基础选取不同位点的引物28对（其中标准24位点与日本JATA12位点中共有的位点有8对）对相应目的片段进行扩增,最后用琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果 日本JATA12位点不适用于辽宁省的菌株,12 位点中的VNTR2074、VNTR3336和Qub15位点通过多次改变PCR条件进行实践仍未得出准确的条带（杂带过多或无目的条带）。标准的24位点中的全部24个位点均可通过实验得出清晰的条带,说明标准24位点的方法可以用于建立辽宁省结核分枝杆菌MIRU-VNTR基因分型体系。75株结核分枝杆菌临床分离株的24个VNTR位点检测结果显示这些菌株均有明显的多态性,24个VNTR 位点的 Hunter-Gaston 指数从 0到 0.75,其中分辨力最高的位点是 MIRU26,分辨力最低的位点是 MIRU2。结论 辽宁省与日本虽同为北京基因型的主要流行地区,但辽宁省流行的北京基因型结核分枝杆菌的基因与日本流行的北京基因型结核分枝杆菌存在着不同的特点。24位点MIRU-VNTR基因分型体系适用于本省,目前已初步建立我省VNTR基因分型位点体系,我们将通过进一步的实验精简位点,最终建立最适用于本省的精准VNTR基因分型体系。     

呼吸机相关性肺炎常见病原菌分布及耐药性分析

目的 了解呼吸机相关性肺炎病原菌分布和耐药性,为临床早期、合理、有效地使用抗生素提供可靠的依据,避免多重耐药的发生。方法 分析临床确诊为呼吸机相关性肺炎患者51例痰标本分离的病原菌112株。采用法国梅立埃鉴定和药敏测定系统进行病原菌鉴定和药物敏感性检测。结果 112株病原菌中以革兰氏阴性杆菌为主,占75.89%,主要为鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯、嗜麦芽寡养单胞菌和大肠埃希菌。革兰氏阳性菌占16%,以金黄色葡萄球菌为主。真菌占11%,以白色念珠菌为主。鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌耐药严重,鲍曼不动杆菌对头孢类、青霉素类、喹诺酮类、碳青霉烯类耐药率大于50%,铜绿假单胞菌对氨苄西林/舒巴坦耐药率为100%。结论 呼吸机相关性肺炎病原菌多重耐药或泛耐药比例较高,临床应根据耐药性监测数据合理使用抗生素。     

海南省桶装饮用水中铜绿假单胞菌耐药性、T3SS毒力基因分布与同源性分析

目的 对海南省桶装饮用水中铜绿假单胞菌的耐药性及Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system,T3SS)毒力基因携带情况进行调查，在菌株核糖体分型基础上探讨其与样品来源及毒力基因之间的关系，为桶装饮用水的安全监管、污染溯源调查及耐药菌临床治疗提供数据基础。方法 使用VITEK 2 Compact全自动微生物药敏系统对分离得到的55株铜绿假单胞菌进行耐药性分析，通过PCR法扩增T3SS毒力基因ExoU、ExoS、ExoT、ExoY，并应用RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定系统对分离菌株进行鉴定分型及聚类同源性分析。结果 药敏结果显示，桶装饮用水中分离的铜绿假单胞菌菌株处于较低耐药水平，但仍然发现1株多重耐药铜绿假单胞菌，对亚胺培南、环丙沙星、头孢吡肟均耐药。T3SS毒力基因分布表现为4种基因型组合，分别为ExoT⁺/ExoY⁺/ExoS⁺/ExoU^-(45.45%,25/55)、ExoT⁺/ExoY⁺/ExoS^-...     

铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因的扩增与克隆

目的PCR扩增及克隆铜绿假单胞菌的弹性蛋白酶基因.方法从铜绿假单胞菌培养物中提取染色体DNA,PCR扩增弹性蛋白酶基因成熟蛋白编码区,A-T克隆于pMD 18-T载体中,对重组质粒进行酶切与测序鉴定.结果从高GC含量的铜绿假单胞菌染色体DNA中扩增到弹性蛋白酶基因并进行了克隆与鉴定.结论本研究成功克隆到铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,为实现活性弹性蛋白酶的高效表达奠定了基础.     

MUC20基因串联重复片段多态性及其对IgA肾病的影响

目的 MUC20基因是在IgA肾病(IgA nephropathy,IgAN)患者肾组织中筛选出来的高表达基因.对不同细胞系检测发现它具有可变数目串联重复片段(variable number of tandem repeats,VNTR)多态性.本研究检测MUC20基因在正常人群是否存在VNTR多态性及其分布情况,并探讨MUC20基因VNTR多态性与中国北方汉族人群IgA肾病临床病理表现及预后的关系.方法选取282名健康献血员和503名IgA肾病患者,采用PCR方法确定MUC20基因VNTR多态性,并对有代表性的结果进行测序验证.分析健康献血员的MUC20不同串联重复次数的等位基因和基因型分布情况.按重复次数多少分为小等位基因(S,重复次数<3次)与大等位基因(L,重复次数4次以上),IgA肾病病人相应分为SS、SL与LL组.收集IgA肾病患者临床病理资料,对其中113名患者进行3.5年±1.5年的随访.分析不同基因型与IgA肾病发病、临床、病理和预后的关系.结果 (1) 在健康人群中存在MUC20基因VNTR多态性,重复片段长度为57bp,重复次数为2～6次.其中重复次数为3次(R3)和4次(R4)的等位基因最多, 6次(R6)最少;基因型以R3R4最多见,其次为R3R3,R4R4,而R2R2,R3R6和R5R5最少见.(2)IgA肾病患者中MUC20等位基因及基因型的分布与健康对照之间没有明显差异.(3)SS、SL与LL基因型的IgA肾病患者之间性别、肾穿时年龄、血尿、高血压、蛋白尿、肾功能、血清IgA水平无明显差异.同时这三组之间肾穿时尿渗透压、尿NAG酶、α1-MG水平以及肾脏间质纤维化,小管萎缩等病理表现之间无明显差异.(4)SL/LL基因型较SS基因型进入终点事件(终末期肾衰竭/肌酐倍增)的危险性明显增高(OR=7.29, 95 % CI1.68～31.60,P=0.008).结论在健康人群存在MUC20基因VNTR多态性,R3和R4等位基因最多见,基因型以R3R4最多见.MUC20基因VNTR多态性与IgA肾病患者发病及临床表型无关,SL/LL基因型可能是IgA肾病进展的危险因子.     

精神分裂症与多巴胺D4受体基因多态性的关联分析

目的：在中国汉族人群中寻找散发精神分裂症与多巴胺D4受体（DRD4）基因第3外显子48bp片段可变数串联重复（VNTR）多态性的关系。方法：使用病例－对照的关联分析的方法。对符合诊断标准的510名精神分裂症患者／171名正常对照就DRD4基因第三外显子48bp VNTR的多态性进行检测并进行关联分析。结果（1）所检测人群48bp VNTR多态性表现国2－7次重复,4次重复的等位基因在精神分裂症患者及对照组中分别占78．6％及76．9％,2次重复分别占16．2％及19．3％;（2）精神分裂症患者与正常对照之间的基因型频率分布差异具有显著意义,病例组短重复序列的基因型（2／2,2／3）频率（3．3％）显著低于对照组（10．5％）（X^2=14．88,df=2,P=0.00);（3）病例组含4次重复的基因型比例（95．9％）显著高于对照组（88．3％）（X^2＝13．00,df＝1,P=0.000)。结论：中国精神分裂症人群DRD4基因第三外显子48bp VNTR多态性主要集中于4次重复片段,48bp的重复次数可能与精神分裂症相关,短重复序列减少或含4次重复的基因型增多可能增加对精神分裂症的易感性。     

海南地区484株结核分枝杆菌菌株基因型特征分析

目的 了解海南地区结核分枝杆菌不同基因型流行特征,探讨基因分型用于评价本地区结核病控制中的应用价值。方法 本研究选取海南医学院第二附属医院自2013-2016年所有培养阳性结核分枝杆菌484株,采用SNP和Gao等推荐的12位点可变数目串联重复序列（variable number tandem repeat, VNTR）进行基因分型。结果 2013-2016年期间,484株结核分枝杆菌菌株中,北京基因型菌株279株,占57.6%,非北京基因型菌株205株,占42.4%,北京基因型菌株中包括91株(32.6%)古代北京基因型和188株(67.4%)现代北京基因型。北京基因型所占比例在四年间无显著变化,从2013年的59.6%到2016年的57.6%。采用3个高变VNTR位点基因分型后,成簇菌株数为0。结论 海南地区结核分枝杆菌存在明显的VNTR基因多态性,主要流行株仍以北京基因型为主,北京基因型所占比例在四年期间无显著性变化,且菌株成簇率较低,提示近期传播率低。     

可变串联重复序列分析在辽宁省结核分枝杆菌基因分型中的应用

目的 了解辽宁省81例结核分枝杆菌多位点数目可变串联重复序列分析（variable number of tandem repeats,VNTR）的基因多态性及近期传播情况。方法 对2018年辽宁省内送至辽宁省疾病预防控制中心实验室的菌株进行传代后采用对硝基苯甲酸（p-nitrobenzoic acid, PNB）培养基进行菌群鉴定,以区分结核分枝杆菌复合体和非结核分枝杆菌。采用固体比例法利用罗氏培养基对4种一线抗结核药物进行药敏实验。以PCR为基础对标准24位点进行检测分析,利用RD105基因缺失法鉴定北京基因型。利用Microsoft Excel软件进行多态性分析,利用https://www.miru-vntrplus.org/MIRU/index网站得到VNTR基因分型结果,同时进行位点多态性和成簇率的计算。采用SPSS 23.0软件进行数据的统计描述,对计数资料或各年度耐药情况进行χ²检验;当理论频数<5时,采用Fisher确切概率法计算双侧P值,检验水准α=0.05。结果 经分析81株菌株可分为3个基因群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）,菌株数分别为1（1.23%）、4（4.94%）和76（93.83%）,其中最大的基因群为Ⅲ群。成簇率为4.94%（4/81）。近期感染率最小估计值为2.47%（2/81）。24个VNTR位点中有 5个位点的多态性较好,3个位点的多态性尚可,16个位点的多态性较差。结论 初步证实辽宁省耐药结核分枝杆菌菌株存在明显的基因多态性,其主要流行型为北京基因型（Ⅲ群）。     

注意缺陷多动障碍与多巴胺D4受体和多巴胺载体蛋白基因多态性的关系

目的：探讨中国汉族人群中，注意缺陷多动障碍(ADHD)与多巴胺D4受体基因(DR／M)第3外显子48bp和多巴胺载体蛋白基因(DAT1)非编码区40bp可变数目顺向重复(VNTR)多态性的关系。方法：对340个ADHD患儿，202个ADHD核心家系和226个对照分别就DRD4 48bp VNTR和DAT1 40bp VNTR多态性进行检测，并进行ETDT、HHRR和病例对照的关联分析。结果：所测人群中的DRD4 48 bp的重复次数是2—6次，最常见的等位基因是4次重复(77％)和2次重复序列(19．4％)；未发现7次重复序列或更长的片段。DAT1 40 bp的重复次数是6—7和9-11次，其中10次重复序列最常见(90．7％)。在ADHD患儿中，长重复等位基因(DRD4的4—6次和DAT1的11—12次重复序列)比对照组多。未发现ADHD和DRD4的7次重复等位基因或DAT1的10次重复等位基因之间存在关联。结论：DRD4(按照性别分层后)和DAT1的长重复等位基因可以增加中国汉族儿童罹患ADHD的危险性。     

腐食酪螨Tyr p 13克隆表达、纯化及免疫鉴定

目的 克隆腐食酪螨第13组变应原基因(Tyr p 13),表达纯化其重组蛋白,并进行免疫学特性鉴定,利用生物信息学软件分析该过敏原抗原表位等信息。方法 挑取腐食酪螨,提取螨总RNA。逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增cDNA,根据已知的Tyr p 13基因序列(GeneBank登录号 AY710432.1)设计引物,PCR大量扩增目的基因。构建原核表达载体pET-32a(+)-Tyr p 13,转化感受态细胞E. coli Rosetta (DE3),用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导目的蛋白表达;层析纯化表达产物,免疫印迹(Western Blot)法检测纯化后的表达产物免疫学活性;通过生物信息学软件推测其抗原表位、构建进化树。结果 克隆得到的序列经基因测序可知其长度约400 bp,其表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分子量约为14 kD,呈可溶性表达。免疫印迹结果显示,Tyr p 13能够与过敏患者血清IgE特异性结合,表明其具有过敏原性;表位分析进一步证实该过敏原具有免疫原性。结论 经克隆表达、纯化后得到纯度较高的腐食酪螨Tyr p 13,为进一步开展临床特异性诊断和治疗提供参考。     

肾素基因新的VNTR多态性与原发性高血压

目的扫描肾素基因发现新的多态性,探讨新多态性与原发性高血压相关性。方法运用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)方法,对肾素基因外显子4—8进行扫描,以发现新的多态性;在日本人212例原发性高血压(essential hypertension,EH)者和209例正常血压(normotension,NT)者中进行病例对照研究。结果PCR—SSCP法发现外显子8上游第18碱基对处内含子7区域可变数目串联重复序列(VNTR),DNA测序确定此多态性为重复7—12次的TCTG。病例对照研究显示VNTR基因型频率在原发性高血压和正常血压组中无显著性差异。结论本文发现的肾素基因新的VNTR多态性与原发性高血压无相关性。