约氏疟原虫感染大鼠和小鼠的红外期研究

约氏疟原虫约氏亚种的子抱子经尾静脉接种大鼠和三株小鼠(ICR/JCL,C57BL,KM株)后42h,在大鼠和小鼠的肝连续切片中均查见红外期裂殖体(EE裂殖体),但在KM鼠株的切片中,正常的EE裂殖体甚少。不论宿主同否,EE裂殖体均大小不等,呈圆形、椭圆形或其他形状,分化程度不同,发育不完全同步。大鼠肝中的EE裂殖体可看到明显的外膜,周围并出现细胞反应。ICR/JCL、C57BL鼠株和大鼠肝中的EE裂殖体均较KM鼠株发育良好,数量较多,但大鼠中的红内期迅速消失。结果表明;ICR/JCL和C57BL鼠株用作约氏疟原虫—斯氏按蚊系统鼠疟模型的宿主较合适。     

西咪替丁抗疟作用的研究 Ⅳ.感染疟原虫小鼠血清4种元素含量比较

应用ＩＣＰ－４００型等离子原子发射光谱仪检测感染伯氏疟原虫氯喹敏感株（Ｐ．ｂＣＱＳ）、抗性株（Ｐ．ｂＣＱＲ）和约氏疟原虫氯喹敏感株（Ｐ．ｙＣＱＳ）小鼠血清的Ｚｎ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｃａ４种元素含量。结果显示：与正常组比较，３株虫感染组中，Ｃｕ的含量均明显增高（Ｐ＜０．００１），Ｃａ的含量均明显降低（Ｐ＜０．００１）；Ｚｎ值在Ｐ．ｂＣＱＳ组显著降低；Ｆｅ值在Ｐ．ｙＣＱＳ组中显著增高。Ｐ．ｂＣＱＳ组与Ｐ．ｂＣＱＲ组在西咪替丁及氯喹作用下，元素变化有组间差异。     

西咪替丁抗疟作用的研究：Ⅳ.感染疟原虫小鼠血清4种元素含？…

应用ＩＣＰ－４００型等离子原子发射光谱仪检测感染伯氏疟原虫氯喹敏感株（Ｐ．ｂＣＱＳ）、抗性株（Ｐ．ｂＣＱＲ）和约氏疟原虫氯喹敏感株（Ｐ．ｙＣＱＳ）小鼠血清的Ｚｎ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｃａ４种元素含量。结果显示：与正常组比较，３株虫感染组中，Ｃｕ的含量均明显增高（Ｐ〈０．００１），Ｃａ的含量均明显降低（Ｐ〈０．００１）；Ｚｎ值在Ｐ．ｂＣＱＳ组显著降低；Ｆｅ值在Ｐ．ｙＣＱＳ组中显著增高．Ｐ．ｂＣＱＳ组与Ｐ．ｂ     

西咪替丁抗疟作用的研究 Ⅲ.西咪替丁对感染疟原虫小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响

应用ＷＨＯ４ｄ抑制原虫法及［３Ｈ］－ＴｄＲ掺入淋巴细胞转化试验，观察西咪替丁（ＣＭＤ）对感染疟原虫小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响。结果显示：ＣＭＤ对感染伯氏疟原虫氯喹敏感株、抗性株及约氏疟原虫氯喹敏感株小鼠的原虫率较其感染未治组明显降低（Ｐ＜０．０１），对其脾淋巴细胞转化试验ＳＩ均明显增高。ＣＭＤ体内及体外作用，单独及与ＣｏｎＡ联合作用，各实验组ＳＩ均显著高于对照组。ＣＭＤ对感染疟原虫小鼠脾淋巴细胞具有刺激增殖作用。     

蚊期和红内期持续表达绿色荧光蛋白的重组约氏疟原虫

目的 构建蚊期、红内期持续表达绿色荧光蛋白（GFP）的约氏疟原虫BY265株。 方法 用SacⅡ酶酶切含有伯氏疟原虫ssu-rrna基因和GFP基因的重组质粒pl0017使之线性化,用电转化的方法将该重组质粒转化入红内期约氏疟原虫BY265株,获BY265-EGFP重组疟原虫,尾静脉注射感染昆明小鼠,24～30 h后用乙胺嘧啶饲喂小鼠5～6 d,鼠尾静脉采血涂片观察原虫感染率。以疟原虫基因组DNA为模板,PCR鉴定转染重组质粒pl0017的约氏疟原虫。斯氏按蚊叮咬感染BY265-EGFP重组疟原虫的小鼠,按蚊血餐后第7天和第16天解剖蚊胃和唾液腺,观察疟原虫能否在蚊体内正常发育。 结果 荧光显微镜观察到呈绿色荧光的红内期各期形态正常的约氏疟原虫。PCR检测结果表明,GFP和ssu-rrna基因已成功整合到约氏疟原虫基因组中。按蚊感染实验证实重组BY265株能在蚊体内正常发育。 结论 构建了蚊期、红内期持续表达绿色荧光蛋白的约氏疟原虫。     

约氏疟原虫感染不同小鼠免疫分子的应答差异

目的探讨在约氏疟原虫感染过程中不同宿主的免疫应答差异。方法以约氏疟原虫（致死型）感染DBA／2和BALB／c小鼠，计算红细胞感染率；收集感染前和感染后1、3、6、9、12、15、20d小鼠血清，并无菌取出脾脏，培养脾细胞。应用ELISA试剂盒检测小鼠血清中IFN-γ和IL-12水平，并通过Griess方法检测脾细胞培养上清中NO含量。结果DBA／2小鼠的原虫血症峰值水平明显低于BALB／c小鼠，并于感染后第20d左右自愈；BALB／c小鼠于原虫血症达到峰值水平后全部死亡；DBA／2小鼠的IFN-γ和IL-12水平于感染后1d即出现了有意义的升高并持续到第20d；BALB／c小鼠的IFN-γ和IL-12水平仅干感染后1d出现了有意义的升高；DBA／2小鼠NO的产生于感染后3d出现了有意义的升高，第6d达到峰值，而BALB／c小鼠的NO水平始终未见明显升高。结论DBA／2小鼠通过感染早期Th1细胞免疫应答的有效建立能够抑制原虫血症，IL-12是启动并维持Th1细胞免疫应答的关键性细胞因子。     

西咪替丁抗疟作用的研究：Ⅲ.西咪下对感染疟原虫小鼠脾…

应用ＷＨＯ４ｄ抑制原虫法及「＾３Ｈ」－ＴｄＲ掺入淋巴细胞转化试验，观察西咪替丁对感染疟原虫小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响。结果显示；ＣＭＤ对感染伯氏疟原虫氯喹敏感株，抗性株及约氏疟原虫氯喹敏感株小鼠的原虫率较其感染未治明显降低，对其脾淋巴细胞转化试验ＳＩ均明显增高。     

夏氏、伯氏鼠疟原虫实验感染状况比较

用夏氏、伯氏疟原虫血传感染小鼠，采尾血制薄血片，姬氏染色，计１万个红细胞内疟原虫感染数。结果不同虫种同等数量或同虫种不同数量原虫其红细胞感染率不同，均有高度显著性差异。昆明鼠对夏氏疟原虫不敏感；对伯氏疟原虫敏感度高，易接种成功。血传伯氏疟原虫以１０５红细胞感染数为宜，其红细胞感染率高，原虫密度上升速度较快，动物不易死亡。     

约氏疟原虫感染对小鼠黑色素瘤的抑制作用

目的观察约氏疟原虫17XL虫株感染对小鼠黑色素瘤的抑制作用。方法取C57BL/6小鼠20只,腋下注射传代培养的B16F10黑色素瘤细胞;次日,将小鼠随机分为约氏疟原虫(P.y)感染组和对照组2组,10只/组;P.y感染组小鼠每只腹腔注射1×106个含虫红细胞率为20%的小鼠红细胞;对照组小鼠腹腔注射等量的C57BL/6小鼠正常红细胞。观察两组小鼠黑色素瘤出瘤时间并测量肿瘤的体积。结果 P.y感染组小鼠黑色素瘤出瘤时间为注射黑色素瘤细胞后(11.30±0.21)d,晚于对照组[(10.40±0.22)d](P0.05);自可精确测量瘤体起至实验终点,2组小鼠肿瘤均不断增长,P.y感染组瘤体体积均显著小于对照组(P均0.05);P.y感染组瘤体生长速度为(71.10±6.29)mm3/d,明显慢于对照组[(302.80±49.94)mm3/d](P0.05),且P.y感染组肿瘤每日生长速度亦明显慢于对照组(P均0.05)。结论约氏疟原虫感染可以延缓肿瘤出瘤时间,且对小鼠黑色素瘤瘤体的增长具有明显的抑制作用。     

西咪替丁抗疟作用的研究Ⅱ.西咪替丁对鼠疟的影响

西咪替丁（ＣＭＤ）４ｄ抑制法抗鼠疟作用结果显示：在剂量为５０ｍｇ／ｋｇ·ｄ、１００ｍｇ／ｋｇ·ｄ和２００ｍｇ／ｋｇ·ｄ时，该药对伯氏疟原虫氯喹敏感株、抗性株及约氏疟原虫氯喹敏感株感染小鼠的红内期疟原虫，均有明显的抑制作用，３组平均抑制率分别为６４．９５％、７７．９７％和５８．１６％。ＣＭＤ对伯氏疟原虫氯喹抗性株的抑制作用显著高于伯氏疟原虫氯喹敏感株（Ｐ＜０．０５）和约氏疟原虫氯喹敏感株（Ｐ＜０．０１）。     

特异性IgG抗体作为宿主抗约氏疟原虫再感染关键效应分子的研究

目的探讨再感染早期宿主保护性免疫应答的相关机制。方法采用致死型约氏疟原虫(Plasmodiumyoelii 17XL,Py17XL)感染抵抗型DBA/2小鼠,待全部小鼠自愈后用同种疟原虫株再次攻击。吉姆萨薄血膜染色法观察小鼠原虫血症水平;被动转移实验评估免疫血清的保护性作用;流式细胞仪检测脾中T、B细胞亚群动态变化。结果2/3小鼠能够完全抵御同种疟原虫再感染,仅1/3小鼠出现一过性低水平原虫血症,且于再感染后第8d自愈;免疫血清显著抑制初次感染小鼠原虫血症水平并延长其生存期;与初次感染相比,再感染早期脾CD4+T细胞、B220+和B220lowCD138+(浆细胞)亚群数目显著增加。结论特异性IgG抗体在宿主抗再感染免疫中发挥重要作用,记忆性T、B细胞可能为宿主保护性免疫应答的关键参与者。     

青蒿琥酯治疗对约氏疟原虫感染小鼠特异性免疫建立的影响

目的阐明青蒿琥酯治疗对约氏疟原虫感染小鼠特异性免疫建立的影响。方法DBA/2和BALB/c小鼠经腹腔感染约氏疟原虫后均分为三组:感染后未治疗组、感染第3天和第6天青蒿琥酯治疗组。初次感染痊愈后30天用同种疟原虫再次感染,再感染疟原虫清除后30天进行第三次感染,观察每次感染后小鼠原虫血症水平和对重复感染的特异性抵抗能力。结果未治疗的自然自愈组和不同时间治疗组的DBA/2小鼠,其再次感染的感染率、原虫血症水平基本相同,第三次感染均未见疟原虫感染的红细胞;除非治疗组BALB/c小鼠于初次感染早期死亡外,不同时间治疗组的BALB/c小鼠再次感染的感染率与虫体血症水平、第三次感染情况与各组DBA/2小鼠也无差异。结论对于约氏疟原虫初次感染免疫应答能力不同的DBA/2和BALB/c小鼠,青蒿琥酯根治性治疗不影响其特异性免疫的建立和免疫记忆性的维持。     

鼠疟原虫裂殖子进入红细胞后的早期超微结构演化

为了探讨疟原虫红内早期超微结构的演化，用透射电镜观察了伯氏和约氏疟原虫。裂殖子入侵后补围于内陷红细胞膜所构成的纳虫泡中，起初停留于浅层红细胞浆内，造成该处表面隆起。虫体浑圆，顶端结构很快消失，球形体与核和线粒体分离并萎缩。分离了的线粒体略显舒展，内质网扩大。核变长弯形，核周隙有部分地扩大。双层内膜渐与外膜分离，断裂、卷曲、以至消失。最后变成单层质膜的滋养体。早期滋养体的组织结构仍较精细，以后密度逐渐减低。胞浆内有个别多角形的大内质网池，质膜下出现小食物泡。然后虫体变扁平，边缘卷起，包围红细胞浆，终至封口融合，形成一个食物泡；接着在其旁出现消化泡和色素粒。长成更大的中期滋养体。     

脂多糖对约氏疟原虫感染DBA/2小鼠感染早期的免疫调节作用

目的本文主要探讨脂多糖（LPS）在致死型约氏疟原虫（Plasmodium yoelii 17×L,Pyl7×L）感染早期的调节作用。方法 6～8w、雌性DBA/2小鼠,随机分为实验组和对照组,经腹腔接种1×106 Pyl7XL寄生的红细胞。实验组于感染后d2静脉给予LPS（25μg/只）。动态观察两组小鼠的原虫血症水平,小鼠脾脏树突亚群及其表面TLR4和活化T细胞的表达水平。结果 （1）两组小鼠于感染后约d15均自愈,LPS处理组小鼠的原虫血症水平在感染后d5-8显著低于对照组;（2）与对照组相比,在感染后d3和d5,LPS处理组小鼠脾脏DCs亚群表达水平显著升高,在感染后d3,TLR4表达水平显著升高。在感染后d5,LPS处理组小鼠脾脏细胞培养初始活化T表达水平显著升高。结论在P.y17×L感染早期,LPS可通过激活TLR4强化DC成熟进一步强化Th1免疫应答反应,降低原虫血症,这将为疫苗的开发提供新的靶点。     

约氏疟原虫红内期感染小鼠的免疫反应及IL－2、IFN－γ免疫调节作用的研究

在原虫血症上升期，致死株约氏疟原虫（Ｐ，ｙ，）感染鼠脾细胞的增殖反应受到抑制，无γ－干扰素（ＩＦＮ－γ）产生，血清中未产生特异抗体，仅产生与正常鼠相同的白细胞介素２（ＩＬ－２０）；与此不同，非致死株Ｐ．ｙ．感染鼠脾细胞增殖反应增强，产生ＩＦＮ－γ及更多的ＩＬ－２，血清中还无特异抗体产生。在原虫血症下降期，脾细胞的增殖反应升高，较上升期有更多的ＩＬ－２及ＩＦＮ－γ生成，体内血清中出现滴度较高的特异抗体。免疫鼠脾细胞的增殖反应较前两者明显升高，体内血清特异抗体水平亦明显上升，ＩＬ－２及ＩＦＮ－γ水平与感染鼠原虫下降期相同。表明在Ｐ．ｙ．感染小鼠中，致死株的初次感染可抑制细胞免疫，非致死株在原虫上升期即可出现细胞免疫。原虫下降期细胞免疫功能进一步增强，高水平抗体生成在清除原虫中可能起重要作用     

约氏疟原虫感染小鼠白细胞介素—2的观察

用非致死性约氏疟原虫对C57BL/6J、NIH和ICR小鼠进行初次感染和对初次感染阴转后的NIH小鼠再次感染,观察其原虫血症并测定小鼠感染过程中其脾脏淋巴细胞在Con A或约氏疟原虫抗原诱生的白细胞介素-2(IL-2)水平。结果:(1)C57BL/6J、NIH和ICR小鼠感染前Con A诱生的IL-2水平(SI的X±SE)分别为223.71±19.32、122.13±28.91和72.76±30.60,初次感染后最高原虫血症(％的X±SE)分别为2.70±0.29、14.50±2.75和31.30±1.80;提示,这3种小鼠感染前固有的Con A诱生的IL-2水平高低可能影响其对约氏疟原虫初次感染的易感性。(2)NIH小鼠初次接种约氏疟原虫后34d,抗原诱生的IL-2才出现;而再次接种后d_3、d_(19)IL-2水平升高,并使这些小鼠对再次感染有明显的抵抗力。这提示抗原诱生的IL-2与鼠疟保护性免疫的调节有关。     

影响约氏疟原虫红细胞外期发育因素的研究

采用正交试验设计,观察环境温度、光照周期、脾脏切除和雌激素水平对大鼠体内约氏疟原虫红细胞外期生长发育的影响。结果显示:脾脏在清除子孢子方面有重要作用,切脾组的红外期原虫密度显著高于对照组;雌激素水平的升高则明显抑制红外期的发育。低温环境对红外期的密度虽无明显影响,但使之发育变缓,不同步更为显著。光照周期的长短似乎对红外期的生长发育无明显影响。两种因素交互作用时,脾脏切除和雌激素水平升高的影响相互抵消,其他两两因素的作用,经方差分析,均未见显著性差异。     

伯氏疟原虫红内期融合抗原的构建、表达及其免疫原性研究

目的 合成伯氏疟原虫红内期融合抗原基因PbCP-2.9，在毕赤酵母真核系统中表达其产物，并进行免疫原性分析。 方法 选取与恶性疟原虫红内期融合抗原基因PfCP-2.9具有同源性的伯氏疟原虫AMA1（Ⅲ）和MSP1-19序列，融合形成PbCP-2.9基因。基因序列经密码子优化，在毕赤酵母中分泌表达。60只BABL/c小鼠均分为6组，其中蛋白免疫组3组，分别用PbCP-2.9蛋白与福氏佐剂、ISA206和IMS1312佐剂乳化后，皮下注射免疫小鼠，抗原免疫剂量20 μg/只·次，注射体积200 μl，共免疫3次，每次间隔2周。佐剂对照组3组，以 PBS代替免疫抗原同法免疫。免疫前及每次免疫后1周鼠尾取血，分离血清。用ELISA和IFAT方法检测血清中特异性抗体的滴度及其与天然抗原的反应结果。 结果 PbCP-2.9基因在毕赤酵母中分泌表达出Mr约26 400的 PbCP-2.9蛋白，其与抗伯氏疟原虫红内期原虫的血清能进行特异性反应；ELISA检测PbCP-2.9蛋白免疫组结果表明，福氏佐剂组第2次免疫后特异性抗体滴度为(52.62±11.26), 第3次免疫后为( 94.50±52.84); ISA206 组第2次免疫后为(7.59±5.61), 第3次免疫后为( 25.60±16.92) ; IMS1312组第2次免疫后为(9.41±8.86), 第3次免疫后为( 28.92±12.98)。福氏佐剂组第2次免疫后特异性抗体滴度分别为ISA206 组的6.9和IMS1312组的5.6倍（F＝81.06，P＜0.01），第3次免疫后分别为ISA206 组的3.7和IMS1312组的3.3倍（F＝13.29，P＜0.01）。IFAT检测结果显示，经PbCP-2.9免疫的鼠血清与Pb ANKA株虫体表面抗原有阳性反应。 结论 PbCP-2.9基因在毕赤酵母中高效表达，重组抗原免疫原性强，其免疫血清能识别伯氏疟原虫天然抗原。     

IL-6对大鼠体内约氏疟原虫红外期发育的影响

目的观察ＩＬ－６对大鼠体内约氏疟原虫红外期发育的影响。方法子孢子（Ｓｐ）接种前２ｈ给Ｗｉｓｔａｒ大鼠腹腔注射１００００ＵｒＨｕＩＬ－６,４２ｈ后活杀、常规制肝切片,观察Ｓｐ发育率,外期原虫（ＥＥＦ）直径。大鼠在接种Ｓｐ前３ｈ、０．５ｈ分别经尾静脉注射１００００Ｕ、３００００ＵｒＨｕＩＬ－６,经肠系膜静脉灌注２８万Ｓｐ,１ｈ后制备肝脏样品,用电镜观察结果。结果与对照组比较,１００００ＵｒＨｕＩＬ－６对约氏疟原虫Ｓｐ发育率没有显著影响,但ＥＥＦ直径明显变小。Ｓｐ接种１ｈ后肝细胞内可见形态退变的Ｓｐ。结论ＩＬ－６作为一种免疫效应分子可抑制大鼠体内约氏疟原虫ＥＥＦ的发育。