RT-PCR方法检测单核细胞增生李斯特活菌研究

目的:建立单核细胞增生李斯特活菌快速检测技术,解决PCR带来的假阳性问题。方法:采用以mRNA为基础的RT-PCR方法对单核细胞增生李斯特氏菌的hlyA基因进行检测,设计引物,扩增,并作了特异性和灵敏度比较。结果:该引物能较好地扩增单核细胞增生李斯特菌的特异性片断,而对其它的李斯特菌以及常见食源性致病菌无特异性扩增条带;检测的灵敏度纯菌可达到1×104cfu/m l,人工污染样品猪肉、虾肉和牛奶等培养12~16 h,可达4.5 cfu/m l(g)。结论:可以应用该方法对样品中单核细胞增生李斯特活菌进行检测,能较好地解决PCR检测所带来的假阳性问题。     

应用液相芯片技术快速检测常见食源性致病菌的研究

目的建立一种基于多重PCR技术联合液相芯片技术快速、准确同时检测沙门菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌的方法。方法针对5种食源性致病菌的目标基因设计特异性的引物探针,建立5种食源性致病菌的多重PCR检测方法,将PCR产品与偶联核酸探针的微球混合物进行杂交,利用液相芯片检测仪来检测杂交结果,并对检测方法的重复性、灵敏度、特异性进行评价,以及使用实际样本对该方法进行初步验证。结果该方法检测5种食源性致病菌,重复性良好,变异系数均2%;沙门菌inv A与霍乱弧菌hly A的检测灵敏度为50 cfu/ml,单核细胞增生李斯特菌Hly、金黄色葡萄球菌Sa442、副溶血性弧菌toxR的检测灵敏度为100 cfu/ml;检测的特异度为100%。结论本研究建立的液相芯片检测方法能快速、准确、特异地同时检测沙门菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌5种常见的食源性致病菌。     

食品中单增李斯特菌PCR检测方法建立与评价

目的建立单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）快速、敏感、特异的PCR诊断方法。方法采用聚合酶链式反应技术（PCR）特异性扩增单核细胞增生李斯特菌溶血素基因（hlyA），并评价该方法的特异性与敏感性。结果在706bp处出现nuc基因的目的片断，只有单增李斯特菌的目的片段获得扩增，其他菌种扩增均呈阴性；该方法可以检测到3．3ng／L的DNA。结论PCR方法比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便。为食品中单增李斯特菌的快速检测提供了新的手段。     

食品中单核细胞增生李斯特菌PCR快速检测方法

[目的]建立食品中单核细胞增生李斯特菌的快速、敏感、特异的PCR检测方法。[方法]选择Hly基因作为靶序列设计一对引物，用该引物对单增李斯特菌和10株非单增李斯特菌进行PCR扩增，并且用此方法对30份食品进行检测。[结果]扩增片断表现出极好的单增李斯特菌特异性，最低检出限为190cfu/ml。[结论]本实验建立的PCR检测方法为一种简便、快速、敏感、特异的单增李斯特菌检测方法。     

荧光实时定量PCR检测单核李斯特菌方法学建立及应用

目的 建立检测单核细胞增多性李斯特菌的荧光定量PCR方法，并利用此方法检测人工污染的牛奶中单增李斯特菌菌量。方法 选择单增李斯特菌特异性的基因Listeriolysin O基因为靶目标设计引物，采用煮沸法抽提纯单增李斯特菌株（1／2a）DNA，建立SYBRGREEN实时定量PCR检测体系：结果 定量PCR对李斯特菌可产生特异扩增信号，对其他菌（大肠杆菌）无响应。标准曲线的相关系数为0．9521。最小检菌量约为100个菌落形成单位／反应体系。在人为污染牛奶检测中，与传统细菌计数方法结果相比，相关系数为0．839。结论 实时定量PCR是一种快速、灵敏的定量检测单增李斯特菌的方法，可用于牛奶样品的检测。     

单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测技术研究

目的建立快速检测单增李斯特菌的PCR-ELISA方法,将其应用于人工污染的食物样品检测。方法根据GenBank数据库资料,应用分子生物学软件DNAMAN6.0和Primer Premier5.0,以单增李斯特菌的致病基因hlyA为基础,选用PCR引物,应用地高辛标记试剂盒,获得单增李斯特菌特异的地高辛标记片段。根据PCR目的片段序列,设计特异性捕获探针,建立了单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测方法。应用该方法对不同血清型的单增李斯特菌食品分离株进行了检测,并将PCR方法与PCR-ELISA方法对人工污染单增李斯特菌的牛奶样品的检测敏感性进行了比较。结果应用单增李斯特菌特异的PCR-ELISA方法完成检测约需6h。该方法对单增李斯特菌分离株检测的结果,与国家食源性疾病检测网的鉴定结果100%符合。经过12h的增菌培养,PCR-ELISA方法最低可从25ml样品中检出1CFU,检测敏感性为传统PCR方法的10～100倍。结论建立了单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测方法。该方法敏感性高、特异性强、可靠性好,对于提高食源性疾病预警、预测能力,增强检测的时效性和准确性,具有推广应用价值。     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法研究

[目的 ]　建立一种快速准确检验食品中单核细胞增生李斯特氏菌的方法。　 [方法 ]　以miniVIDAS仪结合API系统 ,将该法与传统方法进行比较。　 [结果 ]　该方法能检出 <10个 /mL模拟样品中的单核细胞增生李斯特氏菌 ,与食品中常见的细菌无交叉反应 ,能对非单核细胞增生李斯特氏菌作出正确鉴定。在 4天内能作完全鉴定结果。对 2 2 6份实样的检测 ,检出率为 11.5 %。　 [结论 ]　以miniVIDAS仪结合API系统建立的方法具有特异性好、灵敏度高、快速简便的特点 ,是一种较好的检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法     

多重-巢式PCR检测食品中单增李斯特菌研究

〔目的〕建立多重—巢式PCR联合检测体系快速检测食品中的单增李斯特菌。〔方法〕针对单增李斯特菌中多个稳定的特异性基因(hlyA、plcB、prfAi、ap),设计并筛选出6对引物用于多重PCR、2对引物用于巢式PCR,组成多重—巢式PCR联合检测单增李斯特菌,并对珠海地区6类冷冻冷藏食品中单增李斯特菌的带菌情况进行了初步调查。〔结果〕建立的多重—巢式PCR联合检测体系特异性良好,多重PCR的灵敏度达到1×102cfu/ml,巢式PCR的灵敏度达到1×101cfu/ml。在检测的3439份样品中,单增李斯特菌阳性率达22.39%。〔结论〕该检测体系具有快速可靠、灵敏准确及特异性好的特点,有效缩短了检验周期,从传统的14d缩短到2d。对珠海地区6类冷冻冷藏食品中单增李斯特菌的带菌情况有了一定了解。     

3种方法鉴定单核细胞增生李斯特菌比较

[目的]采用分子生物学方法(accuprobe和PCR)对传统方法经ATB鉴定为单核细胞增生李斯特菌和疑为单核细胞增生李斯特菌的菌株进行鉴定比较,建立灵敏,快速,可靠的鉴定方法。[方法]对经传统方法结合ATB鉴定分离的菌株(单核细胞增生李斯特菌)分别采用accuprobe和PCR试剂盒进行鉴定比较。[结果]对10株经传统方法结合ATB鉴定的Lm菌(包括疑似Lm菌)经PCR鉴定,3株为阳性,7株为阴性,与accuprobe法鉴定结果一致。[结论]分子生物学方法检测单核细胞增生李斯特菌是对传统方法的有效补充,可用于大批量样品中致病菌的快速鉴定     

单核细胞增生李斯特菌测试片检测性能研究

目的评价单核细胞增生李斯特菌测试片的检测性能。方法将本实验室研制的单核细胞增生李斯特菌测试片与李斯特菌培养基和国家标准方法进行对比。通过接种单核细胞增生李斯特菌和10种其他标准菌株,评价了测试片敏感性和特异性。使用测试片定量检测单核细胞增生李斯特菌标准菌悬液和15个人工染菌样品,并与李斯特菌培养基进行对比,对结果进行统计分析。定性试验测试了150个自然样品,并与国家标准方法进行对比。结果测试片特异性良好;灵敏度可以达到2 cfu/ml;标准菌悬液和15个人工染菌样品定量检测结果显示,测试片与李斯特菌培养基比较差异有统计学意义(P0.05)。对150个自然样品测试结果与国家标准方法总符合率为96.00%,无假阴性。结论单核细胞增生李斯特菌测试片定量检测标准菌与李斯特菌培养基效果有差异,可用于自然样品中单核细胞增生李斯特菌的快速初筛。     

PCR检测食品中单核细胞增生性李斯特菌毒力基因

目的 检测食品中分离的单核细胞增生性李斯特茵毒力基因携带率。方法 应用GB4789．30-94单核细胞增生性李斯特菌的检验方法分离菌株，采用PCR检测李斯特菌的两种致病因子。结果 从2000．2001年我省采集的272份食品中分离出35株单核细胞增生性李斯特菌。其中11株含有内化素基因(Internalin，Inl)和李斯特菌溶血素O基因(Listerialysin0，Hly)，1株仅含有内化素基因；其它23株两种基因均为阴性。结论 我省存在发生李斯特菌食物中毒的潜在危险。建立PCR方法检测李斯特菌毒力基因对快速诊断单核细胞增生性李斯特菌有现实意义。     

荧光PCR法与细菌培养法在食源性致病检测中的应用

目的:通过荧光PCR法与细菌培养法在食源性致病菌检测中的应用,比较两种方法的敏感性、特异性、时限性、重复性。方法:2009年1月-2010年12月采集的样品进行常见食源性致病的细菌培养,随机抽取一部分样品进行荧光PCR检测。结果:细菌培养法在257份样品中检出单核细胞增生李斯特菌5株、金黄色葡萄球菌5株,检出率3.9%。所检出致病菌经荧光PCR法符合结果,符合率100%。随机抽取各类产品的20%共计49份样品进行沙门菌、大肠埃希菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌等核酸试剂盒检测。结果检出沙门菌1份、金黄色葡萄球菌2份、单核细胞增生李斯特菌1份、副溶血弧菌1份,其余致病菌核酸检测均未检出,检出率10%。结论:与传统的细菌培养法相比,荧光PCR法可提高食源性致病菌的检出率、缩短检出时间、适用于食源性致病菌的检测。     

应用Taqman实时PCR法检测猪肉中单核细胞增生李斯特菌

目的建立敏感快速的检测猪肉中单核细胞增生李斯特菌的实时PCR方法。方法以hlyA基因为靶标,建立并验证实时PCR法的特异性。选用单核细胞增生李斯特菌CMCC 54004,制备不同浓度的纯菌液,用实时PCR进行检测,制作标准曲线并计算扩增效率。进行人工染菌实验,染菌量分别为每25g猪肉样本1.3×100、1.3×101、1.3×102、1.3×103、1.3×104、1.3×105和1.3×106CFU。分别在增菌0、4、8、12、18、24、30、36和46 h取1 ml培养液,提取DNA进行实时PCR检测,并用PCR和传统方法进行检测,比较3种方法检测的敏感性和特异性。采集24份市售猪肉样本,用这3种方法进行检测,进一步比较三者的阳性检出率。结果建立的实时PCR法特异性好,对纯菌液的检出限为1.3×103CFU/ml。人工染菌样本增菌24 h后,实时PCR检出限1.3 CFU/25 g,PCR及传统方法达到这一检出限需要增菌46 h。根据增菌24 h的检测结果,建立实时PCR样本标准曲线。24份猪肉样本,实时PCR检出17份阳性,阳性率70.83%(17/24),与PCR和传统方法的阳性率一致。根据所得的样本标准曲线,对检测样本进行定量分析,确定了阳性样本中初始含量菌。结论所建立的实时PCR具有快速简便、敏感特异等优点,整个操作可在27 h内完成,适用于猪肉中单核细胞增生李斯特菌的快速定量检测。     

单增李斯特菌不同PCR快速检测方法比较

目的 比较3种PCR快速检测方法在检测单核细胞增生李斯特菌时的特异性和灵敏度方面的差异.方法 针对单核细胞增生李斯特菌的毒力基因iap和prfA基因,分别设计引物,进行单个PCR、多重PCR、套式PCR等3种方法检测.结果 3种PCR方法均具有较强的特异性;套式PCR的灵敏度为102 cfu/ml,高于单个PCR(103cfu/ml)和多重PCR(104cfu/ml).结论 多重PCR在特异性检测方面具有优势,而在灵敏度方面,套式PCR要明显优于单个及多重PCR方法.     

Taq Man-MGB探针Real-timePCR快速检测单增李斯特菌的研究

目的：建立TaqMan—MGB探针Real—time荧光PCR快速检测单增李斯特菌技术。方法：在对单增李斯特菌invA序列进行分析、比较基础上，设计一对特异性TaqMan—MGB探针法引物及探针，通过Real—timePCR反应条件和反应体系的优化，实现对单增李斯特菌的快速检测；用克隆到pMD18-T载体上的李斯特菌invA基因阳参片段及不同菌株、食品标本验证方法的特异性和敏感性。结果：方法的灵敏性高，其循环阈值与模板浓度的对数值具有很好的对应关系，最低可检测57个拷贝数，经18h增菌，可检测低至4．5cfu／ml的细菌；特异性强，检测6株单增李斯特菌标准株和100株单增李斯特菌样品分离株的PCR循环域值（cT值）均小于25，而90株威氏李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌以及非李斯特菌PCR循环域值（CT值）大于35；快速，最快1h可出结果，实际样品20h可出结果，而常规细菌培养法需要一周以上；对103份速冻米面食品进行检测，13份阳性，与常规方法无显著性差异（P〉0．05）。结论：TaqMan—MGB探针的单增李斯特菌Real—time荧光PCR检测方法具有特异性强，敏感性高，易操作等优点，可推广应用。     

实时荧光定量PCR法与常规PCR法及细菌培养法检测单增李斯特菌的比较

目的：比较实时荧光定量PCR法、常规PCR法及细菌培养法检测单核细胞增生性李斯特菌的灵敏度与特异性。方法：采用建立的实时荧光定量PCR、常规PCR及传统细菌培养法3种方法,同时对单核细胞增生性李斯特菌等细菌进行检测。结果：实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达19 cfu/ml,且有很高的特异性,对英诺克李斯特菌等10种相关细菌均无交叉反应,从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论：实时荧光定量PCR检测由于在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,且是3种方法中最为快速敏感的方法,适用于公共卫生应急疫情的实验室快速诊断。     

显色培养基在单核细胞增生李斯特菌快速检测中的应用研究

目的:研究显色培养基对单核细胞增生李斯特菌的检测效果,探讨建立新型快速检测方法。方法:检测按国标GB4789-33程序进行。结果:人工污染样品和实际样品检测中,显色培养基CHROM agar L isteria和HKL isteria与传统平板OXA和MMA可以达到相同的检测限和灵敏度,且具有更高的特异性。结论:用显色培养基检测单核细胞增生李斯特菌是一种新途径,可大大提高检测效率。     

单核细胞增生李斯特菌PCR鉴定技术的研究

目的建立单核细胞增生李斯特菌PCR鉴定技术.方法选择Hly Inl基因设计扩展片段分别为300～400bp、600～700bp的二对特异性引物,进行PCR扩增.结果单增李斯特菌标准菌株及本实验室分离保存的单增李斯特菌均扩增出两条明显条带,其它食品中常见致病菌及非单核细胞增生李斯特菌均不见扩增条带.52株李斯特菌生化符合菌中,有30株菌同时扩增出两条明显条带,与Mini-VIDSA测定法比较,两者符合率达92.31%.结论本实验建立的PCR鉴定技术为一种简便、快速、敏感、特异的单增李斯特菌鉴定方法.     

三种食源性致病菌多重PCR检测技术建立及应用研究

目的建立多重PCR方法同时检测水产品中沙门菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特菌。方法分别以沙门菌invA基因、副溶血性弧菌toxR基因和单核细胞增生性李斯特菌iap基因为靶基因,建立并优化了同时检测水产品中这3种致病菌的多重PCR体系,扩增产物分别为495bp(invA)、368bp(toxR)和660bp(iap)。结果建立的多重PCR方法可以简便、快速、灵敏地实现水产品中沙门菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特菌的同时检测,人工污染水产品检测限为10cfu/ml。结论为无公害水产品食源性致病菌的快速检测提供了理想手段,有良好的应用前景。     

食品中李斯特菌快速检测方法的建立与研究

李斯特菌特别是单核细胞增生李斯特菌在世界范围内引发了多起较严重的食物中毒 ,因而越来越引起重视 ,各国政府都花巨资投入到对该菌的研究。单核细胞增生李斯特菌能引起老人、孕妇和小孩发病。[1] 本实验室以ｍｉｎｉＶＩＤＡＳ和ＶＩＴＥＫ-ＡＭＳ两台仪器连用 ,建立了快速检测食品中李斯特菌的检测系统 (简称仪器法 )。用该法从四大类食品中分离到 10株单核细胞增生李斯特菌。1　材料与方法1 1　材料1 1 1　样品 :均随机抽取于超市货架上的食品。1 1 2　ｍｉｎｉＶＩＤＡＳ检测仪及其配套试剂 :ＶＩＴＥＫ -ＡＭＳ检测仪及其配套试剂 :均…