尿嘧啶DNA糖苷酶防止PCR产物污染及其对核酸杂交的影响

目的 采用ＰＣＲ微板核酸杂交ＥＬＩＳＡ分析脲嘧啶ＤＮ糖苷酶（ＵＮＧ／ＵＤＧ）防止ＰＣＲ产物污染及其对ＰＣＲ扩增效率的影响。探讨在不同Ａ／Ｔ含量的微生物中含尿嘧啶的ＰＣＲ产物对核酸杂交的影响。方法 以３组ｄＵＴＰ含量不同的ＰＣＲ产物作模板，抗污染组用ＵＮＧ处理，直接进行再次扩增。用微板核酸杂交ＥＬＩＳＡ检测第二次ＰＣＲ扩增的结果。结果 抗污染组中含ｄＵＴＰ的ＰＣＲ产物作模板，结果为阴性，而以不含ｄＵ     

PCR微板杂交检测生殖器疱疹病毒感染

以 PCR扩增生殖器疱疹病毒 DNA,然后用特异性 DNA探针微孔板检测疱疹病毒扩增产物 ,同时用普通 PCR检测同样的标本。结果 4 3例病例组中 ,PCR微板杂交 35 (83% )例阳性 ,8例 (17% )阴性 ;普通 PCR37(86 % )例阳性 ,6 (14 % )例阴性 ,二者无显著性差异 ;对照组 PCR微板杂交 19例 2例阳性 ,17例阴性。同时 ,普通 PCR则有 5例阳性 ,14例阴性。PCR微板杂交具有快速、灵敏度高、特异性强、抗污染能力强的优点 ,适用于检测可疑 HSV感染 ,具有临床使用价值     

用尿嘧啶—DNA—糖基化酶控制聚合酶链反应的产物污染

聚合酶链反应灵敏度极高，痕量的ＰＣＲ产物能污染新的ＰＣＲ体系导致假阳性结果。我们通过在所有的ＰＣＲ扩增中渗入ｄＵＴＰ使ＰＣＲ产物含“ｄＵ”，在以后的ＰＣＲ扩增前用尿嘧啶－ＤＮＡ糖基化酶处理，然后加热去除ＵＤＧ活性防止了产物污染。     

含尿嘧啶DNA糖基化酶的聚合酶链反应检测血清HBV DNA

为探讨含ｄＵＴＰ／尿嘧啶ＤＮＡ糖基化酶（ｄＵＴＰ／ＵＤＧ）ＰＣＲ试剂（抗污染ＰＣＲ试剂，ＰＣＲ－ｄＵＴＰ／ＵＤＧ）抗ＰＣＲ产物污染的能力及其在临床检测中的应用，采用该试剂检测２０４份病毒性肝炎患者血清中ＨＢＶＤＮＡ，并与普通ＰＣＲ试剂比较。结果显示：抗污染ＰＣＲ试剂有较强的抗污染能力，至少可阻止１００ｎｇ的ＰＣＲ产物的污染。该试剂与地戈辛素探针分子杂交所测结果的符合率（８９．３２％）高于普通ＰＣＲ与分子杂交所测的符合率（８１．４５％）。表明抗污染ＰＣＲ试剂的应用有利于防止ＰＣＲ产物的污染，提高ＰＣＲ的准确性和特异性。     

用尿嘧啶－DNA－糖基化酶控制聚合酶链反应的产物污染

聚合酶链反应（ＰＣＲ）灵敏度极高，痕量的ＰＣＲ产物能污染新的ＰＣＲ体系（称为产物污染）导致假阳性结果，我们通过在所有的ＰＣＲ扩增中掺入ｄＵＴＰ使ＰＣＲ产物含“ｄＵ”，在以后的ＰＣＲ扩增前用尿嘧啶－ＤＮＡ糖基化酶（Ｕｒａｃｉｌ－ＤＮＡ－Ｇｌｙｃｏｌａｓｅ，ＵＤＧ）处理，然后加热去除ＵＤＧ活性防止了产物污染。ＵＤＧ切割磷酸糖骨架上的尿嘧啶，可阴止ＤＮＡ聚合酶对它的复制，而对普通ＤＮＡ（即含”ｄＴ”）无影响。因为ＵＤＧ不与ｄＵＴＰ反应，而且在ＰＣＲ扩增前加热变性失活，使含尿嘧啶的污染物的污染得到很好控制。     

微板核酸杂交技术对江西地区HCV基因分型的观察

目的 采用微板核酸杂交-ELISA技术对HCV RNA进行基因分型。方法 采用PCR、核酸杂交和酶联显色技术，首先将HCV RNA进行RT-PCR扩增，并将扩增产物加入预先包被对HCV通用探针的徽孔板，再加入HCV各基因型显色探针，同时进行微板核酸杂交-ELISA显色，对江西地区129例临床诊断为丙肝RNA阳性患者血清中的HCVRNA进行基因分型研究。结果 江西地区HCV基因型可分为1b、2a、2b、3a、3b、6a、la／2a、1b／2a、1b／3a、1b／6a、3a／5a、2a／3a共12种单一基因型和混合基因型，其中以1b基因型为主，占50．39％；慢性丙肝患者的基因型较为复杂，存在较高比例的混合基因型。结论 江西地区HCV感染者以1b基因型为主．PCR徽板核酸杂交-ELISA方法可以准确、快速、简便进行HCV基因分型，在探讨HCV的流行病学及观察药物对各基因型的疗效方面具有重大的意义。     

含尿嘧啶DNA糖基化酶的聚合酶链反应检测血清HBV DNA

为探讨含ｄＵＴＰ／尿嘧啶ＤＮＡ糖基化酶（ｄＵＴＰ／ＵＤＧ）ＰＣＲ试剂（抗污染ＰＣＲ试剂，ＰＣＲ－ｄＵＴＰ／ＵＤＧ）抗ＰＣＲ产物污染的能力及其在临床检测中的应用，采用该试剂检测２０４份病毒性肝炎患者血清中ＨＢＶ ＤＮＡ，并与普通ＰＣＲ试剂比较。结果显示：抗污染ＰＣＲ试剂有较强的抗污染能力，至少可阻止１００ｎｇ的ＰＣＲ产物的污染。该试剂与地伐辛素探针分子杂交所测结果的符合率（８９．３２％）高于普通ＰＣ     

稳定剂保护PCR扩增dU-DNA效果研究

目的：了解94℃灭活UDG与不灭活及扩增产物加稳定剂与加稳定剂对DNA杂交效率的影响。方法：采用微孔板DNA杂交技术检测PCR扩增dU-DNA杂交效果。以不加UDG组DNA杂交A值为对照、计算杂交百分率。结果：不加UDG组扩增前后未经94℃灭活处理-20℃保存20h杂交效率为90.293％，加UDG组在4℃、室温、37℃放置20h，杂交效率为20.15％，21.37％，29.37％。加UDG并增加94℃灭活步骤、37℃水浴放置20h，杂交效率为73.57％，78.82％。在此基础上加入稳定剂37℃水浴43h杂交效率达到99.88％-100％。37℃水浴67h杂交效率仍达到86.06％-97.10％。结论：上述结果证实用于抗污染时，扩增前后增设94℃灭活10min可提高杂交效率。加入稳定剂可使杂交A值1.80达到对照组A值1.81水平。提示稳定剂对保护PCR扩增dU-DNA有极其重要作用。     

临床PCR技术常见污染及对策

目前,我国许多城市大、中型医院已配套了PCR诊断系统,给某些疾病的快速诊断提供了方便。但根据笔者在几家医院的实地考察,医院应用PCR技术仍存在着不容忽视的污染问题: 一、样品处理时标本间的污染 在提取模板时,由于一批处理的同类可疑样品较多,稍有不慎,它们可经试管一加样器一试管的途径交叉污染而使某些阴性标本的结果出现假阳性。 二、扩增产物的污染 在进行同类样品的批量扩增时,前次扩增产物显然是下次扩增的阳性模板,如实验室布局不合理或处理不当,可经加样器或空气污染。     

自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的 探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据.方法 采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100～200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20～99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认.结果 设计3对巢式PCR引物(P1～P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功.自建两轮PCR法设计了P4～P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18％)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL.结论 基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析.     

缺口连接酶链反应检测沙眼衣原体DNA的实验研究

目的:建立缺口连接酶链反应方法检测沙眼衣原体.方法:根据编码CT主要外膜蛋白的基因(ompl)的稳定区设计2对互补的寡核苷酸探针.采用G-LCR和常规PCR扩增CT标准株DNA,并对二者检测CT的敏感性进行比较.结果:对5种CT标准株进行G-LCR扩增,均出现54bp长度的DNA片段.敏感性实验可检测出2个CT原体,而PCR可检测出20EBs.G-LCR较PCR敏感10倍;在特异性方面,不扩增肺炎衣愿体及其他细菌DNA,具有很高的特异性.结论:G-LCR用于检测沙眼衣原体特异、敏感、快速、准确,可为CT感染的临床诊断提供依据.     

乙型肝炎病毒X基因真核表达的载体构建及鉴定

目的:构建HBV X基因与pCDNA3.1相融合的高效真核表达载体,为进一步研究HBV X基因的功能奠定基础。方法:设计并合成HBV X基因的引物,以HBV DNA阳性血清PCR扩增得到HBV X基因全序列;将X基因连接到真核表达载体pCDNA3.1上后,酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物序列分析等,鉴定所构建的真核表达载体。结果:以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBV X基因大小相同,酶切也得到目的基因片段,测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论:成功构建了HBV X基因的真核表达载体,为进一步研究HBVX基因及其产物的功能奠定了基础。     

HBV相关肝细胞癌患者HBV前S/S基因变异的分析

目的:研究肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)患者体内乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)前S/S基因变异特点.方法:分别对9例乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性肝癌患者及其家族中11例HBsAg阳性者血清乙肝病毒前S/S基因PCR扩增克隆.测序并进行结构分析.找出基因变异活跃位点,再对两组资料作统计学分析.结果:除对照组中1例未能扩增出前S/S基因,仅能扩增出S基因,其它样本均扩增出前S/S基因片段.所有HBV株均为B或C基因型和adrq 或adw2血清型.肝癌患者来源的HBV在包膜蛋白抗体结合区点突变发生率较高,但与对照组相比,没有统计学差异(P＞0.05).肝癌组4例发生HBV前S区删除变异,具有特异性.与对照组(0/10)相比,有统计学差异(P＜0.05).结论:HBV前S/S区点突变可能与肝癌发生没有相关性,而前S区删除变异可能与肝癌发生有密切联系,应当对HBV感染者进行前S区基因变异监测.     

2.2.15细胞中HBV DNA前C和C区PCR扩增及其产物测序

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）及其扩增产物的直接测序技术对２．２．１５细胞中乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）基因前Ｃ和Ｃ区进行测序。结果表明，根据ａｙｗ亚型ＨＢＶ基因设计的引物能够扩增２．２．１５细胞中ＨＢＶＤＮＡ扩增产物位于２２１－２９８碱基对之间，而对ａｄｒ亚型ＨＢＶＤＮＡ无扩增作用，说明ＰＣＲ扩增是特异性的，所测到的１３２个碱基序列与ａｗｙ１亚型ＨＢＶＤＮＡ完全符合，提示２．２．１５细胞中ＨＢＶＤＮＡ属ａ     

单细胞二重巢式PCR扩增影响因素初探

目的: 对影响单细胞二重巢式PCR扩增的因素进行初步探讨.方法:针对β-珠蛋白基因CD41-42、IVS-Ⅱ654突变位点区域采用二重巢式PCR,分别以不同的引物浓度组合、不同的Taq DNA聚合酶、不同的中和缓冲液、PCR反应前采用或不采用98 ℃预变性扩增单个淋巴细胞和/或单卵裂球,了解这些因素对PCR扩增效率的影响.结果: 不同的引物浓度组中,终浓度为0.25 μmol/L R1 F1引物对与 0.3 μmol/L R2 F2引物对配对扩增效率最高;不同的Taq DNA聚合酶中TaKaRa EX Taq的扩增效率最高;中和缓冲液-1(200 mmol/L Tricine)的扩增效率显著高于中和缓冲液-2(900 mmol/L Tris·HCl, pH 8.3/300 mmol/L KCl/200 mmol/L HCl)的扩增效率(P<0.05);单细胞PCR反应前采用98 ℃预变性与不采用98 ℃预变性的扩增效率间差异无统计学意义.结论:不同引物浓度组合、不同的Taq DNA聚合酶、不同的中和缓冲液对单细胞的二重巢式PCR的扩增效率存在明显差异,而PCR反应前采用98 ℃预变性不能提高PCR扩增效率.     

一种新的乙型肝炎病毒全基因组克隆技术的建立

目的建立一种乙型肝炎病毒(HBV)全基因组扩增及克隆的新方法。方法设计含SalⅠ、NotⅠ酶切位点的引物,用一片段PCR法扩增HBV全基因组,经双酶切后将PCR产物克隆入pBlueScript-(SK-)载体,进行HBV全基因组序列测定。结果用此方法成功获得35例HBV全基因组DNA序列。同时以重组质粒为模板进行敏感性和保真性测定,其敏感性为102个初始模板,核苷酸的人为突变率为1.6bp/kb。结论此方法可用于大规模HBV全基因组扩增和序列分析,为HBV的基础和临床研究提供了一种新方法。     

儿童感染的乙型肝炎病毒S基因的分子特征

目的初步调查儿童感染的乙型肝炎病毒表面抗原的基因特征。方法收集10名HBV感染的儿童血清标本,抽提血清中的HBV DNA,采用PCR扩增HBV S基因并测序,利用Genotyping软件对PCR产物序列进行分型,并分析HBV S基因的突变情况。结果 10份血清标本中,扩增出HBV S基因并成功测序6份,其余4份扩增阴性不满足测序要求。6份PCR产物所测序列标本经Genotyping比对后,均属于B型,与NCBI收录的参考序列AF100309同源性最高;5例是adw,1例是ayw。HBV S基因中编码a抗原决定簇的核苷酸序列突变点分别为G529A、T531C、C534A、T562A、T581A、A589C。编码a抗原决定簇的氨基酸序列突变点分别为I126T、P127T、S143T、G145A。核苷酸突变点G529A、T562A不引起编码a抗原决定簇的氨基酸序列突变,为无义突变。而其他4点突变均可引起编码a抗原决定簇相应氨基酸序列发生改变。结论所调查儿童主要感染B基因型HBV;其感染的HBV S抗原a决定簇的氨基酸序列出现I126T、P127T、S143T、G145A的突变,可能是逃避乙肝疫苗诱导的免疫保护的一种...     

鉴定定量PCR不同引物对的扩增效率

目的:采用载体构建及荧光定量PCR的方法比较BCL2等位基因不同部位PCR引物在定量分析中的扩增效率,判断其用于不同等位基因转录活性分析的可靠性。方法:用PCR扩增包含定量PCR目的片段的序列,然后将扩增产物分别插入pGEM-TEasy载体中,构建TA3重组载体,再以TA3载体为模板,采用荧光定量PCR方法比较引物对之间扩增效率。结果:定量PCR结果显示引物对之间扩增效率无明显差异。结论:所检测的PCR引物对之间的扩增效率一致,可用于比较分析mbr /mbr-Nalm-6杂合子细胞系中两个等位基因表达活性。