反向MDR1及TNF-α重组表达载体的构建及其在乳腺癌耐药细胞中的表达

目的克隆MDR1及TNF-α基因cDNA,构建反向pEGFP-MDR1重组表达载体和pDsRed2-TNF-α重组表达载体,并在乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达.方法应用RT-PCR和DNA重组技术构建反向绿色荧光蛋白pEGFP-MDR1融合蛋白表达载体和红色荧光蛋白pDsRed2-TNF-α融合蛋白表达载体,经脂质体分别和同时导入乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达,应用荧光显微镜直接观察融合蛋白的表达情况,G418筛选阳性克隆.结果转染了反向pEGFP-MDR1载体的MCF-7/ADR细胞在胞浆和胞核均可见到绿色荧光.而转染了pDsRed2-TNF-α载体的MCF-7/ADR细胞在胞浆和胞核均可见到红色荧光.而同时转染了反向pEGFP-MDR1载体和pDsRed2-TNF-α载体的细胞胞浆和胞核均可见到红色及绿色荧光.结论反向pEGFP-MDR1融合蛋白和pDsRed2-TNF-α融合蛋白能在乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR中分别及同时获得表达,为进一步研究基因治疗联同免疫治疗逆转乳腺癌耐药建立了很好的基础.     

转染肿瘤坏死因子及反向多药耐药基因对乳腺癌细胞耐药基因表达的影响

目的构建反向pEGFP-MDR1重组表达载体和pDsRed2-TNF-α重组表达载体,在乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达,并观察它们对多药耐药(MDR)基因的影响。方法应用RT-PCR和DNA重组技术构建反向绿色荧光蛋白pEGFP-MDR1融合蛋白表达载体和红色荧光蛋白pDsRed2-TNF-α融合蛋白表达载体,分别和同时导入乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达,应用荧光显微镜直接观察融合蛋白的表达情况,RT-PCR和免疫细胞化学染色法分别检测转染前后MDR1-mRNA和P糖蛋白表达情况。结果转染了反向pEGFP-MDR1载体的细胞可见到绿色荧光,转染了pDsRed2-TNF-α载体的细胞可见到红色荧光,而同时转染了反向pEGFP-MDR1载体和pDsRed2-TNF-α载体的细胞可见到红色及绿色荧光。转染后的细胞在mRNA水平及蛋白水平明显降低了耐药细胞MCF-7/ADR的MDR1基因的表达。结论反向pEGFP-MDR1融合蛋白和pDsRed2-TNF-α融合蛋白能在乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR中分别及同时获得表达,并能抑制MDR1基因在MCF-7/ADR细胞中的表达,为进一步研究基因治疗联同免疫治疗逆转乳腺癌耐药建立了很好的基础。     

反向MDR1及TNF-α重组表达载体的构建及其在乳腺癌耐药细胞中的表达

目的 克隆MDR1及TNF-α基因cDNA，构建反向pEGFP-MDR1重组表达载体和pDsRed2-TNF-α重组表达载体，并在乳腺癌耐药细胞株MCF-7／ADR中进行表达。方法 应用RT-PCR和DNA重组技术构建反向绿色荧光蛋白pEGFP-MDR1融合蛋白表达载体和红色荧光蛋白pDsRed2-TNF-α融合蛋白表达载体，经脂质体分别和同时导入乳腺癌耐药细胞株MCF-7／ADR中进行表达，应用荧光显微镜直接观察融合蛋白的表达情况，G418筛选阳性克隆。结果 转染了反向pEGFP-MDR1载体的MCF-7／ADR细胞在胞浆和胞核均可见到绿色荧光。而转染了pDsRed2-TNF-α载体的MCF-7／ADR细胞在胞浆和胞核均可见到红色荧光。而同时转染了反向pEGFP-MDR1载体和pDsRed2-TNF-α载体的细胞胞浆和胞核均可见到红色及绿色荧光。结论 反向pEGFP-MDR1融合蛋白和pDsRed2-TNF-α融合蛋白能在乳腺癌耐药细胞MCF-7／ADR中分别及同时获得表达，为进一步研究基因治疗联同免疫治疗逆转乳腺癌耐药建立了很好的基础。     

p38 MAPK红色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)红色荧光蛋白(RFP)融合表达载体.方法将克隆在pcDNA3上的FLAG标记的p38 MAPK亚克隆到红色荧光蛋白载体pDsRed1-N1上,随后转染HeLa细胞.在荧光显微镜下观察结果.结果重组质粒经酶切、PCR和测序证明正确无误,并在HeLa细胞中得到高量表达.融合蛋白发出的红色荧光表明p38 MAPK弥散分布于细胞质中,细胞核中也有一定的分布.结论成功构建了p38 MAPK红色荧光蛋白融合载体,该载体能在哺乳动物细胞中进行表达,为研究p38MAPK的细胞内定位提供了一个重要的工具.     

p38MAPK红色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的 构建在哺乳动物细胞中的表达的p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）红色荧光蛋白（RFP）融合表达载体。方法 将克隆在pcDNA3上的FLAG标记的p38MAPK亚克隆到红色荧光蛋白载体pDsRed1-N1上，随后转染HeLa细胞。在荧光显微镜下观察。结果 结果 重组质粒经酶切，PCR和测序证明正确无误，并在HeLa细胞中得到高量表达，融合蛋白发出的红色荧光表明p38MAPK弥散分布于细胞质中，细胞核中也有一定的分布。结论 成功构建了p38MAPK红色荧光蛋白融合载体。该载体能在哺乳动物细胞中进行表达，为研究p38MAPK的细胞内定位提供了一个重要的工具。     

GFP-HPV18 E2及其突变体融合蛋白在真核细胞内的表达与定位

目的:研究HPV18 E2及其N端(TAD)、C端(DBD)与GFP融合蛋白在巨噬细胞(MΦ)内的表达与定位。方法:将真核表达载体pEGFP-C1/E2、pEGFP-C1/TAD和pEGFP-C1/DBD及pEGFP-C1分别转染MΦ,48h后用倒置荧光显微镜观察荧光情况,以确定GFP及融合蛋白的表达;以抗GFP抗体为一抗作Western blot检测相应蛋白质的表达。结果:在荧光显微镜下,4种质粒转染的细胞,pEGFP-C1组细胞内均有荧光;pEGFP-C1/E2组荧光主要在细胞核,但细胞浆也有;pEGFP-C1/DBD仅在细胞核有荧光,pEGFP-C1/TAD仅在细胞浆有荧光。Western blot检测到GFP-HPV18 E2及其突变体融合蛋白在细胞内的表达。结论:GFP-E2及其突变体融合蛋白均能在巨噬细胞内表达,且GFP-E2主要定位于细胞核,GFP-DBD定位于细胞核内,GFP-TAD定位于细胞浆。     

TLR4红色荧光蛋白融合载体的构建与表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的含Toll样受体4（Toll like receptor 4,TLR4）基因的红色荧光蛋白融合表达载体（pDsRed1-N1/TLR4）,并观察在细胞内的表达情况。方法应用PCR扩增鼠TLR4全基因,将其克隆至红色荧光蛋白载体pDsRed1-N1中,重组质粒经PCR、酶切以及序列分析正确无误后,转染到Hela细胞中,并利用Western blotting鉴定TLR4蛋白在细胞中的表达。结果重组pDsRed1-N1/TLR4融合蛋白在Hela细胞中持续高表达,经连续观察发现48h红色荧光表达量最高。结论成功构建带有红色荧光蛋白的TLR4基因表达载体,为研究TLR4在细胞内的相关生物学功能及与mircoRNA之间的关系提供了方便有力的工具。     

HBV表面抗原大蛋白与人胰腺CDK5RAP3蛋白的亚细胞定位研究

目的 运用激光共聚焦显微技术对CDK5RAP3与LHBs进行亚细胞定位研究,为进一步研究HBV影响糖、脂类代谢的分子生物学机制提供一定的思路和方向.方法 应用酵母双杂交系统筛选人胰腺cDNA文库中的LHBs结合蛋白基因,构建真核表达质粒pDsRed1-N1-CDK5RAP3,应用激光共聚焦显微技术对CDK5RAP3与LHBs进行亚细胞定位研究.结果 成功构建真核表达质粒pDsRed1-N1-CDK5RAP3,转染了pDsRed1-N1-CDK5RAP3质粒的细胞,红色荧光信号较集中分布于细胞浆中,与经DAPI染色的细胞核无重叠.结论 证实LHBs基因和CDK5RAP3基因在体内可以表达蛋白,并提示LHBs蛋白和CDK5RAP3蛋白均主要定位在细胞浆内.     

GFP-HPV16 E2及其删除突变体融合蛋白在真核细胞中的表达与定位

目的构建人乳头瘤病毒16型E2(HPV16 E2)及其N端(TAD)、C端(DBD)删除突变体与增强型绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的真核表达载体,观察其在Hela细胞中的表达与定位。方法HPV16 E2基因经PCR扩增后,与pMD-T载体连接,经蓝白斑筛选、PCR、双酶切鉴定及序列分析后,将E2基因亚克隆至pEGFP-C1真核表达载体中,构建荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1/HPV16 E2。PCR扩增TAD、DBD基因片段,将其双酶切后插入pEGFP-C1,构建荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1/TAD及pEGFP-C1/DBD。将3种质粒转染Hela细胞,在荧光显微镜下观察融合蛋白的表达与定位。结果重组载体经PCR、双酶切鉴定及测序证明插入片段序列正确,且在Hela细胞中能表达目的蛋白;GFP-E2融合蛋白在细胞核与细胞质中都有表达,但主要分布于细胞核;而GFP-DBD融合蛋白仅在细胞核内;GFP-TAD融合蛋白仅在细胞质中。结论构建的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1/HPV16 E2、pEGFP-C1/TAD及pEGFP-C1/DBD均在Hela细胞中表达,并确定了各自在细胞内的定位。     

pDsRed2-Nl-SDF-1α真核表达载体的构建及在小鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的 构建pDsRed2-Nl-SDF-lα真核表达载体并转染骨髓间充质干细胞(MSCs),观察其在MSCs内的表达.方法 设计并合成SDF-1α基因引物,用RT-PCR法从小鼠平滑肌细胞中扩增出带有Xhol与EcoRI酶切位点的SDF-1α基因片段,将SDF-1α基因片段克隆到真核表达载体pDsRed2-N1上,酶切和测序鉴定.培养小鼠MSCs并Vimentin蛋白免疫荧光鉴定.通过脂质体将pDsRed2-N1-SDF-1α转染入小鼠MSCs.免疫荧光检测转染后的MSCs表达SDF-1α蛋白的情况.结果 扩增出的基因片断大小与基因文库中已知的SDF-1α序列大小完全相符,酶切也得到目的 基因片断,测序结果 显示与已知的SDF-1α序列相同,成功构建pDsRed2-Nl-SDF-1α真核表达载体.培养的细胞经Vimentin蛋白免疫荧光检测为阳性,pDsRed2-N1-SDF-1α表达载体转染到MSCs,24 h后细胞免疫荧光检测可见SDF-1α融合蛋白表达.结论 pDsRed2-N1-SDF-1α真核表达载体能够在小鼠MSCs中表达SDF-1α蛋白.     

pCS-CG-DsRed2-vigilin重组载体的构建及vigilin重组慢病毒包装

目的 构建pCS-CG-DsRed2-vigilin慢病毒重组载体,以及包装pCS-CG-DsRed2-vigilin重组慢病毒.方法 用NheⅠ、NotⅠ将目的片段红色荧光蛋白基因DsRed2从pDsRed2-N1中切下,连入pcDNA3.1（-）上,再用Kpn1从pcDNA3.1（-）-DsRed2中切下DsRed2片段插入pCS-CG-vigilin中.用相应的内切酶鉴定,阳性克隆送测序鉴定.采用三质粒系统包装慢病毒并分别感染HEK293T和HepG2细胞.结果 电泳显示,构建的pCS-CG-DsRed2-vigilin用KpnⅠ和SacⅡ分别单酶切切下800bp和600bp的插入片段,阳性克隆质粒测序结果与pDsRed2-N1中DsRed2序列一致;HEK293T和HepG2细胞感染后均能观察到较强的红色荧光.结论 带有红色荧光基因的pCS-CG-DsRed2-vigilin重组载体构建成功;成功包装出带红色荧光标签的vigilin重组慢病毒,且该病毒具有较高的感染效率.     

HMGB1启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在机械牵张诱导下的活性检测

目的 构建高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)启动子的红色荧光蛋白报告基因载体.方法 采用基因重组技术构建含HMGB1启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRedl-1-HMGB1P.经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将重组载体转染HEK293细胞,在荧光显微镜下观察其在细胞内的表达以及对机械牵张刺激的反应.以转染空载体pDsRedl-1的细胞作为对照.结果 PCR、酶切和DNA测序表明重组载体pDsRedl-1-HMGB1P的构建正确,该表达载体在HEK293细胞静息状态下表达水平较低,经机械牵张刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光.转染空载体pDsRedl-1的细胞未见红色荧光.结论 成功构建了HMGB1启动子的红色荧光蛋白报告基因载体,对机械牵张刺激有很好的反应.     

重组pEGFP-C2-FOXC1-C真核表达质粒的构建与表达

目的:将人FOXC1-C基因定向连入pEGFP-C2质粒,使FOXC1-C蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,为进一步研究FOXC1-C蛋白的功能及定位奠定实验基础。方法:采用EcoR I和NotI双酶切方法,从pcDNA3.1(+)-FOXC1-C质粒中获得FOXC1-C蛋白的cDNA羧基末端;连入pEGFP-C2质粒的C端。将构建成功的pEGFP-C2-FOXC1-C质粒转染入HeLa细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果:(1)将该质粒进行双酶切鉴定可见FOXC1-C片段;(2)转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:(1)FOXC1-C cDNA羧基末端成功连入pEGFP-C2质粒(;2)FOXC1-C蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达。     

EGFP-CIDE-3及D sRed1-CIDE-3融合基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达和定位

目的:分别构建EGFP、DsRed1与CIDE-3的融合基因真核表达载体,观察其在人胚肾上皮细胞293T中的表达,确定CIDE-3的亚细胞定位. 方法:分别以质粒pEGFP-C3、pDsRed 1-N1及本实验室克隆得到的质粒pET28a( )-CIDE-3为模板,PCR扩增EGFP、DsRed 1 DNA片段及人CIDE-3基因的CDS序列,再分别将EGFP、CIDE-3及DsRed 1、CIDE-3 克隆人真核表达载体pShuttle-CMV中.酶切、测序鉴定后,经磷酸钙转染人293T细胞,通过荧光显微镜观察其在293T细胞中的表达,并利用荧光染料Bodipy 493/503定位脂滴,探讨CIDE-3与脂滴之间的关系.结果:酶切及DNA测序证实,重组质粒pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3和pShuttle-CMV-DsRed 1-CIDE-3构建成功.荧光显微镜观察显示,pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3融合蛋白定位于细胞质,pShuttle-CMV-DsRed 1-CIDE-3融合蛋白也定位于细胞质,并与脂滴存在共定位关系. 结论:成功构建了重组质粒pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3和pShutde-CMV-DsRed 1-CIDE-3;两者均可在239T细胞中表达,融合蛋白分布于细胞质,并与脂滴存在共定位关系.     

野生型与Pro370Leu突变型myocilin基因真核细胞表达的对比研究

目的比较Pro370Leu突变型myocihn（mMYOC）与野生型myocilin（wMYOC）基因在真核细胞中表达的差别,了解原发性开角型青光眼（POAG）的发病机制。方法将携带有wMYOC基因的绿色荧光蛋白重组表达载体pEGFP-N3-wMYOC和携带有mMYOC基因的红色荧光蛋白重组表达载体pDsRed2-N1-mMYOC,分别及共同转染真核细胞Hela,用荧光显微镜观察蛋白表达定位情况,并用Western印迹分析蛋白分泌情况。结果荧光显微镜观察到wMYOC蛋白和mMYOC蛋白均成功表达,都定位在细胞质中,但wMYOC蛋白分布均匀,而mMYOC蛋白呈聚集状态。共表达时,wMYOC蛋白也呈聚集状态,且与mMYOC蛋白有共定位倾向。经Western印迹分析,相应的转染细胞可分泌wMYOC蛋白,而不能分泌mMYOC蛋白;当共表达时,也没有wMYOC蛋白分泌。结论两种基因都能成功表达,都定位在细胞质;mMYOC蛋白表现为聚集倾向和分泌障碍,并且影响wMYOC蛋白的表达和分泌特性。     

PRMT2及其剪接体在乳腺癌MCF-7细胞中的亚细胞定位及意义

目的：构建蛋白质精氨酸甲基转移酶2( PRMT2)及其差异剪接体与绿色荧光蛋白( GFP)的真核表达载体,转染后观察其融合蛋白在乳腺癌MCF-7细胞中的表达及亚细胞定位,为进一步研究PRMT2基因及其新的差异剪接体在乳腺癌中的作用奠定基础。方法以pGEM-T-PRMT2/α/β/γ载体为模板,设计引物,PCR扩增目的基因,并将PCR产物克隆至pcDNA3.1/NT-GFP-topo载体,转化后将阳性克隆扩增,对 PCR 产物进行跑胶鉴定和测序。提取 pcDNA3.1/NT-GFP-PRMT2/α/β/γ及空载体pcDNA3.1/NT-GFP质粒,用脂质体介导转染MCF-7细胞,在激光共聚焦显微镜下,观察外源性PRMT2/α/β/γ融合蛋白在MCF-7细胞中的亚细胞定位。采用Western blot法检测各重组融合蛋白在MCF-7细胞中的表达。结果各GFP在细胞中均有表达,但其在细胞中的分布位置不一致。 PRMT2α与PRMT2γ的融合蛋白同PRMT2的分布一致,均聚集于核仁外的核浆,胞质中有少许分布;而PRMT2β和空载体的荧光蛋白的分布一致,都均匀分布于细胞的胞质和胞核,包括核仁部分。 Western blot法检测表明各重组融合蛋白在MCF-7细胞中均有表达。结论 PRMT2及其各剪接体的亚细胞定位不同,可能提示其在功能方面存在差异。     

hPlk2基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的:构建人Polo样激酶2(hPlk2)真核表达载体并证实该融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法:提取工具细胞Hela的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hPlk2基因cDNA全长,并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。然后将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞COS-7中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。最后利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hPlk2在COS-7细胞内的定位。结果:hPlk2基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段大小为2 058 bp,并测序成功。Western blot检测到了pEGFP-hPlk2融合蛋白表达,分子量约为105 kDa。pEGFP-hPlk2在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周。结论:成功构建了hPlk2基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-hPlk2蛋白在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周。