人脐血内皮祖细胞体外诱导分化的研究

目的研究从人脐血中诱导分化出内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）,并对此类细胞进行鉴定。方法术中取健康产妇的新鲜脐静脉血,采用淋巴细胞分离液梯度离心法分离出单个核细胞（mononuclear cells,MNCs）,应用添加诱导因子的培养基于体外诱导分化,观察细胞生长状态。培养7d后将贴壁细胞与含Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1的培养基进行孵育并于荧光显微镜下观察,流式细胞仪检测培养细胞表面分子CD34及CD133的阳性率,RT-PCR检测培养细胞表达VEGFR-2mRNA。结果体外诱导7d后90%以上贴壁细胞摄取Dil-ac-LDL呈红色荧光和FITC-UEA-1呈绿色荧光双阳性。流式细胞仪检测CD34及CD133阳性细胞分别为（50.48±5.17）%和（19.12±4.37）%。RT-PCR检验培养细胞VEGFR-2mRNA呈阳性。结论采用密度梯度离心法从人脐血中提取MNCs在体外经诱导分化可以形成EPCs。     

血管内皮生长因子在外周血内皮祖细胞体外三维血管新生中的作用

目的 观察血管内皮生长因子(VEGF)在三维血管新生中的作用.方法 取大鼠外周血,密度梯度离心法分离出内皮祖细胞,以VEGF为诱导因子,观察VEGF对大鼠外周血内皮祖细胞体外培养和扩增的影响,同时重点建立三维立体模型并分析VEGF在外周血内皮祖细胞体外三维血管新生中的作用.结果 VEGF实验组细胞在三维基质内向胶原基质内生长,24 h内即可出现向胶原内的出芽及浸润并逐渐形成分支样结构,对照组细胞生长慢、出芽慢,管状结构细小,向胶原内浸润的深度浅,网状结构稀疏、不完整.VEGF实验组与对照组新生血管数目比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 鼠尾胶原凝胶可以诱导内皮祖细胞表现出血管新生中的迁移、增殖、发芽等;VEGF能动员和诱导内皮祖细胞促进血管新生.     

兔外周血源的血管内皮祖细胞体外扩增研究

目的探讨从兔外周血单个核细胞中富集血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）并在体外诱导培养和扩增的方法,试图证实外周血是获得血管内皮祖细胞理想来源之一。方法密度梯度法分离兔外周血单个核细胞（MNCs）,采用专用的EGM-2-MV完全培养基对单个核细胞进行诱导分化培养,动态观察细胞生长过程,并应用免疫组织化学和细胞荧光化学法分别鉴定培养细胞的内皮细胞表面标记和生物学功能。结果外周血单个核细胞经专用培养基体外诱导后,4 d左右可见多数细胞贴壁生长,9 d后可见位于中间的细胞聚集成团,4周后呈铺路石样内皮细胞形态。培养12 d细胞能表达的内皮细胞表面抗原,包括Ⅷ因子（VWF）,血管内皮生长因子受体（VEGFR-2）和钙粘素（VE-cadherin）等;并能特异性吸附异硫氰酸荧光素（FITC）标记的荆豆凝集素（UEA-1）,能内吞乙酰化低密度脂蛋白（ac-LDL）,具备内皮细胞的功能。结论兔外周血中存在具有增殖分化潜能的EPCs,经过特定的体外诱导培养可以收集和扩增。     

外周血来源的内皮祖细胞的体外培养与分化

目的研究内皮祖细胞(EPC)的分离、培养、分化及鉴定.方法Ficoll密度梯度离心分离外周血获取单核细胞,在加有EGM-2-MV-SingleQuots的EBM-2培养液中培养和扩增,免疫组化和免疫荧光测定分化细胞表面特异性抗原的表达.结果培养后10 d细胞融合,呈克隆样生长,20 d后细胞呈现典型的鹅卵石样内皮细胞形态;免疫组化和免疫荧光显示,CD31、vWF、FLK-1/KDR/VEGFR-2和VE-cadherin均呈阳性.结论外周血来源的单核细胞含有内皮祖细胞,能在一定的培养条件下分化成为血管内皮细胞.     

大鼠外周血内皮祖细胞体外向内皮细胞诱导分化时的表型变化特征

目的 研究大鼠外周血内皮祖细胞(EPC)体外分化为内皮细胞的过程中,干细胞标志物以及内皮细胞表型的变化.方法 取SD大鼠外周血,应用Ficoll密度梯度离心的方法获得单个核细胞,体外培养于纤连蛋白处理的培养皿中,同时应用VEGF和bFGF诱导,使之向内皮细胞转化,用免疫组织化学方法检测细胞CD31、CD34、Flk-1、vWF在第1～7天的表达.结果 贴壁细胞的CD31、CD34、Flk-1、vWF在不同时段呈不同程度的表达.干细胞的标志物CD31、CD34的表达逐步减弱,第6天时消失.内皮标志物Flk-1和 vWF表达逐步增强,第7天时达100%.结论 大鼠外周血干细胞向内皮祖细胞分化的过程中,干细胞标志物逐渐消失,内皮细胞的表型逐步显现.     

VEGF,b-FGF诱导的人外周血单个核细胞向血管内皮祖细胞分化的研究

目的:研究在VEGF, b-FGF诱导下人外周血单个核细胞向血管内皮祖细胞(EPCs)分化的方法. 方法: 采集健康志愿者外周血,经Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞,在加有VEGF, bFGF的M199培养基中培养,培养第7 d,免疫组化(SABC法)和免疫荧光检测细胞表面抗原的表达. 结果: 人外周血单个核细胞(MNCs)经体外VEGF, b-FGF的诱导分化,表达EPCs的表面标志KDR, CD133和CD34. 结论: 外周血来源的MNCs能在一定的培养条件下可以诱导分化为EPCs.     

骨桥蛋白对骨髓内皮祖细胞体外增殖功能的影响

目的观察骨桥蛋白(OPN)对体外培养的人骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)增殖功能的影响及可能的机制。方法以密度梯度离心法获取人骨髓单个核细胞(MNCs),差速贴壁法培养8d,由形态学、流式细胞仪、Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1双染鉴定为EPC后,免疫组化和RT-PCR方法检测OPN在EPC的表达。加入不同浓度人重组OPN和PI3K抑制剂LY294002和Akt抑制剂作用于EPC,采用CCK-8法观测EPC的增殖能力。结果人重组OPN促进EPC的增殖功能,并且呈剂量依赖性。抑制PI3K/Akt信号通路可以阻断OPN对EPC增殖能力的影响。结论人重组OPN在体外可能通过PI3K/Akt信号通路调节人骨髓源性EPC的增殖能力。     

外周血内皮祖细胞体外培养分化研究

目的从人外周血中分离、培养和鉴定内皮祖细胞(EPCs),并观察其在体外增殖分化过程中各种细胞表型的变化。方法采用密度梯度离心方法获得外周血单个核细胞,体外进行诱导、分化和扩增,于培养第7天选择免疫荧光(DiI-acLDL/FITC-UEA-Ⅰ)鉴定EPCs,并且用流式细胞仪和RT-PCR方法观察上述细胞在第0、4、10和21天的CD34、CD31、KDR和eNOS的表达变化。结果外周血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;第7天免疫荧光染色表明,约70%的细胞呈双荧光阳性;流式细胞仪分析显示,CD31和KDR表达在体外培养过程中逐渐升高,至第21天分别达到(72.1±11.2)%和(81.0±12.5)%,而CD34在第10天达到高峰(38.0±13.4)%后,第21天下降为(28.3%±12.2)%;RT-PCR结果表明,第4、10和21天eNOS的表达逐渐增强。结论本试验成功从外周血单个核细胞中分离培养出EPCs,在其体外扩增分化为成熟内皮细胞的过程中,CD31、KDR和eNOS等内皮细胞标志表达逐渐增强,而CD34的表达在内皮祖细胞的成熟分化过程中略有下降。     

外周血内皮祖细胞体外培养分化研究

目的从人外周血中分离、培养和鉴定内皮祖细胞(EPCs),并观察其在体外增殖分化过程中各种细胞表型的变化.方法采用密度梯度离心方法获得外周血单个核细胞,体外进行诱导、分化和扩增,于培养第7天选择免疫荧光(DiI-acLDL/ FITC-UEA-Ⅰ)鉴定EPCs,并且用流式细胞仪和RT-PCR方法观察上述细胞在第0、4、10和21天的CD34、CD31、KDR和eNOS的表达变化.结果外周血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;第7天免疫荧光染色表明,约70%的细胞呈双荧光阳性;流式细胞仪分析显示,CD31和KDR表达在体外培养过程中逐渐升高,至第21天分别达到(72.1±11.2)%和(81.0±12.5)%,而CD34在第10天达到高峰(38.0±13.4)%后,第21天下降为(28.3%±12.2)%;RT-PCR结果表明,第4、10和21天eNOS的表达逐渐增强.结论本试验成功从外周血单个核细胞中分离培养出EPCs,在其体外扩增分化为成熟内皮细胞的过程中,CD31、KDR和eNOS等内皮细胞标志表达逐渐增强,而CD34的表达在内皮祖细胞的成熟分化过程中略有下降.     

黄芪甲苷促人内皮祖细胞分泌血管生长因子的实验研究

目的:观察黄芪甲苷对人内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)分泌血管生长因子的影响,分析黄芪甲苷调节EPCs介导的血管新生的作用机制。方法:取足月健康新生儿脐带血,用密度梯度离心法获取单个核细胞,进行传代培养,当细胞呈现梭形时对细胞进行CD31抗体和DAPI核染鉴定,获得EPCs。将获得的EPCs随机分为实验组和对照组,实验组用质量浓度为100 mg·L~(-1)的黄芪甲苷干预,对照组用等量的PBS液处理,培养24 h后,通过酶联免疫吸附实验检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)a、VEGFb、VEGFc、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors,FGF)、血管生成素-1(angiogenin-1,Ang-1)的吸光度。结果:经CD31抗体和DAPI核染检测证实成功获取EPCs。实验组人EPCs分泌的血管生长因子VEGFa、VEGFb、VEGFc、FGF、Ang-1水平均高于对照组(分别t=9.84、45.24、14.51、6.27、6.57),差异均有统计学意义(P0.01)。结论:黄芪甲苷可促进人EPCs分泌大量VEGF,具有调节EPCs介导血管新生的巨大潜能。     

外周血来源的内皮祖细胞的体外培养与分化

目的 研究内皮祖细胞(EPC)的分离、培养、分化及鉴定。方法 Ficoll密度梯度离心分离外周血获取单核细胞，在加有EGM-2-MV—SingleQuots的EBM-2培养液中培养和扩增，免疫组化和免疫荧光测定分化细胞表面特异性抗原的表达。结果 培养后10d细胞融合，呈克隆样生长，20d后细胞呈现典型的鹅卵石样内皮细胞形态；免疫组化和免疫荧光显示，CD31、vWF、FLK-1／KDR／VEGFR-2和VE—cadherin均呈阳性。结论 外周血来源的单核细胞含有内皮祖细胞，能在一定的培养条件下分化成为血管内皮细胞。     

猪外周血内皮祖细胞的分离培养及生物学特性

目的从小型猪外周血中分离、培养内皮祖细胞(EPCs),并进行相关鉴定,分析其生物学特性。方法采用密度梯度离心法获得小型猪外周血单个核细胞并进行体外传代培养,分别采用倒置相差显微镜观察、免疫荧光染色、流式细胞仪分析及Matrigel实验和DiI-acLDL摄取实验,对其细胞表型及功能进行相关鉴定。结果外周血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样形态;培养第14天,约80%的细胞DiI-acLDL吞噬实验阳性,且CD133、CD34、flk-1、CD31、CD144的表达阳性率分别达到25.1%、55.9%、97.7%、82.0%和95.4%;细胞培养于凝固的Matrigel表面7 d后,形成特征性的网格状结构。结论该实验成功从小型猪外周血单个核细胞中分离培养出EPCs,在其体外扩增诱导的过程中,表达EPCs和成熟内皮细胞的特征性标志。     

人循环内皮祖细胞的分离培养和诱导分化

目的研究人循环内皮祖细胞（EPCs）分离、培养、分化及鉴定。方法采用Ficoll密度梯度离心法从人外周血中分离单个核细胞,接种于含血管内皮生长因子（VEGF）及优质胎牛血清的M199培养液中,对其进行体外诱导分化培养,以免疫组化、细胞荧光化学法及流式细胞检测法鉴定贴壁细胞的内皮细胞特异性标志。结果人外周血单个核细胞（MNCs）经体外培养,表达内皮细胞的特异性抗原,包括VWF、CD31和CD34,并显示出能内吞乙酰化低密度脂蛋白（ac-LDL）,结合UE小1等内皮细胞特性,提示这些细胞具有内皮细胞的表面蛋白特性和具有内皮细胞功能。结论人外周血中存在具有分化增殖能力的EPCs,在一定培养条件下可分化为血管内皮细胞。     

VEGF,b-FGF诱导人脐血单个核细胞向血管内皮祖细胞分化的研究

目的:研究VEGF, b-FGF诱导下人脐血单个核细胞向血管内皮祖细胞(EPCs)分化.方法:从新鲜脐血中用Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞,在加有VEGF,bFGF的M199培养基中培养,培养7 d,免疫组化(SABC法)和免疫荧光检测细胞表面抗原的表达.结果:人脐血血单个核细胞(MNCs)经体外VEGF, b-FGF的诱导分化,表达内皮祖细胞的表面标志KDR, CD1133和CD34.结论:人脐血单个核细胞在一定的培养条件下可诱导分化为内皮祖细胞.     

兔外周血内皮祖细胞的分离、培养和鉴定

目的:研究新西兰大白兔外周血内皮祖细胞(EOCs)的分离、培养和鉴定方法,为后续实验研究做好准备.方法:通过耳中央动脉采集兔外周血,密度梯度离心法分离单个核细胞(MNCs),在EGM-2培养基的诱导分化下,获得EOCs.通过标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL)摄取试验、荆豆凝集素(FITC-UEA-1)结合实验、CD34与Ⅷ因子免疫组化染色、flk-1免疫荧光染色、体外血管形成实验以及细胞NO分泌功能测定,从细胞表面标记和细胞功能两方面对细胞进行鉴定.结果:新西兰大白兔外周血MNCs在体外培养可成功获得EOCs,EOCs能稳定摄取ac-LDL并与UEA-1结合,一致表达CD34、flk-1和Ⅷ因子相关抗原.EOCs能分泌NO,并能在matrigel凝胶上形成稳定的血管腔样结构.结论:密度梯度离心法分离的兔外周MNCs在一定的培养条件下能诱导分化成为EOCs.     

体外诱导人骨髓间充质干细胞定向血管内皮细胞分化

目的研究人骨髓间充质干细胞(BDMSC)向血管内皮细胞的诱导分化,为复杂器官组织工程血管化及细胞移植修复损伤组织提供理想的细胞来源.方法以血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子对种植于纤维蛋白凝胶及基底膜基质中的BDMSC进行三维立体诱导培养,在培养后不同时间分别进行形态观察、组织切片和CD34、CD31、血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1,Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1)、vWF的免疫组织化学荧光染色.结果诱导后的人BDMSC阳性表达血管内皮细胞特有表面标志CD34、CD31、Flt-1、Flk-1、vWF,并生成内皮样细胞,形成血管样结构.结论血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及诱导后表达的Flt-1、Flk-1等表面分子可能在BDMSC向血管内皮细胞分化、并形成血管样结构的过程中提供适宜的微环境并起重要作用,这为间充质干细胞在组织工程血管化及细胞移植修复损伤中的应用提供了理论与技术上的支持.     

外周血单个核细胞向平滑肌祖细胞分化的体外培养

目的探讨外周血单个核细胞向平滑肌祖细胞分化的培养方法。方法分离人外周血单个核细胞,接种于加有牛垂体提取物的M-199培养基中,第8天予以血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)刺激促进细胞分化,刺激15 d后运用RT-PCR、免疫荧光法和Western blot检测平滑肌细胞特异性α-辅肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(SMMHC)、调宁蛋白(Calponin)、CD34、Tie-2和Flk-1的表达,并以流式细胞技术检测培养细胞α-SMA阳性表达率,对培养细胞进行鉴定。结果在PDGF-BB刺激培养15 d后细胞表达平滑肌细胞的标记α-SMA、SM MHC和Calponin,同时表达干细胞的标记CD34,并发现其Flk-1阳性表达,Tie-2阴性表达。PDGF-BB刺激后细胞α-SMA阳性表达率为(90.57±5.63)%,与阴性对照细胞之间有统计学差异(P<0.05)。结论外周血单个核细胞分离后第8天,使用PDGF-BB刺激可使其向平滑肌前体细胞分化,提出了一种新的外周血单个核细胞向平滑肌细胞分化的培养方法。     

通心络体外促进人外周血内皮祖细胞的增殖

目的：观察中药通心络（Tongxinluo）对体外培养的人外周血内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）增殖的影响。方法：采用密度梯度离心法分离培养人外周血单个核细胞，经FITC标记荆豆凝集素I（FITC-UEA-I）和Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-acLDL）双染色鉴定为正在分化的EPCs，并进一步通过流式细胞仪检测其表面标志CD34、CD133。分别以不同浓度（O、50、100、200、500、750和1000μg／ml）通心络超微粉溶液作用36h，以及500μg／ml通心络超微粉溶液作用不同时间（O、6、12、24和36h）后，MTT法观察EPCs增殖的情况。结果：与对照组比较，不同浓度通心络组均改善了EPCs的增殖功能（P〈0.05），在500μg／ml时最为显著（P〈0.01）；500μg／ml通心络能明显促进EPCs增殖能力（P〈0.05，P〈0.01），随时间延长促进作用逐渐增强，36h达到高峰（增殖率为54．18％，P〈0.01）。结论：通心络体外能显著改善外周血内皮祖细胞增殖的能力。     

内皮培养条件下人外周血单个核细胞不同时段克隆成分的生物学特征

目的:探讨在内皮培养条件下人外周血单个核细胞不同时段克隆成分的生物学特征.方法:11名健康志愿者,由肘静脉取血50 mL,肝素抗凝,密度梯度离心法获得单个核细胞(MNCs),用含生长因子的内皮培养基接种于纤连蛋白包被的培养板中,接种后每2 h去除1次未黏附细胞,共2次,然后隔日换液1次,第7 d计数早期克隆.每例血样均分为2等份,1份在获得早期克隆后持续培养,直到晚期克隆出现;另1份加入无血清培养基继续培养72 h,ELISA法测定上清液中血管内皮生长因子(VEGF)浓度.流式细胞技术检测细胞表面抗原CD14、CD45、CD146等的表达,直接荧光染色法测定细胞结合荆豆凝集素.结果:早期克隆中心为圆形细胞,周边是放射状排列的纺锤形细胞,再种植不能形成第2代克隆.细胞表面主要表达CD14和CD45,培养上清液中VEGF浓度明显高于晚期克隆(P＜0.05).晚期克隆呈现典型的内皮细胞特征,再种植可形成第2代克隆.细胞表面CD146表达明显增加(P＜0.01),而CD45、CD14表达明显减少(P＜0.001).结论:人外周血单个核细胞在内皮培养条件下可形成早期克隆和晚期克隆,早期克隆属于单核细胞系列,可分泌VEGF但不能分化成内皮细胞,晚期克隆细胞具有内皮祖细胞的形态和生物学特征.     

成人外周血内皮祖细胞分离和诱导分化

目的：研究人外周血中内皮祖细胞的生物学特性和诱导分化条件。方法：从健康成人外周血中分离内皮祖细胞接种于添加VEGF,bFGF,IGF-1,EGF的M199培养基中,观察细胞集落、梭形贴壁细胞的出现时间和特异性细胞标志表达情况。结果：第3~4天可观察到贴壁梭型细胞,第5~8天出现多个细胞团,第10天左右可见首尾相连形成条索状结构。贴壁细胞表达血管内皮细胞特异性标志。结论：成人外周血中的内皮祖细胞来源于单个核细胞,在一定条件下可以诱导分化为内皮细胞。