逆转录-聚合酶链反应检测鼠肝炎病毒方法的建立

建立特异、灵敏的逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术，结合碱性磷酸酶标记的探针杂交检测鼠肝炎病毒（MHV），采用MHV－3，MHV－A59病毒株感染DBT细胞，37℃培养，待细胞出现病变时收集提取病毒RNA。依据MHV基因序列设计一对高度保守区特异性引物，进行RT－PCR扩增，结果可见147bp的鼠肝炎病毒产物特异扩增带。敏感性实验检测到10pg的鼠肝炎病毒RNA，同时用ELISA方法对照。结果提示应用RT—PCR技术结合探针杂交检测鼠肝炎病毒。具有简便、快速、灵敏等优势。本研究在国内尚未见报道。     

采用RT-PCR技术进行SARS冠状病毒基因检测

目的 建立RT—PCR检测SARS冠状病毒基因的方法，用于早期诊断。方法 对临床确诊的20例SARS患的血、鼻拭子、咽拭子、尿、便等69份标本进行总RNA提取，反转录成cDNA后再以本研究室自行设计合成的一对特异引物进行PCR扩增，2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，出现140bp带为SARS病毒阳性。采用测序仪对140bp带进行特异性检测，并进行灵敏度试验。结果 140bp扩增序列与公布的SARS病毒的基因序列完全一致，灵敏度可达10个拷贝。SARS患II份尿标本中6份检出140bp阳性扩增带，8份便标本中检出3份阳性，从15份鼻拭子和15份咽拭子中分别检出6份和5份阳性标本，血清15份、白细胞5份分别检出2份阳性。20例SARS患中送检1至4种标本检测到SARS病毒阳性共15例(75％)。结论 本研究建立的RT—PCR方法灵敏、特异，可用于早期诊断。尿、便标本中的SARS病毒检出率较高且取材简便、病人无痛，是取材的极好选择。每例待测患最好同时取其尿、便、拭子、血等多种标本，可以提高SARS病毒检出率。     

仙台病毒RT-PCR检测方法的建立与应用

目的建立仙台病毒的RT—PCR方法并应用于常规检测。方法根据仙台病毒（gi：9627219）F蛋白的基因序列，设计Ff和Fr引物，以仙台病毒总RNA逆转录的cDNA为模板扩增出约609bp预期条带；将建立的RT—PCR方法应用于人工感染小鼠和送检细胞样品检测。结果八份感染小鼠样品中全部扩增出约609bp目的条带，16份肿瘤细胞样品有12份扩增出609bp目的条带。结论建立的仙台病毒RT—PCR方法是一种灵敏、快速、特异的方法，能够用于常规检测。     

黑色素瘤抗原—1基因在胃癌组织中的表达

目的：检测黑色素瘤抗原－1（MAGE－1）基因在胃癌组织中的表达，为应用MAGE－1基因产物对胃癌病人进行特异性抗肿瘤免疫治疗提供理论依据。方法：用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测30例胃癌组织及相应癌旁组织中MAGE－1基因的表达，并对1例RT－PCR阳性扩增产物进行DNA序列测定。结果：30例胃癌组织标本中有14例（46．7％）表达MAGE－1基因，而相应的癌旁组织均不表达MAGE－1，两组比较差异有显著性（P＝0．001）；DNA序列测定证实1例RT－PCR扩增产物中的目的基因片段为MAGE－1cDNA序列。结论：MAGE－1基因在胃癌组织中有较高表达，这使得以该基因编码蛋白作为疫苗用于胃癌的免疫治疗成为可能。     

胃癌相关基因Serpine1的RT-LAMP快速检测法

目的建立逆转录一环介导的等温扩增快速检测高侵袭型胃癌转移相关基因。方法快速抽提肝转移胃癌患者标本的RNA用环介导的等温扩增反应（LAMP）扩增转移相关基因Serpinel，扩增条件为63℃保温30min，扩增后产物通过特异性内切酶进行鉴定。结果RT—LAMP能特异性快速的扩增目的基因。结论RT—LAMP能因其特异，快速，高效的优点可以广泛运用于肿瘤转移相关基因的检测，对临床早期诊断提供标准。     

实时荧光PCR和RT—PCR方法检测登革病毒的比较研究

目的通过2种检测登革病毒方法的比较，以提高检测登革病毒的灵敏度和特异性。方法利用Taqman MGB技术，根据登革病毒3’端非编码区的一段高度保守序列，设计登革1～4型荧光PCR通用引物和TaqmanMGB探针，以登革热毒株作为标准，以乙脑毒株作对照，建立实时荧光PCR检测登革病毒的快速方法。并对10份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行RT—PCR及荧光PCR扩增。结果RT—PCR检测10份临床血清标本，2份阳性，阳性率为20％。实时荧光PCR检测登革病毒与乙脑病毒无交叉反应，检测10份临床血清标本，5份阳性，阳性率为50％。从RNA提取到检测结果仅需4h。结论Taqman MGB实时PCR检测方法快速、敏感性高、特异性强，可作为登革病毒的快速检测方法，应用于登革热的临床早期诊断。     

人类防御素基因cDNA片段的克隆

为了获得一种具有生物学活性的小分子多肽基因cDNA，作者采用RT－PCR方法，从慢性粒细胞白血病患者的外周血细胞总RNA中扩增得到长度约为280bp的防御素（Defensin）基因cDNA片段，并将该扩增产物克隆到pUCm-T载体中，为筛选一种更高效的融合杀菌肽基因奠定基础。     

芜湖市输入性登革热1例的实验诊断与分析

目的:对芜湖市1例输入性登革热病例进行实验室检查,为临床病例的确诊提供参考依据。方法:对患者的病史、诊疗经过等资料进行归纳、分析,用登革病毒通用引物和血清型特异引物进行巢氏PCR检测和分析患者是否感染登革病毒及其登革病毒血清分型,并对扩增产物进行克隆测序和比对分析。结果:基因扩增产物显示与Ⅰ型登革病毒位置一致,产物序列在NCBI上比对分析,再次证实为Ⅰ型登革热病毒。结论:该患者确诊为登革热Ⅰ型病毒感染。     

检测RNA病毒及其IgM抗体在病脑病原学诊断中的应用

目的：探讨检测RNA病毒和相应IgM抗体在病脑病原学诊断方面的应用价值。方法：RT－PCR方法检测脑脊液（CSF）中B组萨奇病毒（COX－B）和风疹病毒（RV）；用ELISA方法检测CSF和血液中相应病毒的IgM。结果：101例病脑患，其CSF标本COX－B和RV的检出率分别为32．7％和7．9％；其COX－IgM和RV－IgM的检测阳性率，血液标本37．6％和7．9％，CSF标本无1例阳性结果；成人组和儿童组的检出率比较，COX系列差别无显性（P＞0．05），RV系列差别有显性（P＜0．05）。32例对照组，其CSF中未检出RNA病毒和IgM抗体；而血液中COX－IgM检出率均为6．2％。结论：RT－PCR方法可以用作病脑的病原学诊断手段，用RT－PCR方法检测脑脊液中的RNA病毒与用ELISA方法检测血清中抗体相结合，能增加实验诊断资料的可靠性。     

肺癌组织中黑色素瘤抗原-3基因mRNA的表达

目的：检测肺癌组织中黑色素瘤抗原－3基因（MAGE－3）mRNA的表达，方法；用逆转录－套式聚合酶链反应（RT－PCR）对31例肺癌患者癌组织和相应癌旁组织MAGE－3 mRNA表达情况进行测定；PE－377DNA测序仪对5例10个RT－PCR扩增产物中的目的基因片段进行DNA序列测定。结果：31例肺癌患者癌组织中26例表达MAGE－3 mRNA，阳性率为83.9%；相应的癌旁组织均未表达。DNA序列测定证明PCR扩增产物中目的基因片段均为MAGE－3 cDNA序列，所测5例样本中4例样本有2个相同位置的碱基发生了点突变，导致一个氨基酸残基改变。结论：（1）MAGE－3 mRNA在肺癌中呈高比例表达，提示此抗原有可能作为肺癌患者免疫治疗的靶抗原；（2）我国肺癌患者中存在MAGE-3基因个别位点的变异。     

PCR法与ELISA法检测丙型肝炎病毒及乙型肝炎病毒比较5

目的：探讨PCR与ELISA2种方法检测丙型肝炎病毒和惭型肝炎病毒的差异和临床意义。方法：随机抽取无偿献血者标本300份，分为ALT升高组和ALT正常组，用ELISA法检测抗－HCV和HbsAg，用RT－PCR检测HCV－RNA和HBV－DNA。结果：抗－HCV阳性标本26例阳性率为8．7％，经RT－PCR检测，HCV－RNA均为阳性，抗HCV阴性的标本中有2例HCV－RNA为阳性。HCV－RNA的阳性率为16％，2种方法检测结果差异有统计学意义（P＜0．01）；300份标本中HBsAg阳性和HBV－DNA阳性比率分别为11．3％和12．7％，两者无明显差异（P＞0．05）。结论：ELISA方法检测丙型肝炎病毒存在一定的漏检现象，应用RT－PCR检测HCV－DNA利于早期诊断，也是筛选献血员是否携带丙型肝炎病毒的较可靠方法。     

应用PCR技术对血清中HBV-DNA检测的临床分析

通过体外DIVA扩增可以检出极微量的HBV—DNA病毒，是目前最灵敏的方法，我们引进PCR技术应用于乙肝患者HBV—DNA检测，现将结果报告如下。l材料和方法1．1标本来源，本院住院患者．血清标本60伤，其中应用酶联免疫法检测二对半，大三阳者33份，小王阳春27份，患者均ALP增高，临床诊断为急性肝炎及慢性迁延性肝炎。1．2仪器：DNA扩增PTC－51B（产地军科院）、电泳仪、Costoc微量加样器1．3试剂、PCR检测乙肝病毒（HBV－DNA）诊断试剂盒，特异DNA为16DbP1．4方法步骤1．4．IHBV－DNA的提取，取20ml血清加入20Inl提取液混…     

原发性肝细胞癌与HCV分型的关系

目的：了解原发性肝细胞癌（HCC）患者HCV基因型分布现状及其关系。方法：选择山西省肿瘤医院1996年间住院的HCVRNA阳性，临床上确诊的HCC患者血清标本13份，非肝癌癌症患者血清标本15份，1996年－1997年HCVRNA阳性的公共场所从业人员血清标本15份，用型特异性引物进行RT－PCR基因分型。结果：13例HCVRNA阳性的HCC患者，除1例未能分型外，其余12例均为HCV 1b型（100％）。15例非肝癌癌症患者，除13酌（86．67％）为1b型感染者外，其余均为2a型（13．33％）。15例从业人员中，不仅检出了12b型感染（86．67％），还检出2a型，1／2混合型各1例。所有标本中1b,2a型，1b/2a混合型的构成分别为38／42（90．48％），3／42（7．14％），1／42（2．38％），以1b型的比例最高，未检出1a,2b和3a型。结论：HCVRNA1b型与HCC的关系较为密切，同时也是山西地区HCV的感染优势株。     

贵州自然界白纹伊蚊体内登划病毒带毒情况

目的 :利用细胞、分子生物学技术对贵州省自然界白纹伊蚊体内带登革病毒 (DEN)情况进行调查。方法 :采集贵州省9个地 (州 )市共计 18个县 (区 )白纹伊蚊幼虫标本 ,饲养为成蚊 ;制备蚊悬液 ,碘化钠法提取RNA ,用登革病毒NS1基因区通用引物经逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测DEN核酸 ,限制性内切酶酶切鉴定阳性PCR产物并分型 ;蚊悬液接种C6 /36细胞进行病毒分离 ,制作细胞片 ,间接免疫荧光法检测DEN抗原。结果 :从独山县麻尾镇白纹伊蚊标本中分离到 1株DEN 2型病毒 ,从凯里、黄果树和镇远 3处地方株白纹伊蚊体内检测出DEN核酸 ,用抗DEN 4型单克隆抗体经间接免疫荧光(IFA)和RT PCR产物酶切分型鉴定分别为登革病毒 2型、4型。结论 :贵州省存在DEN感染的自然循环     

对山东地区TTV基因片段的检测及其部分核酸序列测定

目的 了解山东地区输血传播病毒（TTV）分离株感染状况及基因变异的情况。方法 应用逆转录－聚合酶链反应法（RT－PCR）检测山东地区26例非甲－戊型肝炎和12例肝细胞癌患者血清中的TTV DNA，对阳性扩增的产物进行测序，并分析其基因变异情况。结果 26例非甲－戊型肝炎患者检出TTV DNA阳性者11例（42％）。对其中2例（TTVSD4，TTVSD5）进行PCR产物直接测序，并与日本株（AB008394）相比较，其核苷酸序列同源性分别为99．9％和100％。而12例肝细胞癌患者中TTVDNA阳性3例（25％），对其中1例（TTVSD6）测序，与日本株（AB008394）相比较，其核苷酸序列同源性为99％；TTVSD1、TTVSD5和TTVSD6之间的核苷酸同源性均为99％。结论 山东地区非甲－戊型肝炎和肝细胞癌患者中TTV感染率较高，测序结果表明其与日本株（AB008394）有较高的同源性。     

大鼠β-防御素-2的cDNA克隆及其在气管组织的固有表达

目的　研究大鼠β-防御素基因表达调控分子机制。方法　采用RT -PCR技术在Wistar大鼠气管组织的总RNA中扩增其特异cDNA片段 ,然后进行克隆扩增、限制性内切酶谱分析和DNA序列测定。结果　在大鼠气管组织扩增出长度为 2 1 7bp的cDNA片段 ,其RT -PCR产物经测序分析证明是大鼠β-防御素 - 2cDNA。结论　大鼠β -防御素 - 2基因在气管组织呈固有表达 ,认为与呼吸系统的抗微生物防御机制密切相关。     

胃癌高表达基因erk的PCR扩增,克隆和鉴定

对在胃癌高表达的EPH家族基因erk胞外的配体结合区基因扩增及克隆．方法：从胃癌患者手术切除标本中提取RNA，反转录为cDNA，以计算机辅助分析设计并合成引物进行RT－PCR，并将扩增片段克隆入pUC19质粒，用酶切及PCR方法筛选鉴定阳性克隆．结果：RT－PCR扩增片段与设计相符，且特异性好，无非特异产物出现，表明所设计引物符合要求．酶切及巢式PCR、PCR－RFLP方法证明克隆片段正确插入pUC19的HindIII和BamHI位点，并将重组克隆命名为pGE42．结论；克隆的完成为进一步研究该基因在胃癌的发生中的作用，寻找其胞外配体及进行表达产物的细胞定位等工作打下基础．     

套式RT—PCR在丙型肝炎诊断中的应用

目的：探讨逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）在丙型肝炎诊断中的应用。方法：应用套式RT－PCR检测肝炎病人血清中HCVRNA,并同时用固相放射免疫法（RLA）检测病人血清中抗HCVRNA抗体。结果：193份肝炎病人血清中11．9％（23／193）可检出HCVRNA,10．9％（21／193）可检出抗HCVRNA抗体,两种检测结果相符率达98．4％,结论：套式RT－PCR对诊断丙型肝炎快速、特异性高,同时该检测法可避免放射性损伤和污染,在临床上对丙型肝炎的诊断有很大的应用价值。     

登革病毒1型和2型国内分离株NS1基因的扩增和克隆

登革病毒(DEN)为单链正股RNA病毒,其非结构蛋白NS1在病毒免疫反应中起重要作用。我们在NS1基因序列设计了一对通用引物,扩增序列长度为413bP。应用逆转录—聚合酶链反应成功地扩增了DEN1_-4型部分基因片段,采用该引物扩增国内分离株DEN1(GZ)和DEN2(HN91)同样出现一条特异扩增带,并发现国内分离株扩增产物的电泳迁移率与国际参考株有差别。因此我们应用低融点琼脂糖回收该DNA片段,并将DEN1(GZ)和DEN2((HN91)NS1基因部分片段分别克隆到Puc19质粒载体中。经Pst Ⅰ和Ecor Ⅰ双酶切分析和通用引物PCR鉴定证明重组质粒内含有NS1基因部分片段。并准备进行核苷酸序列分析,以进一步了解其核苷酸的变异与抗原性的关系,为我国登革热的预防和控制提供理论依据。     

半定量RT-PCR检测细胞因子表达的研究

目的：建立一种客观、敏感的检测IL-2／IL-4细胞因子基因表达变化的方法。方法：采用TRIzol试剂提取免疫排斥／免疫耐受大鼠脾脏组织总RNA，分光光度计法定量。取2μg总RNA．采用RT—PCR法逆转录-扩增IL-2、IL-4和内参照β-actin cDNA。扩增产物经电泳分离后。用凝胶图像分析仪照相和扫描分析，检测其相对表达量。结果；RT—PCR产物经电泳后。β-actin、IL-2和IL-4分别在226bp、342bp和332bp处出现明显条带，与预定条带大小相一致；免疫耐受组IL-4与免疫排斥组IL-2的表达有明显差异．在免疫耐受组中IL-4表达增高，而在免疫排斥组中IL-2表达增高，内参照β-actin扩增条带亮度在两组中相同，PCR产物量与扩增初始模板量之间存在良好的对应关系。结论：半定量RT—PCR检测是-种从少量细胞中快速、简便、可靠地检测特异基因mRNA表达的方法。