大鼠脊髓损伤后胶质细胞生长因子的mRNA表达变化

目的：探讨胶质细胞牛长凼子（glial growth factor，GGF）在大鼠脊髓损伤后的表达变化及意义。方法：采川改良Allen’s脊髓损伤打击模型，用逆转录聚合酶链式反应法（RT-PCR）检测胚胎大鼠脊髓内、正常成年大鼠脊髓内以及脊髓损伤后不同时间点伤段脊髓组织中GGF的mRNA表达结果：GGF在成年大鼠正常脊髓内低水平表达，在胚胎脊髓中高水平表达。大鼠脊髓损伤后GGF的mRNA表达持续降低，在脊髓损伤后5d达到最低峰，之后GGF的mRNA表达可逐渐恢复。结论：GGF在脊髓乍长发育中起重要作用：大鼠脊髓损伤后GGF的表达降低可能与脊髓损伤后少突胶质细胞大量死亡或凋亡有关．与脊髓损伤后轴突无法再生、脱髓鞘的髓鞘再生困难有关。     

成年脊髓损伤大鼠脊髓神经干细胞的体外培养及分化研究

目的 探讨大鼠脊髓损伤后脊髓神经干细胞的分离培养方法及分化情况.方法 采用Allen法制作大鼠脊髓损伤模型,利用无血清培养和单细胞克隆技术在成年脊髓损伤7 d大鼠脊髓中分离具有单细胞克隆能力的神经干细胞,并进行培养鉴定.结果 从成年脊髓损伤7 d大鼠脊髓中成功分离出神经干细胞,该细胞具有连续克隆能力,可传代培养,表达神经巢蛋白抗原.分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原.结论 致伤7 d的成年大鼠脊髓组织体外町培养出神经十细胞,并分化为神经无细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞,有可能参与脊髓损伤的修复过程.     

脂质体介导胶质细胞生长因子真核表达载体在大鼠脊髓内的表达

目的研究脂质体介导增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）和胶质细胞生长因子2（glial growth factor 2,GGF2）的双基因真核表达载体在脊髓内转染及其表达变化。方法构建GGF2与EGFP双基因真核表达载体pIRES2-EGFP-GGF2。采用注射法将阳离子脂质体和pIRES2-EGFP-GGF2质粒混合后转染至大鼠胸段脊髓组织中。采用RT-PCR法检测不同时间点转染区域脊髓组织中GGF2 mRNA的表达。在荧光显微镜下观察不同时间点EGFP在大鼠脊髓中的表达。结果基因转染后2 d即可观察到EGFP的表达及GGF2 mRNA表达的增加,在基因转染后1～2周内EGFP及GGF2 mRNA呈高水平表达,基因转染4周后,EGFP及GGF2 mRNA的表达明显减少。结论脂质体介导pIRES2-EGFP-GGF2转染大鼠脊髓后其表达的特点有助于基因治疗效果的即刻性,即早期大量表达,起到基因治疗的作用,又可避免外源基因的持续表达。     

大鼠脊髓横断性损伤后细胞周期蛋白D3的表达变化

目的 探讨细胞周期蛋白D3（Cyclin D3）在横断性脊髓损伤（tSCI）后的表达变化以及定位情况。方法 将48只成年SD大鼠随机分为8组：正常对照组，T9横断伤2、8h、1、3、5、7和14d组，每组6只。采用Western blot测定损伤后各时间段Cyclin D3蛋白水平在脊髓中的表达变化。采用免疫组织化学方法检测Cyclin D3在正常以及损伤后脊髓中的分布和定位。结果 West—emblot显示，Cyclin D3蛋白水平在tSCI后头、尾段均呈现先升高后下降的趋势，尾段明显：Cyclin D3的表达于损伤后8h开始逐渐升高，3d达到高峰，一直持续到第5天，之后逐渐下降。免疫组织化学表明Cyclin D3在正常脊髓中均匀分布，损伤后3d，Cyclin D3在脊髓白质和灰质中表达明显增强；免疫荧光双标记表明Cyclin D3与神经元的标记物neuronal nucleus（NeuN）、少突胶质细胞标记物cyclic nucleotide 3’phosphohydrolase（CNPase）有明显共定位，与星形胶质细胞标记物gtial fibrillary acidic protein（GFAP）和小胶质细胞标记物OX-42也存在部分共定位。结论脊髓损伤后Cyc—lin D3蛋白水平呈现明显的时相变化，并且与神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞存在共定位，提示Cyclin D3参与了脊髓损伤后的病理生理过程。     

成年大鼠SCI后神经生长导向因子Netrin和Slit的表达及定位

目的：观察成年大鼠急性脊髓损伤（SCI）后不同时点Netrin和Slit的表达及分布，探讨再生轴突的导向机制。方法：成年SD大鼠40只，随机分为SCI后2、4、7、14d组和对照组共5组，每组8只．SCI组采用Allen’s法制作SCI模型．按时间点顺序取材，免疫荧光激光共聚焦扫描检查Netrin—1和Slit2蛋白在损伤脊髓局部的表达及定位。结果：SCI后2d，大鼠脊髓损伤部位即出现Netrin-1和Slit2的同步表达上调．而后均迅速增强并于1周时达到峰值，且二者在轴突胞膜上均有表达．之后缓慢下调；SCI后同一时点Netrin-1在脊髓中均匀表达，而Slit2则在脊髓前、后角及中央管等不同部位存在表达差异。结论：成年大鼠SCI后脊髓中枢存在吸引因子Netrin-1和排斥因子Slit2的同步高表达及轴突胞膜上共同表达，这可能是SCI后星形胶质细胞反应性增生的一种表现，可能对轴突导向性再生起关键性作用。     

神经生长导向因子Slit2在成年大鼠急性脊髓损伤后的表达

目的观察Slit2在大鼠急性脊髓损伤后不同时点表达量的变化和分布，探讨轴突再生导向机制。方法成年SD大鼠采用Allen’s法制作脊髓损伤（SCI）模型，分别于损伤后第2、4、7、14天取材，半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）分析Sht2 mRNA表达水平变化，免疫组织化学法观察Slit蛋白在损伤脊髓区的分布情况。结果RT—PCR提示脊髓损伤后Slit2即开始出现转录上调，表达量持续增高并于第7天达到顶峰，之后逐步下降；免疫组织化学提示Slit2阳性信号先后出现在急性SCI区灰质胶质细胞及神经元胞质中，以前、后角及中央管周围较为聚集。结论大鼠SCI后有Slit2表达上调出现并在损伤脊髓灰质广泛分布，可能是轴索再生过程中生长锥导向性生长的关键调节者。     

急性脊髓损伤后诱生型一氧化氮合酶的表达、分布及作用

目的：研究大鼠急性脊髓损伤（spinal cord injury,SCI)后不同时间脊髓内诱生型一氧化氮合酶（inducble nitric oxide synthase,iNOS)的表达及其在不同类型细胞中的分布、血清中一氧化氮（nitric oxide,NO)含量的变化及iNOS特异性抑制剂氨基胍（aminoguanidine,AG)对大鼠后肢功能的影响。方法：Allen′s模型致伤后，分别于损伤后1、2、3、5、7d取伤段脊髓，作蛋白质印迹分析。在SCI后3d，用免疫荧光和免疫组化顺序标记方法分析iNOS在脊髓神经元、小胶质细胞和星形细胞中的表达与分布。应用比色法测定SCI后血清硝酸盐和亚硝酸盐的含量。观察腹腔注射20mg/kg、200mg/kg AG后SCI大鼠后肢功能的变化。结果：SCI后1d可见iNOS表达，3d达高峰，7d明显降低。在SCI后，神经元、星形细胞和小胶质细胞中均可iNOS表达，其中以神经元表达为主。SCI后血清硝酸盐和亚硝酸盐的含量于伤后1h和3-7d时出现两个高峰。损伤后腹腔注射20mg/kg、200mg/kg AG均能显著抑制血清硝酸盐和亚硝酸盐含量的升高，同时大鼠后肢功能显著恢复。结论：SCI后脊髓内iNOS表达增高，并分布在以神经元为主的多种细胞中。iNOS产生的NO加重了继发性脊髓损伤，对iNOS的抑制可能有助于脊髓损伤后神经功能的恢复。     

胚胎脊髓细胞悬液植入急性成年大鼠损伤脊髓

目的：建立胚胎脊髓细胞悬液移植于脊髓损伤模型，以评价其治疗脊髓损伤的可能性。方法：４２只Ｗｉｓｔａｒ大鼠以改良Ａｌｅｎ法（５０ｇｃｍ）打击脊髓，３天后将孕１４天（Ｅ１４）ＦＳＣＳ２０μｌ植入损伤空腔，移植后２、４、６、８、１０、１２周，以光、电镜、免疫组织化学观察移植物存活、分化及其与宿主之间关系。结果：移植细胞逐渐长大。充满不规则空腔，宿主ＮＦ、５－ＨＴ、ＣＧＲＰ纤维分别出现于移植物，ＧＦＡＰ纤维于宿主移植物交界处适量存在。移植成神经细胞、成少突胶质细胞、成星形细胞的细胞器日渐完善，细胞功能活跃。复杂及多样突触与细胞连接，将上述细胞与神经纤维、胶质纤维、毛细血管网在三维空间内连接成一体，并与宿主紧密嵌合。结论：（１）成年大鼠脊髓损伤３天后植入ＦＳＣＳ可以存活。（２）移植物进入宿主后，出现再分布，继而器官样分化。（３）长、短传导束进入移植物，显示了移植物的桥作用。（４）成少突胶质细胞的神经营救作用。（５）移植区内出现多种突触，提示移植物中继作用的可能性。     

脊髓损伤后促红细胞生成素对bcl-2的影响

目的 探讨促红细胞生成素（EPO）对大鼠脊髓损伤后伤区脊髓细胞凋亡和神经功能恢复的影响。方法 Wistar大鼠210只，随机分为4组：假手术组、脊髓损伤组、脊髓损伤加重组人EPO治疗组、脊髓损伤加生理盐水治疗组。采用原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导dUTP标记（TUNEL标记法）检测神经元和少突胶质细胞凋亡，Western blot免疫印迹法和免疫组化染色检测bcl-2表达，免疫组化染色和图像分析方法观察对白质内神经纤维（NF-200染色）的保护作用，通过感觉诱发电位（SSEP）、运动诱发电位（MEP）和大鼠BBB后肢运动功能评分，观察损伤脊髓传导功能的恢复。结果 EPO保护组bcl-2在各时相点的表达明显增高，8h和7d时神经元和少突胶质细胞的TUNEL阳性细胞数明显减少；在7d时白质中NF-200阳性神经纤维明显增多；SSEP和MEP的平均潜伏期和波幅以及BBB功能评分明显提高，与损伤组和生理盐水治疗相比，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论 EPO通过上调bcl-2的表达，在抑制脊髓损伤后神经元和少突胶质细胞的凋亡中起到神经保护作用。     

苦参素对大鼠急性脊髓损伤后热休克蛋白47表达的影响

目的探讨苦参素治疗大鼠急性脊髓损伤(SCI)的机制。方法用30只Wistar大鼠制作钳夹型SCI模型,随机分成正常组、假手术组、SCI组、对照组和治疗组,在SCI后3d及每周评价BBB评分,并在第8周用免疫组化方法分析脊髓中热休克蛋白47(HSP47)的表达情况。结果正常组和假手术组Wistar大鼠脊髓组织低表达胶质细胞酸性蛋白(GFAP)和HSP47,高表达神经丝蛋白(NF),在SCI后GFAP和HSP47表达明显提高(P<0.05),NF表达明显降低(P<0.05)。苦参素治疗后,GFAP和HSP47表达降低(P<0.05),NF表达升高(P<0.05)。结论苦参素对Wistar大鼠SCI具有治疗作用,很可能通过抑制HSP47的表达发挥治疗作用。     

重组人促红细胞生成素对大鼠脊髓损伤后中性粒细胞趋化因子表达的影响及意义

目的 探讨重组人促红细胞生成素(rHuEP())对大鼠脊髓损伤后中性粒细胞趋化因子(CINC-1)表达的影响。方法 SD大鼠102只，随机分为4组，采用改良Allen’s脊髓损伤打击模型，以逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)法测定伤段脊髓组织CINC-1mRNA的表达情况。结果 正常脊髓组织内存在CINC-1mRNA的表达，脊髓损伤后CINC-1mRNA表达迅速增高，伤后6h达到高峰；rHuEPO治疗组脊髓损伤后6、12小时CINC-1mRNA表达明显低于NS治疗组.结论 CINC-1参与继发性脊髓损伤过程，rHuEPO抑制脊髓损伤后CINC-1mRNA的表达，对脊髓继发性损伤可能有保护作用，、     

Changes in nitric oxide synthase expression in young and adult rats after spinal cord injury

OBJECTIVE: To examine the clinical meaning of the changes in nitric oxide synthase (NOS) expression and activity after spinal cord injury (SCI) according to the age of the experiment animal. MATERIAL AND METHOD: Ten 5- and 16-week-old Sprague-Dawley rats were laminectomized at T10 and SCI induced at this level using a New York impactor. Outcome measures to assess SCI utilized the Basso-Beatti-Bresnahan scale to quantitate hind limb motor dysfunction as a functional outcome measure. NOS isoforms (nNOS, neuronal NOS; iNOS, inducible NOS; and eNOS, endothelial NOS) were also immunolocalized in sections of control and spinal cord injury in the two sample groups using specific monoclonal antibodies. Student's t-test evaluated the difference between the young and adult rats, and P<0.05 was considered as significant value. RESULT: As the expression of nNOS on the spinal gray matter of the adult rat decreased, eNOS activity increased. Different from the adult rat, expression of the nNOS in the young rat was maintained until 1 day after SCI, and compared with the adult rat; eNOS activity was increased in the vessels from the damaged gray matter area after 7 days of SCI. iNOS expression was maintained until the 7th day of SCI on the adult rat, but iNOS expression after 7 days of SCI on young rat decreased. The young rat showed relatively less motor disability on the hind limb when compared with the adult rat, and had a rapid recovery. CONCLUSION: Neural protective eNOS activity increased after SCI in the young rat, and neural destructive iNOS expression was more remarkable in the adult rat.     

大鼠胚胎脊髓移植对损伤脊髓GAP-43 mRNA表达的影响

目的观察大鼠胚胎脊髓移植对损伤脊髓 GAP－ 43 mRNA表达和大鼠后肢功能恢复的影响。方法成年 Wistar大鼠 66只,随机被分为脊髓半切洞损伤应用胚胎脊髓移植组 (脊髓移植组, 30只 )、单纯脊髓半切洞损伤明胶海绵填充组 (单纯损伤组, 30只 )、正常对照组 (6只 )。术后第 1、 3、 7、 14、 28 d,对大鼠进行 Tarlov评分和斜板试验检查后肢功能。应用原位杂交的方法观察 GAP－ 43 mRNA的表达,记录阳性细胞数,采用计算机图像分析技术,进行定量分析。结果脊髓损伤后第 1 d,在脊髓移植组和单纯损伤组的损伤脊髓灰质中都可见到 GAP－ 43 mRNA的表达。于损伤后迅速增加,第 7 d时达到高峰。脊髓移植组 GAP－ 43 mRNA蛋白表达为 39.24± 6.83,约是单纯损伤组 (21.48± 7.83)的 2倍 (P< 0.05)。胚胎脊髓移植后可使损伤的脊髓中 GAP－ 43 mRNA持续高表达至术后第 28 d,而单纯损伤组仅持续到术后第 14 d。增加的 GAP－ 43 mRNA阳性细胞数与神经功能的改善平行。结论胚胎脊髓移植后可使损伤大鼠脊髓高表达 GAP－ 43 mRNA,并促进大鼠功能的恢复。     

大鼠脊髓损伤后GDNFmRNA表达变化及意义

目的　探讨 GDNFm RNA在大鼠脊髓损伤后表达变化及其意义。方法　改良 Allen’s脊髓撞击 (10 g× 7.5 cm)致伤大鼠 T1 段脊髓 ,以 β- Actin为内参照物 ,应用半定量 RT- PCR方法 ,观察大鼠脊髓损伤前及损伤后不同时间 GDNFm RNA表达变化。结果　 GDNFm RNA在正常成年大鼠脊髓微量表达 ,脊髓损伤后 2 4h表达增加 5倍 ,72 h增加 2 0倍 ,7d增加 4倍 ,10 d仍高于正常水平。结论　脊髓损伤后早期 GDNFm RNA表达增加 ,是神经元自我保护作用的一种表现 ;损伤神经元修复需要大量 GDNF,应用 GDNF治疗脊髓损伤时应早期用药     

心肌钙敏感受体在高位脊髓损伤大鼠心肌损伤中的作用

目的 探讨心肌钙敏感受体(CasR)在高位脊髓损伤大鼠心肌损伤中的作用.方法 健康雄性SD大鼠18只,体重250 ～ 300 g,采用随机数字表法,将大鼠随机分为2组:假手术组(S组,n＝6)和高位脊髓损伤组(SCI组,n＝12).采用砝码(10 g)从5 cm高处沿中空玻璃管垂直自由落下撞击C7脊髓的方法制备高位脊髓损伤模型.SCI组于高位脊髓损伤后12和24h(T1,2)时,S组于T1时取血样,测定血清肌酸激酶(CK)和CK-MB活性,取心肌组织,在透射电镜下观察心肌超微结构,分别采用荧光定量PCR法和Western blot法检测心肌CaSR mRNA及其蛋白的表达水平.结果 与S组比较,SCI组血清CK和CK-MB活性升高,心肌CaSR mRNA及其蛋白表达上调(P<0.05);与T1时比较,SCI组T2时血清CK活性升高,CK-MB活性降低,心肌CaSR mRNA表达上调(P<0.05),CaSR蛋白表达差异则无统计学意义(P＞0.05).SCI组T1,2时心肌超微结构呈现不同程度的损伤改变.结论 大鼠高位脊髓损伤后心肌CaSR表达上调,该变化可能是高位脊髓损伤后心肌损伤的机制之一.     

大鼠脊髓损伤后Wnt信号分子的表达变化

目的:探讨大鼠脊髓损伤后不同时期Wnt信号分子Wnt-1、β-连锁蛋白(β-catenin)及糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)在脊髓损伤局部的表达情况.方法:50只成年雌性SD大鼠随机均分为对照组和实验组,麻醉下手术显露T9～T11椎板,切除T10全椎板,实验组大鼠用NYU打击器以10g×5cm的打击能量致伤T10脊髓,对照组只行全椎板切除,不致伤脊髓.分别于术后1d、3d、5d、7d、14d每组各取5只大鼠,取以损伤区为中心共15mm范围内(对照组取相应部位)脊髓组织,提取总RNA,采用半定量RT-PCR的方法检测脊髓组织中Wnt-1、β-catenin及GSK-3β的mRNA表达量.结果:脊髓损伤后1d和3d时Wnt-1和β-catenin出现高表达,5d后其表达逐渐减弱,14d左右其表达基本恢复到正常水平,而在脊髓损伤后1d和3d时GSK-3β呈低表达,5d后其表达逐渐增强,各时间点之间差异有显著性(P<0.05).对照组中Wnt-1和β-catenin及GSK-3β均呈低表达,各时间点表达无显著差异(P<0.05).结论:大鼠脊髓损伤后损伤局部脊髓组织中Wnt-1,β-catenin及GSK-3β的表达发生变化,提示Wnt信号在脊髓损伤后的早期被激活,其可能与脊髓损伤后的修复再生有关.     

促红细胞生成素在大鼠脊髓缺血再灌注损伤中的表达及其意义

目的:观察促红细胞生成素(EPO)在大鼠脊髓缺血再灌注损伤(SCII)中的表达和重组人促红细胞生成素(rhuEPO)预处理对再灌注损伤脊髓神经细胞的作用。方法:将W ister大鼠分为正常组、假手术组、rhuEPO处理组和生理盐水对照组;rhuEPO处理组和生理盐水对照组于术前3h腹腔注射rhuEPO和生理盐水,制备大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型。以免疫组化和W estern blot法检测脊髓组织中EPO的表达变化;以原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导dUTP标记法(TUNEL法)检测细胞的凋亡情况。结果:EPO在无损伤脊髓中即有少量的表达,SCII后8h表达显著上调,于12、24h(12h与24h组比较差异无显著性意义,P>0.05)达高峰,伤后3d表达逐渐下调,5d仍保持较高水平。rhuEPO处理组SCII后8h、12h及24h时神经细胞凋亡水平明显低于生理盐水对照组,差异有显著性意义(P<0.01)。结论:在脊髓缺血再灌注损伤中EPO呈现时序性表达变化,可能是机体内源性神经保护的机制之一;EPO预处理能明显抑制SCII后神经细胞的凋亡。     

大鼠脊髓损伤过程中细胞周期蛋白H的表达变化

目的 观察细胞周期蛋白H(Cyclin H)在急性脊髓损伤后的表达变化及定位情况,探讨其在脊髓损伤与修复过程中的生物学功能.方法 取56只成年SD大鼠,随机分8组:正常对照组、T9撞击伤6 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d 7组,每组7只.采用Western blot测定损伤后各时间段Cyclin H蛋白水平在脊髓中的表达变化,采用免疫组织化学方法检测Cyclin H在正常及损伤后脊髓中的分布和定位,在此基础上探讨Cyclin H在脊髓损伤后的病理生理意义.结果 Western blot结果表明创伤性脊髓损伤后脊髓中Cyclin H表达呈现逐渐升高再下降的趋势,3 d达到高峰.免疫组织化学表明Cyclin H在正常脊髓中表达,损伤后3 d,Cyclin H在脊髓白质中的表达明显增强,在灰质中的表达也有一定程度的增强.免疫荧光双标记表明Cyclin H与神经元标记物NeuN、小胶质细胞标记物CD11b有明显共定位,与星形胶质细胞标记物GFAP有少量共定位.结论 脊髓损伤后Cyclin H蛋白水平有明显时相改变,且与神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞有共定位,提示Cyclin H在脊髓损伤后可能发挥了作用.