中国人肠道产甲酸草酸杆菌oxc基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的 观察中国人肠道产甲酸草酸杆菌(Ox.F)草酰辅酶A脱羧酶基因(oxc)的分离、克隆及其在293细胞中的表达.方法 提取中国人肠道Ox.F的基因组DNA,PCR扩增oxc基因片段并克隆入真核表达载体pEGFP-C1,通过限制性内切酶酶切电泳和测序鉴定基因片段.将重组质粒脂质体转染至293细胞,利用RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测oxc基因在真核细胞中的表达.结果 中国人肠道产甲酸草酸杆菌oxc基因全长1707 bp,与Gene Bank中的序列比较,碱基序列的同源性为93.61%,氨基酸残基序列的同源性为97.18%.重组质粒转染293细胞后24～48 h,可观察到明亮的绿色荧光,从mRNA和蛋白水平上可以检测到oxc基因在真核细胞中的表达.结论 中国人肠道产甲酸草酸杆菌中可以分离出oxc基因;中国人肠道产甲酸草酸杆菌oxc基因存在一定的变异;oxc基因可在真核细胞293细胞中表达.     

表达产甲酸草酸杆菌草酸分解基因的人肝细胞系的构建

目的：构建表达产甲酸草酸杆菌（Ox．F）草酸分解基因的人肝细胞系,探索高草酸尿的治疗方法。方法：分离培养人肠道Ox．F并克隆其功能基因OXC和fre,构建同时表达OXC和fre的真核双表达载体质粒pIRES—oxc-frc,将pIRES-oxe—fre转染人正常肝细胞系L—02。用RT—PCR和Western blot技术了解转基因细胞的目的基因表达状况;用离子色谱法测定转基因后细胞培养液中草酸浓度,了解其草酸分解功能。结果：转基因后人肝细胞系L-02在mRNA和蛋白质水平均成功表达OXC和fre基因,其草酸分解功能较转染前明显增强（P〈0．01）。结论：Ox．F分解草酸的两个重要功能基因OXC和frc能在体外转入人正常肝细胞（L-02）中,并使后者草酸分解能力明显增强。转草酸分解基因的人肝细胞系的构建,有望用于高草酸尿,尤其是PH的病因治疗,值得进一步研究．     

肠道菌群与草酸钙结石的形成

尿中草酸的含量是影响尿草酸钙结石形成的主要因素 ,怎样能够降低尿草酸的排泄量一直是值得关注的问题。肠道吸收性草酸是尿草酸的重要来源 ,肠道细菌分解草酸又是肠道中草酸代谢的重要途径。因此其可能为预防尿路结石提供新途径。     

草酸、草酸钙晶体-上皮细胞相互作用与肾结石

尿中草酸、草酸钙晶体是影响尿石形成的主要因素,但一般只是把它们作为结石的一种成分来看待.近年发现草酸(Ox)、草酸钙晶体(COM)对肾脏上皮细胞有毒性作用,它们和上皮细胞作用产生毒性物质造成上皮的损伤,同时上皮细胞也主动摄入晶体、分泌大分子物质,二者相互作用最终导致结石的形成.这些发现也许能为结石形成机制的研究提供一个新的思路.     

草酸、草酸钙晶体-上皮细胞相互作用与肾结石

尿中草酸、草酸钙晶体是影响尿石形成的主要因素,但一般只是把它们作为结石的一种成分来看待。近年发现草酸(Ox)、草酸钙晶体(COM)对肾脏上皮细胞有毒性作用,它们和上皮细胞作用产生毒性物质造成上皮的损伤,同时上皮细胞也主动摄入晶体、分泌大分子物质,二者相互作用最终导致结石的形成。这些发现也许能为结石形成机制的研究提供一个新的思路。     

人肠道产甲酸草酸杆菌的分离培养

目的探讨产甲酸草酸杆菌分离培养及鉴定方法。方法应用选择性培养基,在37℃厌氧环境下分离培养人肠道产甲酸草酸杆菌。通过观察菌落形态、细菌涂片染色镜检、离子色谱仪及核酸序列分析,对细菌进行鉴定。结果产甲酸草酸杆菌菌落形态为白色点状或梭状,大小约(0.1~0.5)mm×(1.0~3.0)mm;菌落周边出现直径约3.5~4.5 mm的清晰透明圈。该细菌为革兰氏阴性杆菌,大小约(1.0~1.6)μm×(3.0~6.5)μm。液体培养基中草酸浓度随细菌浓度增加而逐渐下降。与文献报道核酸序列比较,该细菌分解草酸的功能基因frc、oxc的核酸同源性分别为95.8%及93.6%。结论产甲酸草酸杆菌可通过选择性培养基、在厌氧环境下从人粪便中分离出来。     

肠道对草酸的处理与尿路结石防治的新进展

近年来 ,草酸的肠道吸收对泌尿系结石的防治正渐渐的被人所重视。本文就草酸的肠道吸收重要性、草酸的肠道转运方式、影响草酸吸收的因素等方面 ,将近年来的新进展加以阐述。     

肾结石大鼠肾组织bikunin mRNA的表达

目的 :研究bikunin在实验性肾草酸钙结石大鼠肾组织的表达及意义。方法 :采用乙二醇和氯化铵诱导大鼠肾草酸钙结石模型形成 ,检测各组大鼠肾功能、肾组织Ca2 + 含量和草酸钙晶体沉积、尿生化指标 ,并用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)检测bikuninmRNA在肾组织的表达情况。结果 :模型组大鼠的血清Cr、BUN、肾Ca2 + 含量、2 4h尿Ca2 + 、草酸 (Ox)分泌量和肾组织bikuninmRNA的表达均明显高于正常组 (P <0 .0 5 )。结论 :高草酸尿和草酸钙结晶的沉积能促使大鼠肾脏通过合成更多的bikunin来抑制大鼠肾组织草酸钙晶体的形成。     

市售酸奶中所含乳酸菌体外分解草酸能力的研究

目的了解市售酸奶中所含乳酸菌菌种和混菌在体外培养基中分解草酸的能力。方法鉴定6种市售品牌酸奶所含乳酸菌菌种,并将各纯菌种和混菌分别接种在3种不同草酸浓度的MRS液体培养基中,对照组不接种细菌,培养72h后检测培养基中草酸浓度变化。结果6种酸奶均含有3种乳酸菌(保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌),经过72h培养,培养基中草酸浓度均有不同程度下降,实验组降幅明显大于对照组,其中嗜酸乳杆菌组降幅最大,在草酸浓度5mmol/L的培养基中,分解了11.0%的草酸。环境草酸浓度越高,乳酸菌草酸分解绝对量也越大,但相对分解率越低。结论市售酸奶中所含乳酸菌种均具有草酸分解能力,其草酸分解量随着环境草酸浓度的增加而增加。     

肠道对草酸的处理与尿路结石防治的新进展

近年来，草酸的肠道吸收对泌尿系结石的防治正渐渐的被人所重视。本文就草酸的肠道吸收重要性、草酸的肠道转运方式、影响草酸吸收的因素等方面，将近年来的新进展加以阐述。     

牛磺酸在草酸钙肾结石患者防治中的应用前景

草酸钙晶体的形成与肾小管上皮细胞的损伤有关.肾脏是一个很容易出现氧化应激损伤的器官,体外细胞培养研究和体外动物模型研究中均发现,暴露于高浓度草酸(Ox)或草酸钙(CaOx)晶体的肾脏上皮细胞会出现细胞膜过氧化损伤.损伤的上皮细胞会促进低饱和度晶体成核,导致肾脏结石的产生.而牛磺酸是已知的较强的抗氧化剂,能减轻氧化应激损伤程度.本文对牛磺酸在草酸钙肾结石患者防治中的应用前景作一综述,为肾结石病因的研究,尤其是对肾结石患者的预防和治疗提供一个新的思路.     

产甲酸草酸杆菌甲酰辅酶A转移酶基因和草酰辅酶A脱羧酶基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的 构建国人肠道来源产甲酸草酸杆菌(OxCF)甲酰辅酶A转移酶(FCoAT)基因(FRC)和草酰辅酶A脱羧酶(OCoAD)基因(OXC)的重组慢病毒pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED,为高草酸尿症的基因治疗奠定基础.方法 采用Taq高保真DNA聚合酶从OxCF基因组中扩增FRC基因和OXC基因片段,用DNA凝胶回收试剂盒切胶回收,用DNA连接试剂盒将回收产物分别与pMD18-T Simple载体连接获得FRC和OXC的克隆载体,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆并测序,筛选携带完整目的基因质粒pMD18T simple-FRC和pMD18T simple-OXC,用BamH Ⅰ酶切获得目的基因,连接FRC和携带绿色荧光蛋白的pLenti6.3/v5DEST-IRES-EGFP,连接OXC与表达红色荧光蛋白的pLenti6.3/v5 DEST-IRES-DsRED,转化DH5α后挑取阳性克隆并测序.构建的慢病毒过表达载体pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED转染HEK293T细胞,包装并测滴度.结果 聚合酶链反应(PCR)从OxCF基因组中扩增分获得1.3kb和1.7kb的DNA片段,与Genbank中FRC( U82167)间碱基序列匹配率为95.88％,存在53个碱基的变异;与Genbank中OXC( M77128)间碱基序列匹配率为93.61％,存在109个碱基的变异;测序证实pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED分别含有大小正确的正向FRC cDNA和OXC cDNA,转染HEK293T细胞实验24h后,在荧光显微镜下相应可见大量绿色荧光和红色荧光,两种慢病毒滴度分别为1.15×108 TU/ml和9.75×107 TU/ml.结论 成功构建表达OxCF中草酸分解关键基因FRC和OXC的重组慢病毒载体,并通过转染293细胞制备了高滴度慢病毒.     

重组前强啡肽基因35型腺病毒载体的构建

目的 构建含前强啡肽(PDP)基因的重组35型腺病毒载体(Ad5/F35).方法 以pUC57-PDP重组质粒为模板扩增PDP基因,将回收的聚合酶链反应(PCR)产物片段克隆入pDC316载体,获得重组质粒pDC316-PDP.骨架质粒pBHG-fiberS/35和穿梭质粒pDC316-PDP共转染293细胞,同源重组产生Ad5/F35-PDP.经PCR鉴定目的 基因的表达.结果 PCR表明Ad5/F35-PDP质粒构建正确.结论 获得的Ad5/F35-PDP可以用于转基因治疗的实验研究.     

肠道菌群在肠-肾轴中对草酸钙结石形成影响的研究进展

草酸钙结石是肾结石的主要类型, 其形成与草酸和钙的代谢密切相关。肠道菌群是定居在人类肠道内的正常菌群, 对机体内多种代谢具有重要的调节作用。既往认为肠道菌群中产甲酸草酸杆菌是草酸钙结石形成的保护因素, 但近年来发现, 调节机体草酸代谢的细菌不仅限于产甲酸草酸杆菌。草酸钙结石患者具有与健康人群不同的肠道菌群, 其通过肠-肾轴调节草酸在机体内的代谢, 影响草酸钙肾结石的形成。本文阐述草酸钙结石患者肠道菌群特点, 总结肠道菌群在草酸钙结石形成中的潜在功能及未来可能的临床应用。     

肠道菌群对草酸钙结石形成影响进展

肾结石是泌尿系统常见疾病之一，受遗传和环境因素的影响。其中草酸钙结石常见且复发率高，因此尿草酸的水平被认为是一个重要的危险因素。肠道草酸吸收增加使得尿草酸排泄增多是形成草酸钙结石的重要病理因素。目前发现微生物可能在肾结石的发病机制和预防中起到重要作用，因此肠道菌群与肾脏疾病的关系是近年来研究的一项热点。目前已知具有降解草酸功能的肠道菌群有产甲酸草酸杆菌、大肠埃希菌、雷氏普罗威登斯菌、乳酸杆菌等。其中产甲酸草酸杆菌是人类发现的第一个专门降解草酸的专性厌氧菌，其余已知草酸降解细菌均为条件性降解草酸的肠道定植菌。本综述主要阐述肠道菌群治疗草酸钙结石的研究进展，为其进一步研究开发提供参考。     

中国人肠道产甲酸草酸杆菌frc基因的分离及其在真核细胞中的表达

目的：探讨中国人肠道产甲酸草酸杆菌甲酰辅酶A转移酶基因（frc）的分离、克隆和鉴定。方法：提取中国人肠道产甲酸草酸杆菌的基因组DNA,利用PCR技术扩增frc基因片段并克隆入真核表达载体pEGFP—C1,重组质粒命名为pEGFP—frc,通过限制性内切酶酶切电泳和测序鉴定插入片段。将pEGFP—frc通过脂质体转染293细胞,通过逆转录PCR（RT—PCR）和蛋白印迹（Western blot）分别从mRNA和蛋白水平检测frc基因在真核细胞中的表达。结果：中国人肠道产甲酸草酸杆菌fre基因全长1287bp,存在53个碱基和4个氨基酸残基的变异,与GenBank中的frc基因的碱基序列的同源性为95．88％,氨基酸残基序列的同源性为99．07％。转染293细胞后24-72h,可观察到明亮的绿色荧光,RT—PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平上检测到frc基因在真核细胞中的表达。结论：中国人肠道产甲酸草酸杆菌中可以分离出frc基因;中国人肠道产甲酸草酸杆菌frc基因存在一定的变异;frc基因可在真核细胞293细胞中表达。     

草酸和一水草酸钙结晶对人肾小管上皮细胞的影响

目的 观察草酸和一水草酸钙结晶对体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)的毒性作用和蛋白表达的影响,探讨上皮细胞受损在肾结石形成过程中的可能作用.方法 体外培养正常人HK-2细胞至长满后,换成无血清培养基,加入草酸至不同终浓度,显微镜下观察结晶的形成及其对细胞的粘附.收集结晶以傅立叶红外光谱仪(FT-IR)分析其成分.CCK-8试剂盒检测1、2、5和10mmol/L草酸分别作用4、12和24 h后对HK-2细胞的毒性反应,Bradford法检测HK-2细胞表达总蛋白量的变化.结果草酸加入含Ca2+的DMEM培养基后,数分钟内显微镜F即可见结晶形成并粘附于细胞表面.FT-IR分析表明结晶成分为一水草酸钙.草酸和一水草酸钙对HK-2的毒性作用呈明显浓度依赖性,但在1～10 mmol/L草酸浓度下毒性作用不随时间延长而增加.1、2、5mmol/L草酸作用12 h和对照组HK-2表达蛋白量分别为(358±51)、(365±43)、(328±52)和(329±60)mg/L,P值均＞0.05,而10 mmol/L草酸作用12 h后,HK-2表达蛋白量为(264±76)mg/L,显著低于对照组(P＜0.05).结论 草酸和一水草酸钙可对正常人HK-2细胞产生毒性损伤,造成细胞表达蛋白的改变,可能在肾结石的形成中起重要作用.     

肠道微生物群落与草酸钙结石的关系研究进展

肾结石是泌尿外科常见病之一。近些年研究发现肠道微生物群落与肾结石之间存在一定的联系。目前研究最为深入的是肠道微生物群落与草酸钙结石形成之间的关系,草酸钙结石患者肠道内菌群有其独特的分布规律。深入研究发现产甲酸草酸杆菌等草酸降解细菌对于肠道草酸的吸收和分泌产生影响,调控草酸钙结石的形成。进而学者们对益生菌的应用与草酸钙结石之间的关系进行研究,发现某些益生菌可以短期内降低尿草酸的排泄。肠道微生物群落代谢过程中会产生大量代谢产物,影响着肾脏炎症性疾病的发生,这些代谢产物可能与肾结石的发生、发展也存在着某种联系。肠道微生物群落作为一个复杂的生态体系,其在肾结石的发生、发展过程中所起的作用还需要大量研究来进一步明确。本文将对肠道微生物群落与肾草酸钙结石之间的关系进展进行综述。     

睾酮影响兔阴茎勃起功能的实验观察

目的 评价睾酮对兔阴茎勃起功能的影响.方法 45只雄性新西兰白兔,等分成对照组(C组)、去势组(Ox组)、睾酮替代治疗组(OxT组).依据替代治疗的睾酮剂量不同,OxT组再等分为OxTa组、OxTb组、OxTc组3个亚组.在第2周、4周、8周测定血清睾酮浓度(STL)、海绵体内压(ICP)和颈动脉血压(SAP).结果 第2周、4周、8周,Ox组STL分别降至C组的17%、14%和13%;ICP(Ox组/C组)分别为(59.3±3.1)/(92.5±4.6)mmHg、(55.7±3.4)/(91.7±3.8)mmHg和(53.6±2.8)/(92.3±4.4)mmHg.睾酮替代治疗8周后,OxTa组、OxTb组和OxTc组ICP分别为(57.6±3.4)mmHg、(73.9±2.9)mmHg和(90.2±4.8)mmHg.Ox组、OxTa组和OxTb与C组之间的ICP峰值差异有统计学意义(P＜0.01),而OxTc组与C组之间差异无统计学意义(P＞0.05).各组ICP基线值及SAP值差异无统计学意义(P＞0.05).结论 STL降低,可以引起ICP峰值下降,补充睾酮,ICP可以恢复正常.因此,我们推测睾酮是影响阴茎勃起功能的重要因素.     

人骨形成蛋白7基因重组35型腺病毒载体的构建与鉴定

目的探讨构建携带人骨形成蛋白7(human bone morphogenetic protein-7,hBMP-7)基因的重组35型腺病毒(serotype35adenovirus,Ad5F35)载体,为基因治疗研究提供一种新的方法,并观察其在兔骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达。方法以pcDNA1.1/Amp-hBMP7质粒为模板扩增骨形成蛋白(BMP-7)基因(1.3kb),将回收的PCR产物片段克隆入pDC316载体,获得重组质粒pDC316-hBMP7。骨架质粒pBHG-fiber5/35和穿梭质粒pDC316-hBMP7共转染293细胞,同源重组产生重组腺病毒rAd5/F35-hBMP7。同样的方法构建rAd5/F35-EGFP。在体外用不同感染复数(M.O.I)值的rAd5/F35-hBMP7和rAd5/F35-GFP分别转染兔MSCs,并留置空白对照。采用流式细胞仪、RT-PCR方法检测目的基因的转染效率和表达。结果PCR、酶切鉴定以及序列测定与比对分析表明,重组腺病毒rAd5/F35-hBMP7质粒构建正确。转染兔MSCs的最高效率可达99%,hBMP-7基因存在于转染后的MSCs中并表达相应的mRNA。结论本实验成功构建了含hBMP-7基因的重组腺病毒rAd5/F35-hBMP7载体,在体外能高效转染兔MSCs。