自体骨髓间充质干细胞介入移植治疗脑梗死临床研究

目的:观察应用自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)介入移植治疗脑梗死的临床疗效和安全性。方法:选择脑梗死患者120例,随机分为干细胞移植组和对照组各60例。对照组给予常规药物治疗,治疗组在常规药物治疗基础上给予重组人粒细胞集落刺激因子150μg皮下注射,待血常规白细胞升高达30×109/L左右后可抽取自体骨髓200 ml。自体骨髓经干细胞分离试剂盒处理获取间充质干细胞。采用自体骨髓间充质干细胞进行干细胞介入移植术,将间充质干细胞超选入脑病变供血动脉。于治疗前、治疗后1个月、6个月进行神经功能FIM评分,应用国际通用的功能独立性评定量表评定其运动和认知能力。结果:120例患者全部进入结果分析,移植组治疗后1个月、6个月功能独立性评定量表评分显著高于对照组,两组比较差异有统计学意义(P<0.01),两组均无不良反应发生。结论:BMSCs移植可以一定程度地改善脑梗死患者症状,提高脑梗死患者的运动和认知功能,自体骨髓干细胞移植是安全有效的。     

自体骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病足1例

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)对于下肢缺血性疾病的治疗性血管生成作用已被实验证实[1].经医院医学伦理委员会批准,我们开展了"自体骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病足"的临床课题,现将1例患者的治疗情况报告如下.     

人骨髓间充质干细胞的分化与端粒酶活性

目的：研究人骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs)的分化特征及其端粒酶活性。方法：取人胚胎股骨骨髓,分离,培养,扩增MSCs,原位杂交法检测MSCs的端粒酶性。将MSCs种植于裸鼠皮下,4周后观察MSCs的分化情况。结果：人MSCs呈端粒酶反应阳性。植入裸鼠体内后可分化成骨,软骨,脂肪,骨骼肌,肌腱样组织和无髓神经纤维束样结构。结论：人MSCs是一种具有多向分化能力的干细胞,具有较高的端粒酶活性。     

体外培养经皮移植自体骨髓间充质干细胞治疗四肢骨不连

目的:探讨体外培养经皮移植自体骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗四肢骨折骨不连的效果。方法:12例四肢骨折骨不连患者采用体外培养经皮移植自体MSCs治疗。结果:9例获得了骨性愈合,骨折愈合平均时间为5个月(4~7月),X线显示骨折线消失,骨痂形成。骨折愈合率为75%(9/12)。结论:体外培养经皮移植自体MSCs治疗四肢骨折骨不连创伤小、安全、并发症少,临床效果满意。     

骨髓间充质干细胞促进皮肤创伤愈合的研究

目的:探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)在组织工程皮肤修复创面缺损中的作用.方法:以标记了PKH26的MSCs为种子细胞构建组织工程皮肤,修复皮肤缺损,HE染色和免疫组织化学染色观察愈合效果,荧光检测追踪细胞转归.结果:移植2 wk后实验组创面基本愈合,愈合时间明显快于对照组,6 wk时仍可检测到红色荧光标记的骨髓间充质干细胞,免疫组织化学染色显示角蛋白和Ⅰ型胶原表达阳性.结论:含有MSCs的组织工程皮肤移植后促进创面愈合,骨髓间充质干细胞在皮肤创伤愈合中起了重要作用,可作为组织工程领域中理想的种子细胞.     

自体骨髓间充质干细胞心肌移植治疗急性心肌梗死的实验研究

目的：观察骨髓间充质干细胞（BMSC） 植入猪急性心肌梗死（AMI） 区的转归及治疗作用.方法：选择10只体重35～45 kg的家猪,经导管应用球囊封堵前降支动脉,建立心肌梗死模型,将存活的9只动物随机分为2组：（1）实验组5只,取骨髓分离BMSC体外培养扩增,建立模型2周后,通过心肌注射的方法将自体骨髓BMSC 移植至AMI 区;（2）对照组4只动物注射等量生理盐水.4 周后比较2组的生存率、心功能变化、心肌功能性蛋白质表达的差异.结果：BMSC移植后,实验组动物心功能得到明显改善,梗死区室壁运动速度加快,局部室壁厚度加快,心肌移植细胞部位表达连接蛋白GATA-4等心肌功能性蛋白质.结论：骨髓BMSC 经冠脉转运在心肌微环境下可向心肌细胞分化,并能改善心功能.     

人骨髓间充质干细胞体内移植安全性评价的初步研究

目的:在建立人骨髓间充质干细胞移植裸鼠模型的基础上,从人骨髓间充质干细胞分布与分化的角度初步探讨移植安全性。方法:选取7例人骨髓标本,采用密度梯度离心差速贴壁法分离与纯化和传代培养人骨髓间充质干细胞,静脉注射人骨髓间充质干细胞移植裸鼠模型,分别于第1周和第4周取材,在受鼠脑、肝、脾、肺、心、肾、肌肉、空肠等脏器组织进行大体与镜下形态学观察,并利用RT-PCR检测人ALu基因与CD45基因在不同脏器组织中的表达,以判断人源性供体细胞的植入与分化情况;此外还检测第4代人骨髓间充质干细胞的成瘤性。结果:分别于第1周和第4周对移植裸鼠取材,在受鼠脑、肝、脾、肺、心、肾、肌肉、空肠等脏器组织均未发现肉眼可见的植入细胞增殖肿块与异常生长物,组织切片行常规HE染色也未发现人源性细胞集落;人源性供体细胞可在肺、肝、脾、肾、肌肉、心、肠、脑等多种脏器或组织中均有不同程度的分布和表达ALu基因,而淋巴细胞分化的CD45基因在肺、心、肾、肌肉、空肠中均有阳性表达。第4代人骨髓间充质干细胞无显著成瘤性。结论:人骨髓间充质干细胞体内移植无显著成瘤性且对各脏器无明显形态学损伤,而且有一定植入分化能力,提示人骨髓间充质干细胞移植安全系数有...     

自体骨髓间充质干细胞移植治疗2型糖尿病的临床研究

目的探究临床中采取自体骨髓间充质干细胞移植治疗2型糖尿病的临床疗效。方法将2009年2月-2011年4月之间收治的240例2型糖尿病患者随机的分为两组,加载组120例患者在原有胰岛素或降糖药基础治疗的同时加入BMSC注射液,每支50mL,内含3×107BMSC。对照组120例患者在原有胰岛素或降糖药基础治疗的同时加入安慰剂,外观,溶解度等与BMSC完全一样,无活性制剂。观察两组的患者治疗效果。结果通过两组的患者治疗效果比较,加载组与对照组的患者治疗后糖化血红蛋白水平、空腹血糖、餐后2h血糖和空腹C肽以及餐后2hC肽含量较治疗前有明显的改善,而加载组改善的效果明显的优于对照组的情况(P<0.05),差异有统计学意义。结论临床采取自体骨髓间充质干细胞移植治疗2型糖尿病具有较好的应用效果,能够有效的降低患者血糖,并改善其临床症状,值得临床中应用与推广。     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠溃疡性结肠炎的修复

目的：观察移植骨髓间充质干细胞（BMSCs）对溃疡性结肠炎（UC）大鼠结肠病变的修复.方法：分离培养、荧光标记SD大鼠BMSCs.A,B,C组大鼠制作UC模型,D组为非模型组.4组大鼠均经尾静脉注射1 mL液体：A组为生理盐水;B,D组为BMSCs;C组为加表皮生长因子（EGF）的BMSCs.移植后3,7,14 d各处死5只大鼠,荧光显微镜下观察荧光标记BMSCs在结肠的分布,光镜观察结肠病变以及TNF-α和IL-10的表达.结果：移植第3日各组均可见BMSCs分布于结肠黏膜,病灶处多于正常结肠黏膜.移植第14日,B,C组结肠BMSCs高于D组（P〈0.05）;与A组比较,B,C组结肠黏膜高表达IL-10,低表达TNF-α,其黏膜损伤修复程度也明显优于A组.B,C组间差异不明显（P〉0.05）.结论：移植BMSCs可促进UC大鼠结肠损伤的修复.单次给予EGF不能促进BMSCs向病灶的迁移和损伤的修复.     

骨髓间充质干细胞修复兔皮肤缺损创面的实验研究

目的研究骨髓间充质干细胞(MSCs)参与皮肤缺损创面修复重建表皮的可能性,为组织工程化皮肤提供新的种子细胞来源。方法自体来源的骨髓MSCs应用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记后,以Ⅰ型胶原为载体植入兔背部左侧全层皮肤缺损创面(治疗组),右侧全层皮肤缺损创面仅植以Ⅰ型胶原作为对照组。于术后6、12天观察创面收缩率,记录愈合时间;术后4、5周切取创面中央再生皮肤组织,行常规病理和BrdU免疫组织化学染色检测,进行对比研究。结果创面收缩率,治疗组>对照组(P<0.05);愈合时间,治疗组<对照组(P<0.05)。常规病理检测治疗组再生皮肤表皮层明显增厚,细胞数目显著增多;免疫组化检测,在治疗组再生皮肤附件毛囊内层以及表皮基底层、棘层可见BrdU阳性标记细胞。结论骨髓间充质干细胞在全层皮肤缺损创面可能分化为表皮细胞参与表皮重建并具有促进创面愈合的作用。     

DMOG促进骨髓间充质干细胞血管新生作用的研究

目的探讨在缺氧缺血清环境下,脯氨酸羟化酶抑制剂———二甲基乙二酰甘氨酸（DMOG）促进骨髓间充质干细胞（MSCs）血管新生的作用及其机制。方法MSCs从大鼠骨髓中分离得到,分为：常氧条件下溶剂对照组（N-DMSO）、缺氧条件下溶剂对照组（H-DMSO）、20μMDMOG加药组（D-20滋M）、100滋MDMOG加药组（D-100滋M）及500μMDMOG加药组（D-500滋M）,观察以下指标：（1）通过缺氧条件下CCK-8检测DMOG在20μM、100μM及500滋M剂量下对MSCs的保护作用,确定DMOG的最佳剂量;（2）通过Matrigel实验观察DMOG促进MSCs血管新生的作用;（3）通过Westernblot法检测血管新生通路相关蛋白表达。结果（1）不同浓度组DMOG对缺氧损伤MSCs的影响：N-DMSO组OD值3.25±0.05,H-DMSO组2.23±0.14,D-20滋M组2.68±0.43,D-100滋M组3.11±0.25,D-500滋M组3.23±0.04。与N-DMSO组比较,H-DMSO组OD值降低（P＜0.01）,与H-DMSO组比较,D-20滋M组、D-100滋M组、D-500滋MOD值均升高（P＜0.05或0.01）。（2）不同浓度组DMOG对正常MSCs的影响：D-20滋M组3.19±0.02,D-100滋M组3.15±0.06,D-500滋M组2.51±0.08。与N-DMSO组比较,D-500滋M组OD值降低（P＜0.01）,D-20滋M组、D-100滋M组与N-DMSO组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）,提示DMOG在20滋M及100滋M对细胞无毒性。（3）血管新生相关蛋白的表达：与H-DMSO组相比,D-100μM组缺氧3、6及24hHIF-1α均增加（1.44±0.32vs7.79±0.23,2.4±0.28vs3.51±0.79,0.93±0.37vs2.46±0.07,P＜0.05或0.01）,pAKT则在缺氧6h增加（0.47±0.15vs0.71±0.03,P＜0.05）,VEGF在缺氧6、24h均增加（0.63±0.10vs0.87±0.14,0.42±0.06vs0.70±0.06,P＜0.05或0.01）,以缺氧24h最为显著。pmTOR/mTOR及pERK/ERK蛋白两组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论DMOG通过抑制HIF-1α降解及促进AKT磷酸化提高缺氧环境下MSCs的血管新生能力。     

同种异体骨髓间充质干细胞复合胶原海绵修复兔桡骨缺损的实验研究

目的：了解兔骨髓间充质干细胞（BMscs）同种异体移植的存活分布情况及同种异体兔BMscs复合胶原海绵（CS）情况,观察其对兔桡骨1.5 cm缺损的修复效果,为将来的进一步应用奠定实验基础。方法：采集、培养、纯化扩增新西兰大白兔BMscs,用eGFP荧光标记BMscs,与胶原海绵联合培养,植于同种异体动物臀大肌,观察存活及分布情况。建立兔桡骨缺损（1.5 cm）模型,45只新西兰大白兔随机分为3组：同种异体BMscs/CS组（A组）,单纯胶原海绵组（B组）,空白对照组（C组）。术后分阶段行X线、组织学检查及生物力学检查,评价其修复效果。结果：eGFP标记的BMscs异体移植存活时间超过3周。X线示12周A组大白兔5只中有4只达到骨性连接。新生骨量呈A组-C组递减,至12周无一愈合。随着时间推移,A组编织骨髓腔和骨小梁增多,修复过程优于B、C组。A组生物力学指标均低于健侧正常对照组,但各指标能达到正常组的80%～90%。结论：同种异体MSCs复合CS可以修复1.5 cm兔桡骨缺损。     

骨髓间充质干细胞对合并局部放射损伤创面促愈作用及机理研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC)对合并局部放射损伤难愈性创面的作用及其机理研究。方法 成年健康贵州小香猪8只,3%戊巴比妥钠静脉麻醉,电子线照射脊柱两旁皮肤,深度1cm,立即在受照射创面打孔,直径2cm,每侧8-10个,一侧为对照组,局部注射生理盐水,一侧为MSC组,局部注射自体MSC,采用早期贴壁法分离小香猪骨髓MSC,将自体的MSC移植到局部合并20Gy的放射损伤创面,采用激素共聚焦,胶原定量EISA,细胞划痕实验,RT-PCR等方法,观察了MSC对合并放射损伤创面,采用激光共聚焦,胶原定量,ELISA,细胞划痕实验,RT-PCR等方法,观察了MSC对合并放射损伤创面的促愈作用及其促愈的机理。结果 将自体的MSC移植到局部合并20Gy创面后能加快创面愈拿 速度,使愈合的时间比对照组提前了3-4d,肉芽组织形成丰富,胶原合成增加,其促愈的机理与MSC分泌IL-8,IL-6,G-CSF等细胞因子吸引和趋化炎症细胞和修复细胞向创面迁移,启动修复,增加伤口中修复细胞（成纤维细胞,血管内皮细胞）的数量有关,同时MSC在创伤局部微环境的作用下,基因和蛋白表达发生变化,尤其是I型胶原基因表达和蛋白合成增加,提示在局部微环境作用下,MSC可分泌细胞外基质或/和直接分化为成纤维细胞参与组织的修复。结论 MSC对局部合并放射损伤的创面有明显有效的促愈效应,MSC的促愈作用是在干细胞与创伤局部微环境相互作用下实现。     

人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化的实验研究

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向血管内皮细胞（ECs）诱导分化的可行性。方法：用贴壁法从成人骨髓中分离出间充质干细胞,培养扩增后,加入10ng／ml的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和人血管内皮生长因子（hVEGF）向ECs诱导分化,分别于0、24d流式细胞术检测细胞表型及荧光染色鉴定细胞。结果：hMSCs向ECs诱导分化24d,细胞CD34、KDR转为阳性,CD54、CD106、vWF表达增加。可摄取ac—LDL,并可结合UEA。结论：hMSCs经bFGF和VEGF作用,分化为具有ECs的表型和部分功能的细胞。     

小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养和鉴定

目的采用全骨髓贴壁培养法分离和体外培养小鼠骨髓间充质干细胞,并通过形态学观察和排除鉴定法进行初步鉴定。方法无菌分离小鼠胫骨和股骨,剪开骨干骺端,用RPMI1640培养基反复液冲洗骨髓腔,收集并过滤离心。DMEM—LG培养基重悬细胞,将细胞悬液转入0．1％明胶包被的培养瓶中,37℃,5％CO2常规进行原代培养并传代。在培养过程中,取不同代数的细胞做CD45流式标记鉴定。结果采用全骨髓贴壁培养法获得的骨髓间充质干细胞贴壁时间短,增殖快,经传代后能够纯化。第4-5代骨髓间充质干细胞形态单一均匀,呈典型的极性漩涡状生长,并不表达白细胞标志抗原CD45。结论本实验可稳定获得均质性良好的小鼠骨髓问充质干细胞,并初步通过鉴定。     

骨髓间充质干细胞的免疫调节活性

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种多潜能的非造血干细胞,可以向多系分化,如骨、脂肪和软骨,并优先归巢于损伤组织,有利于组织修复。体外研究显示它们不诱导免疫应答,对识别、清除同种异体抗原的免疫细胞具有抑制作用。在动物实验中,骨髓间充质干细胞可以诱导外周免疫耐受并向损伤处迁移,抑制致炎细胞因子的释放,促进损伤组织修复。这种独特作用说明它们在细胞治疗和自身免疫性疾病治疗中发挥了积极作用。     

脱细胞真皮联合骨髓间充质干细胞修复糖尿病大鼠皮肤全层缺损创面的研究

目的研究以骨髓间充质干细胞为种子细胞、脱细胞真皮为支架的组织工程皮肤对糖尿病大鼠皮肤全层缺损创面愈合的影响。方法 36只大鼠随机分为3组,A组：骨髓间充质干细胞＋脱细胞真皮实验组;B组：脱细胞真皮对照组;C组：空白对照组。观察创面愈合及5-BrdU阳性细胞表达角蛋白的表达情况。结果 A组第3、5、7及14 d创面愈合率分别为（19.10%±3.52%）、（29.80%±4.10%）、（56.71%±8.07%）与（88.12%±5.31%）,明显快于B、C两组（P〈0.05）。A组新生皮肤的细胞结合有序,排列紧密,真皮层较厚,有大量皮肤附属器及血管形成,明显多于B、C两组。免疫组化检测BrdU阳性细胞表达角蛋白。结论骨髓间充质干细胞联合ADM可有效促进糖尿病大鼠创面的愈合。     

大鼠骨髓间质干细胞的BrdU体外标记和体内示踪研究

目的探讨骨髓间质干细胞(BMSCs)的体外标记和体内示踪技术。方法分离培养并鉴定大鼠BMSCs,进行5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记后,体外培养被标记的BMSCs,观察其连续传代后的BrdU可标记时间和标记效率;建立大鼠胃黏膜损伤模型,将分离纯化的BrdU标记BMSCs移植到损伤的胃黏膜下,体内观察BrdU对活体移植BMSCs的示踪作用。结果免疫组化显示体外培养大鼠BMSCs的CD44、CD90表达阳性,CD14、CD45表达阴性,显微结构表现出干细胞特征。进行BrdU标记后,标记阳性率随标记时间延长而增高,48h达高峰,72h仍维持高阳性率。终浓度为10μmol/L的BrdU孵育48h、72h阳性标记率高于5μmol/L BrdU组(P<0.05),但与15μmol/L BrdU组阳性标记率差异无统计学意义(P>0.05),并且连续传代培养21d后也可检测到。BrdU可示踪BMSCs在损伤的胃黏膜下局部定植。结论 BrdU在浓度为10μmol/L、标记时间48h至72h标记效率较高;BrdU标记可用于一定时间段内BMSCs移植入体内后定植和生长的动态示踪观察方法。     

骨髓间充质干细胞分化为内耳毛细胞前体细胞的研究

目的 探索大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）体外诱导分化成内耳毛细胞前体细胞的过程,以期为耳蜗MSCs移植提供实验依据.方法 采用贴壁法提取SD大鼠MSCs,体外培养纯化.分别以EGF＋IGF-1＋BDNF＋ATRA、EGF＋IGF-1＋bFGF＋BDNF＋NT-3作为诱导条件,诱导MSCs分化.观察诱导组及对照组细胞形态的变化,并采用免疫细胞染色法检测毛细胞前体细胞或毛细胞特异性抗原myosinVI、Pax-2、nestin、p27kip1的表达.结果 EGF＋IGF-1＋BDNF＋ATRA诱导组细胞呈短梭形样、方形样,未形成突触;myosin VI、Pax-2、nestin、p27kpi1均有不同程度阳性表达.EGF＋IGF-1＋bFGF＋BDNF＋NT-3诱导组细胞变圆或变细长,逐渐伸出突触,部分形成网络状、大环状结构;nestin、p27kpi1均呈阳性表达.结论 大鼠MSCs在体外培养诱导分化后,可形成内耳毛细胞前体细胞和神经前体细胞.     

骨髓间质干细胞对大鼠脑损伤后血管再生的影响

目的：探讨骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)对大鼠颅脑损伤后血管再生的影响。方法：自由落体法建立大鼠脑撞击伤模型,50只Sprague-Dawley大鼠随机分为移植组和对照组,每组25只。移植组大鼠手术后12 h侧脑室注射法移植BM-MSCs,对照组仅注射生理盐水。术后第 1,3,7,14和21天行改良大鼠神经功能缺损评分(modified neurological deficit scores of rats,mNSS)。于术前,术后3,6,12,24 h和3,7 d采用流式细胞仪检测大鼠外周血CD34和CD133抗体双标记细胞。免疫组织化学SP法检测损伤周围脑组织CD31和神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)的表达。结果：两组间mNSS分值差异有统计学意义(F=5.997,P<0.05),组内不同时间点间差异也有统计学意义(F=37.106,P<0.01)。术后第7,14,21天对照组较移植组 mNSS评分高,差异有统计学意义(均P<0.05)。大鼠外周血中存在CD34和CDl33双阳性细胞表达。对照组大鼠外周血中CD34和CDl33双阳性细胞数伤后3 h为下降状态,后升高,伤后6 h达最高点,此后逐渐下降,伤后24 h降至正常水平。移植组有同样的趋势,CD34和CDl33双阳性细胞升高持续到伤后24 h,其数量明显高于对照组(P<0.05)。术前两组NSE均有阳性表达,术后7,14 d时移植组的NSE表达显著高于对照组(P<0.05)。术前两组CD31的阳性表达很少,术后3,7 d时移植组的CD31表达显著高于对照组(均P<0.05)。结论：BM-MSCs移植可以增加脑创伤后大鼠外周血中内皮祖细胞数量并持续约24 h,可以调高大鼠脑创伤后损伤周围区的血管生成标志物的表达和神经元标志物的表达。BM-MSCs移植组大鼠脑损伤后神经功能较对照组改善明显。