PCR检测Pf60.1基因诊断恶性疟实验方法研究

为探讨通过PCR检测Pf60.1基因来诊断恶性疟的可行性,采用PCR检测了4年前采集贮存的20例疑似疟疾病人的血样,阳性对照为生疟原虫FCC1／HN培养株;阴性对照为食蟹猴疟原虫、间日疟原虫及非疟区的正常供血员血样。结果为FCC1／HN株、12例镜检定为恶性疟和2例混合感染的血样扩增出长度为313bp-320bp的特定Pf60.1基因片段,而阴性对照均未产生DNA带型。此结果说明检测Pf60kD中的Pf60.1基因片的方法稳定性好,特异性强和敏感性高,是恶性疟诊断的理想方法之一。     

恶性疟原虫FCC1／HN株Pf332基因的克隆和测序

目的 构建恶性疟原虫海南（FCC1/HN）株红细胞膜相关巨大蛋白（Pf332）部分基因的真核表达载体;并测定Pf332基因序列,了解FCC1/HN株与3D7、Palo Alto株Pf332基因序列的差异。方法 根据已知Pf332基因序列设计合成一对引物,用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增Pf332基因片段;将Pf332部分基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞;阳性克隆的重组质粒DNA经酶切、PCR扩增鉴定,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用分子生物学软件辅助分析Pf332序列及进行同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1/HN株Pf332基因片段;经双酶切及PCR鉴定表明获得正确的pcDNA3-Pf332重组质粒。测序表明,获得的FCC1/HN株Pf332基因片段大小为1260bp,编码420个氨基酸残基。恶性疟原虫FCC1/HN株与3D7、Palo Alto株间Pf332基因片段编码的氨基酸残基中分别有1个、15个位点不同。结论 从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中获取Pf332基因片段,成功构建真核表达重组质粒pcDNA3-Pf332;FCC1/HN与3D7株间比FCC1/HN与Palo Alto株间的Pf332基因序列的同源性高。     

恶性疟原虫FCC1／HN株Pf12基因体外扩增、克隆及序列分析

目的：构建恶性疟原虫FCC1／HN株Pf12基因原核表达质粒pET28α-Pf12,测定Pf12基因序列,并为FCC1／HN株Pf12的体外表达奠定基础。方法：采用PCR技术从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA中扩增出Pf12基因,扩增产物经纯化,用BamHI XhoI双酶切,定向克隆入pET28α质粒,转化大肠杆菌DH5α,再用BamHI XhoI酶切及PCR扩增对重组子进行鉴定。用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定,并应用PCGENE软件进行同源性比较及预测抗原表位。结果：筛选出编码FCC1／HN株Pf12基因的原核表达质粒pET28α－Pf12重组质粒的构建,为恶性疟原虫FCC1／HN株Pf12基因的体外表达奠定基础。     

恶性疟原虫海南株STARP基因真核表达重组质粒的构建及基因结构分析

目的 构建恶性疟原虫海南（RCC1／HN株）STARP基因真核表达重组质粒pcDNA3-STARP;分析STARP基因结构,并了解FCC1／HN株与其它分离株STARP基因序列的差异。方法 根据STARP基因已知序列设计合成两对引物,用PCR技术从RCC1／HN株基因组DNA中扩增两个部分序列重叠的STARP基因片段;将两基因片段分别双酶切后定向克隆入真核表达载体pcDNA3,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。酶切,PCR扩增鉴定筛选重组质粒阳性克隆;用双脱氧链末端终止法测序,应用软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果 分别PCR扩增获得1078bp,1092bp的两个STARP基因片段;经双酶切及PCR鉴定表明获得正确重组质粒;恶性疟原虫FCC1／HN株与T9／96株STARP基因核苷酸序列同源性92．2％;推测编码氨基酸序列同源性为90．9％;在STARP蛋白中部重复区推测有多个明显的抗原表位区段。结论 从FCC1／HN株恶性疟原虫基因组DNA中获取STARP基因,并成功构建真核表达重组质粒pcDNA3－STARP;FCC1／HN株与其它分离株STARP基因有高度的同源性。     

恶性疟原虫传播阻断抗原Pfs25和Pfs48/45基因编码序列的体外扩增

目的：体外扩增编码恶性疟原虫传播阻断抗原Pfs和Pfs48／45的基因序列,为进一步对其进行克隆和体外高效表达创造条件。方法：特定寡核苷酸引物的设计、合成与纯化;恶性疟原虫FCC1／HN株体外培养;利用碱裂解法从培养的恶性疟原虫FCC1／HN株提取染色体DNA;PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分析。结果：从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA中特异扩增出编码Pfs25和Pfs48／45基因序列,其片段大小分别为657bp和1,359bp。而用间日疟原虫基因组DNA为模板作对照,无扩增条带出现。结论：体外扩增编码恶性疟原虫传播阻断抗原Pfs25和Pfs48／45基因序列与预期长度相符合,从而,为该基因的克隆、测序和表达奠定基础。     

恶性疟原虫FCC1／NH株裂殖子表面蛋白MSP1第2—5区基因的PCR扩增及克隆

构建恶性疟原虫FCC1／HN株MSP1基因2～5编码区真核表达质粒pcDNA3／MSP1，为FCC1／HN株MSP1的体外表达及其基因工程疫苗的研制奠定基础。方法采用PCR技术对恶性疟原虫海南分离株（FCC1／HN）基因组DNAMSP1第2～5区基因片段进行扩增．扩增产物经纯化后用Xhol和Aaal双酶切然后定向克隆入pcDNA3质粒，转化大肠杆菌TG1．再用相同内切酶酶切和PCR扩增对重组子进行鉴定。结果筛选出编码FCC1／HN株MSP1第2～5区基因片段的真核表达质粒pcDNA3／MSP1。结论编码FCC1／HN株MSPI第2～5区基因片段的真核表达质粒pcDNA3／MSP1的构建，为恶性疟原虫FCC1／HN株MSP1的体外表达及其基因工程疫苗的研制奠定基础。     

恶性疟原虫FCC1／HN（CQS）株Pfmdr1、Cgl基因T—A克隆及序列分析

目的：将恶性疟原虫FCC1／HN株（CQS）Pfmdrl和Cgl全基因编码区克隆入测序载体，测定其序列，为以后研究其为疟原虫耐药性的关系奠定基础。方法：利用PCR扩增技术，分3个片段从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA中，特异扩增Pfmdrl全基因编码序列；分2个片段特异扩增Cgl基因编码序列。扩增产物经纯化回收后，T－A克隆入测序载体pMD18-T，转化大肠杆菌（E.coli)jm109，筛选阳性克隆，并进行双酶切及PCR扩增鉴定，获得阳性重组质粒，用Sanger双脱氧链终止法进行DNA测定。结果：CQS FCC1／HN株Pfmdrl基因序列与CQS Fc27株同源性高，全长4248bp，编码1415个氨基酸；测得Cgl基因全长为2820bp，编码939个氨基酸，存在串联α重复序列。结论：恶性疟原虫FCC1／HN（CQS）株Pfmdrl和Cgl全基因编码序列的测定，为以后研究耐药性虫株的上述基因以及它们与疟原虫耐药性的关系奠定基础。     

恶性疟原虫FCC1／HN株谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）谷氨酸脱氢酶（GDH)基因并测定其序列，比较FCC1／HN株与国外分离株GDH基因序列的差异。方法 根据GDH基因已知序列设计合成一对引物，应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增GDH基因，并将其克隆入pMD18-T载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后，用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用DNAstar软件比较不同分离株GDH基因序列的同源性。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株GDH基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-GDH重组质粒。测序表明，恶性疟原虫FCC1／HN株GDH基因全长1329bp，编码442个氨基酸。序列分析表明，我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的FCQ27、K1株GDH基因编码的氨基酸序列有少量的差异。结论 克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株GDH基因；序列测定及同源性分析表明，FCC1／HN株与其它分离株的GDH基因序列有较高的同源性。     

恶性疟原虫ABRA基因真核表达重组质粒的构建及序列分析

目的 构建恶性疟原虫海南（FCC1／HN）株ABRA基因真核表达重组质粒pcDNA3-ABRA;测定ABRA基因序列,并了解FCC1／HN株与其它分离株ABRA序列的差异。方法 根据ABRA基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从FCC1／HN株基因组的DNA中扩增ABRA基因,将ABRA基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;用切,PCR扩增鉴定筛选到的重 质粒阳性克隆。以正确的重组质粒为模板,用双脱氧链末端终止法测定ABRA基因序列,应用软件辅助分析ABRA序列及进行同生比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株ABRA基因;经双酶切及PCR鉴定表明获得正确的pcDNA3-ABRA重组质粒。测序表明,FCC1／HN株ABRA基因大小为2220bp,编码739个氨基酸。恶性疟原虫FCC1／HN株与Camp,3D7,FC27株ABRA基因编码氨基酸序列主要在C－端存在少量不同;FCR3株与以上4株ABRA基因编码氨基酸序列相比,只有少量的氨基酸替换。结论 从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA中获取ABRA基因,成功构建真核表达重组质粒pcDNA3-ABRA,并测定了FCC1／HN株ABRA基因的序列;FCC1／HN株与其它分离株ABRA基因有很高的同源性。     

恶性疟原虫海南株FEN-1基因的克隆及序列分析

目的 克隆并测定恶性疟原虫海南株(FCCl／HN)侧翼核酸内切酶-1(FEN-1)基因序列，比较FCC1／HN株与国外分离株FEN-1基因序列的差异。方法 根据FEN-1基因已知序列设计合成1对引物，应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出FEN-1基因，构建重组质粒PMD18-T-FEN-1。阳性克隆的重组质粒经酶切鉴定后进行测序。应用DNAMAN分析软件进行不同分离株FEN-1基因序列的同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株FEN-1基因序列，基因全长1947bp，A T含量为56％，G C含量为44％。酶切鉴定获得了正确的PMD18-T-FEN-1重组质粒。测序表明，恶性疟原虫FCC1／HN株与国外Gambia株和3D7株的FEN-1基因序列有较高的同源性。结论 成功克隆恶性疟原虫FCC1／HN株FEN-1基因。序列测定及同源性分析表明，恶性疟原虫FCC1／HN株与国外已报道各株的FEN-1基因序列有高度同源性。     

聚合酶链反应用于鉴别恶性疟原虫不同分离株的研究

用恶性疟原虫主要裂殖子表面抗原基因序列（ＭＳＡ－１）为引物的聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测恶性疟原虫感染。用此方法扩增实验室体外培养的ＦＣＣ１／ＨＮ株恶性疟原虫，显示１条３００ｂｐ的ＤＮＡ片断，而对实验室培养的巴布亚新几内亚ＦＣＱ－２７株则显示１条４４０ｂｐＤＮＡ条带。用此方法检测１５份采自云南中缅边界的恶性疟血样均能扩增出ＤＮＡ条带，但不同血样的ＤＮＡ条带的分子量不同，部分血样还存在１条以上的ＤＮＡ条带。在同时扩增的１０份正常人血样和１０份采自江苏间日疟流行区的现症间日疟血样中均没有发现ＤＮＡ条带。表明此方法具有很高的种和株的特异性。     

套式PCR扩增特定SSU rRNA基因片段检测四川疟原虫感染的研究

目的用套式PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。方法以疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸（SSUrRNA）基因为靶基因,选用1对疟原虫属特异性引物和4对种特异性引物,建立套式PCR扩增系统并用于四川省疟疾病人血样的检测。结果从间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出104bp、102bp和115bp预期大小的特定扩增带。61份血样检测结果与镜检的间日疟阳性符合率为100％。并查出镜检漏诊的2例P.v.和P.m.的混合感染及1例P.v.、P.f.和P.m.的混合感染病例。结论本系统特异、灵敏、稳定、简便,可在诊断疟疾的同时判定混合感染,故对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控有实际应用价值。     

套式PCR扩增SSU rDNA特定片段检测云南金平县疟原虫感染的研究

目的　采用套式 PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。　方法　采用已建立的套式 PCR系统扩增 SSU r DNA特定片段检测云南金平县恶性疟镜检阳性患者的 6份血样 ,并设阳性与阴性对照。　结果　间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出 10 4 bp、10 2 bp和 115 bp预期大小的特定扩增带。正常人血、人源弓形虫、杜氏利什曼原虫 DNA及灭菌双蒸水均未产生特异扩增带。 6份血样中检出 4份 P.v.、P.f.和 P.m.的混合感染 ,1份 P.v.和 P.f .及 1份 P.f .和 P.m.的混合感染。　结论　该系统特异、灵敏、稳定 ,在诊断疟疾的同时可准确地判定混合感染 ,对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控等具有实际应用价值。     

套式/多重PCR诊断疟疾的敏感性、特异性和稳定性初探

目的 提高标签引物?鄄套式/多重PCR诊断疟疾的敏感性、特异性与稳定性。 方法 用滤纸法采集非疟疾发热病人血样30份及其他传染病（感冒， 流感， 伤寒， 肝炎等）患者血样20份；抽取恶性疟和间日疟各1例患者血4 m1，进行系列稀释制备不同疟原虫含量的感染血样；健康者血样作对照。用热裂解法制备DNA模板，用线粒体细胞色素氧化酶基因作为靶基因，应用相关软件和网络资源（Primer Premier 5.0, PUBMED, NCBI-BLAST和Mfold服务器）设计和优化标签引物?鄄套式/多重PCR，并用于检测所采集制备的各种血样。 结果 间日疟与恶性疟患者血系列稀释为含 1 000、100、10和1个虫/μl后经标签引物?鄄套式/多重PCR检测，恶性疟和间日疟患者各稀释含虫血样分别在611 bp和255 bp出现1条带，能检测到原虫密度均为1个虫/μl血；非疟疾发热病人血样30份及其他传染病患者血样均为阴性；健康者血样未出现扩增条带，每种血样反复测试3次以上均获得同样结果。 结论 经优化的标签引物-套式/多重PCR在疟疾诊断中具有较高的敏感性、特异性和稳定性。     

Evaluation of three rapid tests for diagnosis of P. falciparum and P. vivax malaria in Colombia

The diagnostic capacity of three malaria rapid diagnostic tests (RDTs), NOW-Malaria-ICT, OptiMAL-IT, and Paracheck-Pf, was evaluated against expert microscopy in Colombia. We tested 896 patients, of whom microscopy confirmed 139 P. falciparum, 279 P. vivax, and 13 mixed P.f/P.v infections and 465 negatives. Paracheck-Pf and NOW-malaria-ICT were more accurate in detecting P. falciparum (sensitivities 90.8% and 90.1%, respectively) in comparison with Optimal-IT (83.6%). NOW showed an acceptable Pf detection rate at low densities (< 500/microL), but resulted in a higher proportion of false positives. For P. vivax diagnosis, Optimal-IT had a higher sensitivity than NOW (91.0% and 81.4%, respectively). The choice between the two Pf/Pv detecting RDTs balances P. falciparum and P. vivax detection rates. Considering some degree of P. falciparum overtreatment and failure to detect all P. vivax cases as more acceptable than missing some cases of P. falciparum, we recommend careful implementation of NOW-malaria-ICT in areas where microscopy is lacking. The price is however still a constraint.     

聚合酶链反应（PCR）技术在恶性疟诊断中的应用

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测云南疟疾病人血样５３份，结果均为阳性，可出现一条４９２ｂｐ的特异条带，与镜检符合率达１００％；同时检测间日疟血样８份及上海正常人血样１２份，均为阴性，表明本法具有高敏感性及特异性。     

复式PCR检测间日疟原虫和恶性疟原虫的现场应用

目的探讨复式PCR方法在疟疾诊断中的现场应用价值。方法根据疟原虫18 S rRNA基因序列,合成疟原虫属特异性上游引物和间日疟原虫、恶性疟原虫种特异性下游引物,优化PCR反应体系,建立在同一PCR反应体系中同时检测间日疟原虫、恶性疟原虫基因组特异性DNA片段的疟疾诊断方法,并评价其现场应用价值。结果间日疟原虫和恶性疟原虫基因组DNA经过复式PCR后,分别扩增出1 451 bp和833 bp的特异性条带,而伯氏疟原虫、食蟹猴疟原虫及健康人血样均无扩增带出现,用该反应体系可检出原虫血症为1.1×10-6和5.6×10-7的间日疟原虫和恶性疟原虫感染。与镜检法相比,复式PCR检测119份现场样本,112份与镜检结果相同,阳性率为54%,漏诊率为0.8%,误诊率为0,而镜检法依次分别为53%、1.7%和3.4%。结论复式PCR方法检测疟原虫具有简便、快速、特异、敏感等优点,在疑似病例的鉴别诊断和分子流行病学调查中具有良好的应用价值。     

PCR扩增环子孢子蛋白基因3' 端片段用于检测恶性疟原虫的初步研究

目的 :建立 PCR检测恶性疟原虫的新方法。方法 :作者采用自行设计并合成的一对恶性疟原虫特异引物 ,经 PCR扩增环子孢子蛋白 ( CSP)基因 3 端保守区序列 2 4 5bp片段 ,观察了它的特异性、敏感性和稳定性。结果 :1从 4株培养的恶性疟原虫和 2例恶性疟患者血样中均扩增出约 2 4 5bp的 DNA目的片段 ,用业已鉴定的 CSP基因序列作模板再行扩增证实其为恶性疟原虫CSP基因片段 ;2对间日疟原虫、利什曼原虫、弓形虫和健康人血样进行 PCR反应 ,均未见扩增条带 ;3本检测系统可检出恶性疟原虫感染血样中 0 .18个原虫所含的 DNA模板 ;4采用不同方法制备模板及不同反应方式均能获得满意结果 ;结论 :PCR扩增恶性疟原虫 CSP基因 3 端片段用于恶性疟原虫检测具有灵敏、高度特异且稳定性好等优点。     

Evaluation of quantitative buffy coat (QBC) assay and polymerase chain reaction (PCR) for diagnosis of malaria

A prospective study was undertaken to compare the Polymerase Chain Reaction (PCR) and Quantitative Buffy Coat (QBC) assay with conventional Giemsa technique for diagnosis of malaria. A total of 104 samples were taken for the purpose. They comprised of fever cases suggestive of malaria (n=74) and control group, fever cases other than malaria (n=30). Peripheral blood smears were prepared by Giemsa staining and QBC assay was performed as per standard protocol. From the stored blood samples, parasite DNA was extracted and PCR was performed using P. falciparum and P. vivax specific sets of primers. The QBC assay was 100% in agreement with the Giemsa stain. Specificity of the PCR detection of P. falciparum parasites was 100%. However, sensitivity for detection of P. falciparum and P. vivax by PCR was 64.28% and 82.35% respectively. In mixed cases of malaria (n=2), PCR results were in 100% agreement with that of Giemsa. The lower sensitivity of PCR for P. falciparum could probably be due to inaccessibility of target DNA, presence of PCR inhibitors in samples and parasite strain variations.