利用绿色荧光蛋白筛选酵母突变株的新方法

目的建立快速简便筛选酵母突变株的方法。方法利用同源重组技术,通过转座子上的GFP基因,从酵母基因组文库中,检测发生突变的菌株,从而筛选出酵母突变株。结果应用荧光显微镜观察SC-ura 选择平板筛选出的酵母,有绿色荧光发出的即为阳性菌落。结论利用同源重组技术,初步筛选出了所需的酵母突变株。     

酵母突变株的筛选

目的：建立快速、简便的筛选酵母突变株的方法。方法：利用同源重组技术，通过转座子上的LacZ报告基因，从酵母基因组文库中，将发生突变的菌株进行检测，从而筛选出酵母突变株。结果：在X－gal培养基上出现蓝色菌溶，即为所需的阳性菌落。结论：利用同源重组技术，初步筛选出所需的酵母突变株，为新的功能性基因组的研究和发展，为基因药物的研究与开发构建平台。     

一种快速简便初步筛选酵母基因组文库的方法

目的 建立一种快速，简便，灵敏的筛选酵母基因组文库的方法。方法 利用同源重组技术，将酵母基因组文库中发生突变的菌株通过LacZ报告基因进行检测，从而检测出酵母突变株。结果 在X-gal培养基上出现蓝色菌落，即为所需的阳性菌落。结论 运用同源重组技术，初步筛选了所需的酵母突变株，为新的功能性基因组的研究和发展构建平台。     

同源重组构建表皮葡萄球菌附属基因调节子（agr）阴性突变株（摘要）

目的构建表皮葡萄球菌agr阴性突变株，以期得到除agr基因以外相同遗传背景的突变株与野生株。方法首先构建同源重组质粒pBT2-Δagr，后电传入金黄色葡萄球菌RN4220，再转入表皮葡萄球菌3298。通过pBT2载体对温度敏感的特点，含重组质粒的表皮葡萄球菌3298在40℃多次传代，最终筛选出agr阴性的突变株。结果同源重组质粒pBT2-Δagr通过酶切鉴定证明构建成功，     

金黄色葡萄球菌酚溶调控蛋白α小肽敲除对自溶素AtlA蛋白表达的影响

目的 利用同源重组技术构建金黄色葡萄球菌Newman psmα基因缺失突变株,探究psmα缺失对金黄色葡萄球菌蛋白表达的影响.方法 分别扩增psmα基因的上下游同源臂,根据同源重组原理,构建pBT2基因打靶载体,利用同源重组技术,构建psmα缺失的Newman突变株.并对野生株和突变株培养上清蛋白进行研究.结果 突变株培养上清中一个相对分子质量约为135×103的蛋白表达水平较野生株明显减少甚至缺失;质谱分析提示该蛋白为金黄色葡萄球菌atlA基因编码的双功能自溶素前体蛋白(AtlA蛋白);实时荧光定量PCR结果显示psmα基因敲除株atlA基因的转录水平较野生株显著降低.结论 psmα缺失后能够降低atlA基因的转录表达水平.     

山蛭素Hs基因在甲醇毕赤酵母中表达

[目的]山蛭素基因在甲醇毕赤酵母中表达。[方法]利用PCR点突变方法改造山蛭素基因，将山蛭素基因克隆到pGEM-Teasy载体中，对重组质粒测序，构建了毕赤酵母表达载体pPIZB-Hs，然后转化有活性的GS115酵母菌株，筛选表达酵母菌株GS115，摇瓶发酵。[结果]改造的山蛭素基因在重组酵母中表达，重组蛋白质具有对凝血酶抑制活性。[结论]利用PCR点突变方法能改造山蛭素基因，并能在毕赤酵母中表达。     

人DNA修复基因hR24L参与细胞周期检定点调控

目的：研究酵母ＲＡＤ２４Ｌ基因功能，克隆人类同源物。方法：分离ＲＡＤ２４基因区域ｒａｄ２４Ｌ突变株，以人的ｃＤＮＡ表达文库转化突变株，筛选回复表型；大剂量Ｘ线照射观察细胞周期。结果：ｒａｄ２４Ｌ对紫外线敏感，从转化文库后的回复表型中克隆出人类ｈＲ２４Ｌ全长ｃＤＮＡ。结论：克隆的人类ＤＮＡ修复基因ｈＲ２４Ｌ，它能校正ｒａｄ２４Ｌ的突变表型，参与细胞周期检定点调控。     

弓形虫SAG1成熟蛋白编码区基因在甲醇酵母中的初步表达

目的：分析弓形虫主要表膜蛋白SAG1在甲醇酵母高效表达系统表达的可行性。方法：在5′端和3′端引物分别引入EcoRI和SpeI酶切位点，PCR扩增SAG1成熟肽编码区基因，定向克隆到甲醇酵母分泌型表达质粒pMETαA中，构建不带6个组氨酸尾序列的重组质粒。重组质粒被PacI酶切下表达盒，氯化锂化学法转化腺嘌呤营养缺陷型毕赤甲醇酵母株PMD11和PMD16，通过腺嘌呤营养缺陷型选择培养基YPD筛选酵母重组子，并利用MM／MD选择培养板分析外源基因表达盒整合到重组酵母染色体中的方式。筛选甲醇利用野生型的重组酵母，用甲醇诱导表达，并分析SAG1的表达水平，从中筛选高表达转化子。结果：获得了经非同源重组整合到酵母染色体上的能有效利用甲醇作为唯一碳源的PMD11和PMD16转化株。在甲醇诱导后第3天，细胞裂解液SDS－PAGE检测开始出现分子量与目的蛋白预测分子量相同的蛋白带，但PMD11重组株中的该蛋白随培养时间延长而减少，而PMD16重组株中的目的蛋白量未见减少。上清中有40kDa和27kDa的两种蛋白，后的量大于前，并与SAG1成熟肽的大小一致，PMD16株的表达量大于PMD11株，总蛋白量约35μg/ml。结论：弓形虫SAG1基因可在甲醇酵母表达系统中表达，但PMD11宿主菌会降解外源蛋白，而缺失了蛋白酶的PMD16宿主菌能比较高效地表达、分泌SAG1成熟蛋白。     

人生长激素基因在酿酒酵母中的同源重组及初步鉴定

目的 :将人生长激素基因构建至pHSS6 mTn 3×HA/lacZ转座文库载体中 ,利用酿酒酵母同源重组稳定高效表达人生长激素。　方法 :通过两步PCR获得带有信号肽的目的基因 ,插入到文库载体的Sse8387I位点中 ,NotI酶切 ,酵母同源重组 ,SC Ura筛选 ,酵母菌落PCR及lacZ基因表达初步鉴定阳性重组子。　结果 :酵母菌落PCR初步鉴定 ,筛选出目的基因正确插入的重组子 ,其中两株有lacZ基因高表达。　结论 :对阳性重组子进行lacZ显色反应 ,筛选出可高水平表达x gal的菌株 ,以此推测重组位点前有强启动子 ,为目的基因的稳定高效表达奠定基础。     

人DNA修复基因HR24L/HRAD17校正酵母细胞减数分裂缺陷表型

啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DNA修复基因RAD24在进化上具有高度保守性, 非洲粟酒酵母(Schizosaccaromyces pombe)的同源物则是RAD17.我们分离了啤酒酵母RAD24基因温度敏感突变株rad24L,进而用遗传互补法克隆出人类同源基因HR24L (北京医科大学学报,1999,31:269) .继我们报道之后,美国哈佛大学学者通过分析基因组信息,比较与非洲粟酒酵母RAD17同源片段,利用PCR方法扩增出人类RAD17同源cDNA,然后筛选文库获得人类RAD17(HRAD17)基因(Cancer Research, 1999,59:2023-2028),序列测定结果表明与我们克隆的HR24L是同一个基因.该基因编码的产物不仅参与DNA损伤切除修复和重组修复,而且还参与细胞周期检定点调控.鉴于细胞周期检定点调控是体细胞进行有丝分裂(mitosis)和生殖细胞进行减数分裂(meiosis)共有的周期性事件,因此,我们用遗传学方法分离酵母细胞减数分裂突变株,用功能互补法研究人HR24L基因的互补作用.     

suc2基因的克隆及在酵母基因组中的定位突变

目的 克隆酿酒酵母的蔗糖转换酶基因（ｓｕｃ２）,并定位突变酵母基因组中的ｓｕｃ２基因以获得无蔗糖转换酶表达的酵母品系。方法 用ＰＣＲ法从酵母Ｙ１９０基因组中扩增出ｓｕｃ２的成熟肽基因片段,克隆后测序。将色氨酸合成酶（ＴＲＰ）基因片段插入ｓｕｃ２基因中,构建成用于同源重组的ｓｕｃ２基因定位突变载体。导入酵母Ｙ１９０,用营养缺陷筛选出ｓｕｃ２基因突变的克隆。用ＰＣＲ扩增并克隆突变后的ｓｕｃ２基因,用序     

Fis对伤寒沙门菌基因表达的系统调节作用

目的：探讨伤寒沙门菌调节因子fis对基因表达的系统调节作用。方法：用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌fis基因缺陷变异株,用脉冲场凝胶电泳分析fis缺陷变异株的基因组结构。利用伤寒沙门菌全基因组DNA芯片分析技术,比较伤寒沙门菌野生株和fis基因缺陷变异株的基因表达谱差异。用重组载体pBADfis回补fis缺陷变异株,选择部分差异表达基因进行qRT—PCR验证,用半固体平板培养观察野生株、fis缺陷变异株和回补株的动力。结果：fis基因缺陷变异株含有二相鞭毛素编码基因的线性质粒缺失,且动力消失;基因表达谱比较分析结果表明,伤寒沙门菌fis基因缺陷变异株在对数生长期94个基因出现表达差异;qRT—PCR分析所选基因表达的结果与芯片分析结果相符;fis缺陷变异株在回补fis基因后,动力及差异表达基因都获得明显恢复。结论：Fis在伤寒沙门菌中对动力、侵袭及多种代谢相关基因的表达发挥重要调节作用。     

乳酸菌同源重组载体的构建与鉴定

【目的】构建乳酸菌同源重组载体,实现外源基因在乳酸菌中的整合型表达。【方法】根据乳酸菌L.lactis MG1363全基因组中ThyA基因序列设计引物,PCR扩增乳酸菌基因组中ThyA基因起始密码上游及终止密码下游约1000bp的基因序列,将获得的目的基因依次克隆至载体pMUTIN4中,以琼脂糖凝胶电泳检测目的条带,以双酶切技术、DNA测序予以确证。【结果】琼脂糖凝胶电泳结果显示,目的基因成功扩增,双酶切及DNA测序结果证实,成功构建了同源重组载体pThyA-up-down。【结论】乳酸菌同源重组载体pThyA-up-down为实现外源基因在乳酸菌中的非抗性、整合型表达奠定了基础。     

肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espF 基因缺失株和回补株的构建

目的利用Red同源重组系统敲除肠出血型大肠埃希菌的espF基因及其核苷酸片段;建立以pBAD 33质粒为载体的espF
基因回补实验平台。方法设计1 对同源臂引物扩增卡那霉素抗性打靶片段,将抗性打靶片段电转入含有PKD46 质粒的
EDL933w,在PKD 46介导的重组系统帮助下,打靶片段和菌体espF基因发生同源重组,PCR和测序验证;PCR扩增espF及其核
苷酸片段的整个ORF区序列,将其克隆入pBAD33质粒,分别将重组质粒转入相应的缺失株,以构建出相应的回补突变株。采
用RT-PCR的方法验证在相应的回补突变株中espF及其核苷酸片段是否转录。结果构建了espF基因及其核苷酸片段缺失的
EHEC O157:H7 EDL933w突变菌株和相应的回补株,且espF基因及其核苷酸片段在回补株中均发生转录。结论本研究运用
Red重组系统构建了肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espF基因缺失株,并建立以pBAD33质粒为载体的EHEC O157:H7基因回
补方法,为进一步研究肠出血型大肠埃希菌中espF基因的调控机制奠定了基础。
     

新生隐球菌CAP64荚膜缺陷株ura5突变株的筛选和鉴定

目的：筛选和鉴定新生隐球菌CAP64荚膜缺陷株ura5突变株。方法：(1)用体外基因重组技术将G418抗性基因插入到新生隐球菌1．2kb的ura5基因中;(2)用电转化方法将体外重组片段导入受体菌;(3)利用5-氟乳清酸(5-FOA)反筛选法筛选ura5突变株;(4)用遗传学鉴定营养缺陷株的方法鉴定突变体。结果：1株突变株ura5基因的序列与重组片段相同;其Southern杂交显示在20kb和7kb处出现2条杂交条带;该突变株能在SDU、SDU和YEPD／G418平板上生长,不能在SD平板生长;其生长曲线显示突变株生长速度依赖于尿嘧啶的提供量。结论：获得了1株新生隐球菌CAP64荚膜缺陷株ura5突变株,建立了新生隐球菌CAP64荚膜缺陷株转化系统,为CAP64基因的功能研究提供了工具。     

铜绿假单胞菌PA0745基因突变株的构建及鉴定

目的 构建铜绿假单胞菌PA14细胞株的PA0745基因突变株,并验证其致病性.方法 采用同源重组原理构建铜绿假单胞菌PA0745基因缺失株和点突变株.利用质粒抗性和营养缺陷进行筛选,获得铜绿假单胞菌突变株E126A、E146A和△PA0745.分析突变PA0745基因后,PA14细胞株生长特性及致病性变化.结果 成功构建PA14细胞株的PA0745基因突变株E126A、E146A和APA0745.生长曲线测定结果表明,PA0745基因突变后,不影响PA14细胞株正常生长.细胞侵染实验结果显示,相较于PA14细胞株,E126A、E146A和△PA0745对RAW264.7侵染能力分别下降了29.51％、60.66％和79.34％.结论 本研究成功构建了PA14细胞株的PA0745基因突变株,并初步验证了PA0745基因的功能,这对开发抗菌药物有指导意义.     

Chemerin重组腺病毒表达载体的构建

目的:应用基因重组技术,构建表达chemerin基因的重组腺病毒载体.方法:经PCR方法扩增得到chemerin基因,将其插入到带有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1中,得到重组质粒pShuttle-chemerin-IRE...