Ad.mda-7/IL-24的构建及在卵巢癌耐药癌细胞株中的感染表达

目的 利用Adeasy 1系统,构建并鉴定人mda-7/IL-24重组腺病毒(Ad.mda-7/IL-24).方法 从质粒pREP4-mda-7中扩增目的基因mda-7/IL-24,亚克隆至pAdTrack CMV穿梭质粒中,与pAdEasy 1质粒在E.coli BJ5183中进行同源重组为腺病毒载体质粒,线形化后转染293细胞进行包装扩增得到Ad.mda-7/IL-24.感染人卵巢癌泰素耐药株OVCAR-8/TR,Western-blot检测感染后MDA-7/IL-24蛋白表达.结果 重组腺病毒载体经测序、酶切电泳及感染后蛋白表达检测均表明成功构建Ad.mda-7/IL-24;病毒感染量为10 μL时,感染OVCAR-8/TR细胞可达100%感染率.细胞感染后可表达MDA-7/IL-24目的蛋白.结论 成功构建了人Ad.mda-7/IL-24,并能有效感染卵巢癌耐药细胞株,为进一步研究mda-7/IL-24基因在卵巢癌耐药中的作用奠定了基础.     

mda-7/IL-24通过内质网应激通路诱导肝癌细胞生长抑制和凋亡

目的:观察mda-7/IL-24对不同类型的肝肿瘤细胞及正常肝脏细胞增殖及凋亡的影响并探讨其可能的作用机制.方法:构建携带mda-7基因的重组腺病毒Ad-mda-7,转染肝癌细胞系HepG2、Hep3B、PLC/PRF/5和正常肝细胞L02,MTT法和流式细胞术检测细胞增殖及凋亡情况,Western印迹检测细胞相关蛋白的表达.应用钙蛋白酶抑制剂Ⅰ (ALLN,25 μmol/L)预处理上述细胞30 min,观察阻断内质网应激通路后上述指标的变化.结果:MTT法和流式细胞术检测结果表明,与感染Ad-GFP比较,Ad-mda-7选择性抑制肝癌细胞生长(P<0.01),诱导肝癌细胞凋亡(P<0.01,其中对HepG2细胞影响最明显),而对正常肝细胞生长无明显影响;ALLN预处理能部分抑制Ad-mda-7的上述作用.Western印迹结果表明Ad-mda-7 能诱导HepG2细胞BiP/GRP78、Bax蛋白高表达(P<0.01),caspase-12、caspase-3活化及p38 MAPK磷酸化;ALLN预处理能抑制Ad-mda-7转染引起的Bax蛋白高表达及caspase-12、caspase-3活化;而对BiP/GRP78的高表达及p38 MAPK磷酸化无影响.结论:mda-7/IL-24可能通过内质网应激通路诱导肝癌细胞生长抑制和凋亡.     

Ad.mda-7/IL-24对卵巢癌耐药细胞株生长及耐药的影响

目的 探讨抑癌基因mda-7/IL-24对卵巢癌耐药细胞株OVCAR-3、OVCAR-8/TR生长和耐药性的影响.方法 以前期研究成功构建的mda-7/IL-24基因重组腺病毒载体Ad.mda-7/IL-24感染OVCAR-3、OVCAR-8/TR两种卵巢癌耐药细胞株,Western blot检测MDA-7/IL-24蛋白的表达,MTT法检测细胞感染后的生长增殖情况,以及对顺氯氨铂(DDP)、阿霉素(ADM)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、泰素(Taxol)4种化疗药物敏感性的变化.结果 OVCAR-3、OVCAR-8/TR细胞在病毒感染量为10 μL时,均达到100%感染率;细胞感染后可成功表达MDA-7/IL-24蛋白; Ad.mda-7/IL-24感染OVCAR-3、OVCAR-8/TR后细胞生长抑制明显,第5d细胞生存率分别降至10.5%和35.8%;感染后两种细胞的泰素药敏分别约为未感染前的2.76和1.52倍,OVCAR-3细胞对ADM和5-FU药敏分别约为未感染前的1.6和3.01倍.结论 mda-7/IL-24基因对卵巢癌耐药细胞有生长抑制作用,同时可能逆转肿瘤细胞对泰素的耐药性.     

Hsa_circ_0000711在人肝癌细胞系中的功能研究

目的 研究环状RNA hsa_circ_0000711在人肝癌细胞系中的表达以及对肝癌细胞生物学功能的影响.方法 利用RT-qPCR检测环状RNA hsa_circ_0000711在肝癌细胞系的表达;通过小干扰RNA特异性敲低hsa_circ_0000711的表达;通过CCK-8实验检测肝癌细胞系的增殖情况;利用流式细胞技术检测细胞周期及细胞凋亡.Western blot检测下调hsa _circ _0000711后Cyclin D1、CDK4、 cleavaed Caspase 3及Bcl-2蛋白的表达水平.结果 Hsa_circ_0000711在肝癌细胞HepG2和SMMC- 7721中明显高表达(P＜0. 05) .与对照组相比,hsa_circ_0000711干扰组的肝癌细胞增殖能力显著降低(P＜0. 05),处于G1期细胞增多(P＜0. 05),且凋亡细胞显著增加(P＜0. 05) .干扰hsa_circ_0000711的表达后,肝癌细胞中Cyclin D1、CDK4和Bcl-2的蛋白表达量显著降低(P＜0. 05),cleavaed Caspase 3蛋白表达量显著升高(P＜0. 05) .结论 Hsa_circ_0000711可能通过调控细胞周期及凋亡影响肝癌细胞的增殖.     

重组腺病毒载体转染p16基因对肝癌细胞的生长抑制作用

目的：通过腺病毒转染p16基因观察对肝癌SMMC-7721细胞的杀伤作用。方法：克隆人p16基因全长cDNA序列，构建携带p16基因的增殖缺陷型重组腺病毒p16(AdV-p16)，以AdV-p16感染人肝癌SMMC-7721细胞，观察p16基因的表达及其对细胞的生长抑制或杀伤作用。结果：AdV．p16能介导外源基因p16在肝癌SMMC-7721细胞系中高效表达。在感染AdV-p16后随重复感染度(MOI)升高p16基因阳性表达率升高，四甲基偶氮唑蓝染色法(MTT)实验结果表明，SMMC-7721细胞的生长受抑制。结论：腺病毒能够介导p16基因在肝癌细胞中高效表达，促进细胞周期阻滞和诱导肿瘤细胞凋亡。     

腺病毒介导的THANK基因在SMMC-7721细胞中的表达

目的:构建THANK腺病毒载体,观察腺病毒感染后THANK在SMMC-7721细胞中的表达情况.方法:把THANK基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183,获得腺病毒重组质粒,再将获取的腺病毒重组质粒转染入293细胞进行包装,获取THANK重组腺病毒,以不同感染复数(MOI)腺病毒感染SMMC-7721细胞,观察腺病毒对SMMC-7721细胞的感染情况.结果:成功地构建了THANK腺病毒,该腺病毒可高效介导THANK在SMMC-7721细胞中表达,基因转染后第5天,THANK表达高于35 ng/ml,且随时间延长增加.结论:腺病毒可诱导THANK基因在SMMC-7721细胞中高表达.     

苦参碱对SMMC-7721细胞周期及凋亡的影响

目的:研究苦参碱对肝癌细胞周期和凋亡的影响。方法:体外培养SMMC-7221细胞,采用MTT法观察不同浓度苦参碱对SMMC-7721细胞抑制情况,应用免疫组化法观察激活型Caspase-3蛋白表达,采用流式细胞术PI单染观察细胞周期。结果:苦参碱抑制SMMC-7221细胞增殖,抑制率呈浓度依赖关系,IC50为1.1 g/L,0.8 g/L和1.2 g/L苦参碱作用48 h,SMMC-7221细胞激活型Caspase-3表达增强,引起G1期阻滞。结论:苦参碱能够抑制肝癌增殖,诱导其凋亡。     

细菌内同源重组法制备腺病毒介导TK基因对肝癌细胞的杀伤作用

目的 探讨用细菌内同源重组法制备含TK自杀基因腺病毒对肝癌细胞的杀伤作用.方法 将TK基因自载体中切出,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成质粒pAdTrack-GFP-TK,将其PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化BJ5183菌,抽提重组体腺病毒基因组质粒DNA,PacⅠ酶切后转染293细胞包装成腺病毒颗粒,观察其对肝癌细胞的感染效率和目的 基因表达情况及肝癌细胞SMMC-7721感染含TK自杀基因腺病毒后加入丙氧鸟苷(GCV)的生存率和旁观者效应的体外观察.结果 纯化所得腺病毒滴度约为2×1012 efu/mL,当病毒感染复数(MOI)=100时,腺病毒感染SMMC-7721细胞的效率＞90%,实验证实在感染重组体腺病毒的细胞中有相应基因产物的表达,SMMC-7721/Ad-TK细胞对GCV高度敏感,半杀伤浓度(IC50)仅为0.2 μmol/L,HSV-TK/GCV系统在SMMC-7721细胞中存在明显的旁杀伤效应.结论 细菌内同源重组法制备重组腺病毒介导的HSV-TK基因能够成功地在体外整合到肝癌细胞SMMC-7721中,并能高效表达,使其对GCV高度敏感.旁观者效应极大地提高了TK基因抗肿瘤活性,使TK基因制剂实际应用于临床治疗恶性肿瘤成为可能.     

人端粒酶逆转录酶启动子介导的E1A和IL-24表达及其对肝癌细胞生长的抑制作用

目的构建人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子介导的E1A和IL-24双基因靶向腺病毒载体,获得Ad-h-E1A-IL-24靶向重组病毒子,并探索其体外抑瘤作用。方法运用PCR扩增MCF-7乳腺癌细胞的DNA,XbaⅠ和HindⅢ酶切获得280 bp hTERT启动子,插入空载体构建成pTrack-hTERT;运用PCR及HindⅢ和XhoⅠ酶切获得E1A,与pTrack-hTERT构成pAdTrack-hTERT-E1A;运用PCR及NotⅠ和SalⅠ酶切获得IL-24,插入pTrack-PP-IRES;XbaⅠ和XhoⅠ酶切获得hTERT-E1A,与pTrack-PP-IL-24-IRES形成pTrack-hTERT-E1A-PP-IL-24-IRES,同源重组、包装和扩增获得Ad-h-E1A-IL-24重组靶向病毒子。用25 MOI重组靶向腺病毒感染SMMC-7721肝癌细胞,MTT法测定Ad-h-E1A-IL-24的细胞生长抑制作用。结果成功构建pTrack-hTERT-E1A-PP-IL-24-IRES,并获得Ad-h-E1A-IL-24重组病毒子。与非靶向双基因比较,Ad-h-E1A-IL-24组可明显抑制肿瘤细胞生长（P〈0.05或0.01）。结论Ad-h-E1A-IL-24靶向腺病毒载体的体外抑瘤作用优于非靶向双基因载体。     

MUC15在肝细胞癌中的表达及临床意义

目的探讨黏蛋白MUC15 在肝细胞癌中的表达及临床意义,并分析其和患者预后之间的关系。方法应用实时定量
RT-PCR法及Western blot法检测肝细胞系L02、肝癌细胞系HepG2、MHCC-97H、SMMC-7721,以及122例肝癌组织、对应癌旁
非肿瘤组织中MUC15的表达情况;并分析MUC15的表达与相关临床参数及患者预后的关系。结果肝细胞系L02中MUC15
表达水平显著高于肝癌细胞系HepG2、MHCC-97H、SMMC-7721（P<0.05）;MUC15在肝癌组织的表达水平显著低于癌旁非肿
瘤组织（P<0.05）,且MUC15 的表达与肿瘤的TNM分期、肝内或淋巴结转移、门静脉癌栓、病理分级等明显相关（P<0.05）;
Kaplan-Meier生存曲线表明MUC15的低表达是肝细胞癌患者预后差的指标。结论MUC15的表达与肝癌患者的临床病理特
征及预后密切相关,很有可能是肝癌患者预后的一个新的预测指标。
     

5-FU、HCPT诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的研究

目的观察两种传统抗癌药5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)、羟基喜树碱(10-hydroxycamptothecin,HCPT)对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响,从细胞凋亡的角度探讨其抗癌机制,为它们的临床应用提供实验依据。方法用不同浓度的5-FU(2.5、5、7.5、15、25 mg/L)和HCPT(0.25、0.5、1、1.5、2 mg/L)分别干预人肝癌SMMC-7721细胞生长,采用倒置相差显微镜、荧光显微镜、透射电镜和DNA凝胶电泳方法观察培养不同时间(12、24、48、72 h)人肝癌SMMC-7721细胞的凋亡,并比较两种药物诱导人肝癌细胞凋亡的效果。结果5-FU、HCPT均能诱导人肝癌SMMC-7721细胞产生凋亡,产生最高凋亡率的作用时间均为48 h,最佳浓度分别为7.5、1 mg/L,最高凋亡率分别为38.7%、42.6%,5-FU、HCPT两种药物诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的效果相当,而与对照组有显著性差异(P<0.01)。结论5-FU、HCPT均能诱导人肝癌SMMC-7721细胞产生凋亡,小剂量的5-FU、HCPT有望作为凋亡诱导剂用于临床肝癌治疗。     

Ad-hIL-24体外诱导喉癌细胞Hep-2的凋亡作用

目的研究腺病毒介导的人白细胞介素-24（hIL-24）基因选择性诱导喉癌细胞Hep-2凋亡的作用。方法将携带有hIL-24基因的重组复制缺陷型腺病毒（Ad-hIL-24）感染喉癌细胞Hep-2,并以人胚肺成纤维细胞WI-38为对照,采用RT-PCR法检测Hep-2、WI-38细胞中外源性hIL-24基因表达;采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）及流式细胞术等方法检测细胞的生长和凋亡情况。结果腺病毒介导的hIL-24基因能在Hep-2细胞和WI-38细胞中表达;MTT法显示Ad-hIL-24能明显抑制喉癌细胞Hep-2的生长,LSCM观察结果表明Ad-hIL-24能促进喉癌细胞Hep-2凋亡,流式细胞术显示Hep-2细胞经Ad-hIL-24感染48h后凋亡率为18.47%,G2/M期细胞百分比为38.9%,显著高于PBS组、Ad-GFP组和WI-38细胞,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。结论Ad-hIL-24能抑制喉癌细胞Hep-2生长和诱导Hep-2细胞凋亡,但对正常细胞无毒性作用。     

乙型肝炎病毒X蛋白诱导肝癌细胞上皮-间叶样表型转化的实验观察

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)能否诱导肝癌细胞发生上皮-间叶样表型转化.方法 构建含HBx基因的重组腺病毒载体并转染肝癌细胞SMMC-7721,观察转染后细胞的形态变化,并通过RT-PCR、蛋白质印迹、免疫细胞化学等方法检测其上皮标志物和间叶标志物的表达变化,通过transwell实验评价其侵袭转移能力.结果 SMMC-7721细胞被含HBx基因的重组腺病毒载体转染1周后,多角形上皮样细胞表型转化为梭形成纤维细胞样表型,其上皮标志物E-cadherin表达为(0.37±0.05)与(0.74±0.07),α-catenin mRNA表达为(0.63±0.06)与(0.78±0.07)表达较对照组显著下调(P<0.05).β-catenin表达无明显变化(0.73±0.07)与(0.78±0.07)(P>0.05);间叶标志物N-cadhefin表达(0.78±0.04)与(0.60±0.07),Vimentin表达为(0.64±0.06)与(0.32±0.05),Fibronectin表达为(0.49±0.05)与(0.24±0.03)等与比对照组比较显著上调(P<0.05),并且侵袭转移能力显著提高.结论 乙肝病毒X蛋白可以诱导肝癌细胞SMMC-7721发生上皮-间叶样表型转化,并增强其侵袭转移能力.     

5-烯丙基-7-二氟亚甲氧白杨素抑制肝癌细胞NF-κB表达的研究

目的：研究5-烯丙基-7-二氟亚甲氧白杨素（ADFMChR）抑制体外培养人肝癌SMMC-7721细胞增殖和诱导凋亡作用及机制。方法：体外培养SMMC-7721细胞,MTT比色法测定ADFMChR对SMMC-7721细胞增殖活性的影响;Western Blotting法分析ADFMChR对SMMC-7721细胞NF-kB蛋白表达活性的影响。结果：MTT比色法结果显示ADFMChR有效抑制SMMC-7721细胞增殖活性,呈剂量依赖性,其IC50值为3.56μM;Western Blot分析证实ADFMChR下调NF-κB蛋白表达,呈浓度和时间依赖性。结论：ADFMChR具有抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖和诱导细胞凋亡作用,其机制与NF-κB蛋白表达有关。     

奥曲肽抑制肝癌生长的实验研究

目的研究生长抑素类似物奥曲肽在体外、体内对肝癌生长及凋亡的影响.方法采用3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法、DNA末端原位标记染色(TUNEL)及流式细胞技术检测奥曲肽对体外培养的肝癌细胞生长影响及凋亡的诱导作用.利用SMMC-7721肝癌细胞株建立裸鼠肝癌原位种植瘤模型,实验组皮下注射奥曲肽100μg@kg-1@d-1;对照组予生理盐水20μg@d-1;共给药8周.结果培养细胞经不同浓度的奥曲肽作用48h后,对肝癌细胞的生长具有明显的抑制作用,且肝癌细胞3H-TdR掺入值与奥曲肽的浓度呈负相关(r=-0.97,P<0.01).TUNUL显示,1×10-6mol/L的奥曲肽作用24h后,肝癌细胞凋亡率为15.2%±2.4%;流式细胞检测可见明显的凋亡峰.奥曲肽治疗组裸鼠肝癌原位种植瘤重量明显低于对照组(0.27±0.05vs0.85±0.37,P<0.01).结论体内及体外实验表明,奥曲肽能有效抑制肝癌生长,其机制可能与抑制肝癌细胞DNA合成及诱导肝癌细胞凋亡有关.     

紫草素通过抑制PKM2/PHD3/HIF-1α通路诱导肝癌细胞凋亡

目的 探讨紫草素诱导人肝癌细胞SMMC-7721死亡的可能机制。方法 体外培养人肝癌细胞（SMMC-7721）和正常肝细胞（L-02）,实验分为对照组和紫草素给药组（4、8、16μmol/L）。采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐3-(4,5-二甲基噻唑-2-yl)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,MTT法检测细胞活力,试剂盒检测三磷酸腺苷（ATP）和乳酸水平,免疫共沉淀和免疫荧光双染实验明确M2型丙酮酸激酶（PKM2）、脯氨酰酸羟化酶3(PHD3)、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)三者之间的作用关系及蛋白表达情况;Annexin V/PI检测细胞凋亡;Western blot观察PKM2、PHD3、HIF-1α及凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2表达水平;采用小干扰核糖核酸（siRNA）干扰法建立PKM2低表达的人肝癌SMMC-7721细胞,Western blot检测PKM2低表达对人肝癌SMMC-7721细胞中的PHD3、HIF-1α蛋白表达水平的影响。结果 紫草素对SMMC-7721和L-02细胞的半抑制浓度（IC50）分别是8.0...     

pEGFP-N2-ECM1重组质粒的构建及其在人肝癌细胞系SMMC-7721中的表达

目的构建细胞外基质蛋白-1(ECM1)稳定表达的SMMC-7721肝癌细胞系。方法应用PCR和DNA重组技术构建pEGFP-N2-ECM1真核表达载体,经酶切、测序鉴定正确后,用脂质体转染SMMC-7721细胞,G418药物筛选稳定转染的细胞系。荧光显微镜检测融合蛋白表达,RT-PCR技术检测ECM1基因表达。结果构建的重组质粒经双酶切及测序分析鉴定,结果证实pEGFP-N2-ECM1构建成功;筛选获得稳定表达ECM1的SMMC-7721细胞。结论成功构建了pEGFP-N2-ECM1的真核表达载体,并在肝癌SMMC-7721细胞中稳定表达,为研究ECM1在肝癌进展中的作用奠定了实验基础。     

多西他赛对人肝癌放疗增敏及其作用机制探讨

目的 观察不同浓度多西他赛(Docetaxel)在体外对人肝癌细胞的放射增敏作用及其机制。方法 用0．125、0．25、0．5nmol／L多西他赛作用人SMMC-7721肝癌细胞株24h和0．125、0．25nmol／L多西他赛作用48h后分别给予0、2,4、6、8、10Gy剂量照射，单纯照射组未给予多西他赛处理而接受同等剂量照射，用集落形成实验分析放射增敏效应。另外用流式细胞术检测上述不同浓度多西他赛分别作用不同时间SMMC-7721细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)和用比色法测定谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量的变化。结果 用0．125、0．25、0．5nmol／L多西他赛作用24h和0．125、0．25nmol／L多西他赛作用48h均能观察到各自的放射增敏作用，其放射增敏比(SERDq)分别为1．12、1．19、1．43和1．37、1．48。同时观察到上述剂量多西他赛作用不同时间导致SMMC-7721细胞内ROS产生增多和GSH降低。结论 上述剂量多西他赛在体外对SMMC-7721肝癌细胞具有放射增敏作用，其增敏机制与用药后细胞内ROS产生增多和GSH降低有关。     

腺病毒介导的hIL-24基因对肺腺癌细胞生长的影响

目的研究重组腺病毒Ad-hIL-24对A549肺癌细胞的影响。方法将载有hIL-24基因的复制缺陷型腺病毒载体（Ad-hIL-24）感染A549肺癌细胞,RT-PCR法检测hIL-24基因的表达,光学显微镜及荧光显微镜下观察病毒感染前后细胞形态的变化,运用MTT法和流式细胞术（FCM）分别检测其对A549细胞的生长抑制及凋亡效应,通过免疫细胞化学分析caspase-3的变化。结果Ad-hIL-24感染A549细胞后有hIL-24目的基因的转录,可明显抑制A549细胞的生长,凋亡率明显增加,并能上调caspase-3的表达。结论腺病毒介导的hIL-24基因具有抑制A549肺癌细胞生长和诱导细胞凋亡的作用。     

CAAP1对人肝癌细胞SMMC-7721增殖、迁移和侵袭的影响

目的 探讨Caspase活性和凋亡抑制因子1(CAAP1)对人肝癌细胞SMMC-7721增殖、迁移和侵袭的影响.方法 构建CAAP1的过表达载体pcDNA3/CAAP1和敲降载体pSilencer 2.1-U6 neo/shR-CAAP1(shR-CAAP1),并进行鉴定.SMMC-7721分为4组:pcDNA3/CA...