液相色谱-串联质谱方法检测血清中极长链脂肪酸含量

目的 建立一种检测血清中极长链脂肪酸的LC-MS/MS方法.方法 收集2009年4-6月35份疑似ALD患者血清样本,采用LC-MS/MS方法检测血清中极长链脂肪酸含量.分析加样回收率、精密度及准确度,研究在常温放置和反复冻融条件下血清样本中极长链脂肪酸含量的稳定性.同时,用该方法测定101份健康人血清中极长链脂肪酸含量,统计测定值并进行分析.随机抽取35份血清,测定结果与德国柏林医学诊断检验中心(MDI)实验室测定数值进行比对.结果 血清样本中的极长链脂肪酸在梯度洗脱条件下分离良好,杂质干扰程度小.山萮酸(behenate,C22:0)的线性范围为2～64 mg/L,加样回收率为99.92%～102.05%,日内RSD≤6%,日间RSD≤9%;木焦油酸(tetracosanoicacid,C24:0)线性范围为2～64 mg/L,加样回收率为95.12%～100.44%,日内RSD≤6%,日间RSD≤7%;蜡酸(hexacosanoic acid,C26:0)线性范围为0～8 mg/L,加样回收率为92.21%～103.71%,日内RSD≤7%,日间RSD≤8%.山萮酸、木焦油酸和蜡酸的准确度均在85%～115%之间.样本在常温条件下放置12 h、反复冻融10次可以保持稳定.检测101份健康人血清中极长链脂肪酸含量服从正态分布,山萮酸含量为(19.43±4.43)mg/L,木焦油酸含量为(19.10±4.58)mg/L,蜡酸含量为(0.21±0.11)mg/L,计算木焦油酸/山萮酸和蜡酸/山箭酸比值分别为(0.99±0.13)和(0.01±0.01).统计结果显示,成年人血清中蜡酸(0.18±0.10)mg/L和木焦油酸/山萮酸比值(1.01±0.10)和未成年人血清中蜡酸(0.21±0.08)mg/L和木焦油酸/山萮酸比值(0.99±0.14)差异无统计学意义(t分别为1.439、0.806,P均＞0.05);男性健康人血清中木焦油酸/山萮酸比值(1.05±0.10)与女性健康人血清中木焦油酸/山萮酸比值(0.97±0.10)差异有统计学意义(t=3.394,P=0.001).与德国MDI实验室比对结果发现,本研究测定的山萮酸含量(16.93±4.30)mg/L和木焦油酸含量(19.57±6.40)mg/L与德国MDI实验室测定的山萮酸含量(13.85±3.17)mg/L和木焦油酸含量(16.10±5.84)mg/L差异有统计学意义(t分别为8.401和9.914,P均=0.000),而本研究测定的蜡酸含量(0.68±0.48)mg/L、木焦油酸/山萮酸比值(1.20±0.40)和蜡酸/山萮酸比值(0.04±0.04)与德国MDI实验室测定的蜡酸含量(0.65±0.67)mg/L、木焦油酸/山萮酸比值(1.19±0.43)和蜡酸/山萮酸比值(0.05±0.05)差异无统计学意义(t分别为0.372、0.317、0.945,P均＞0.05).结论 应用LC-MS/MS方法检测血清中极长链脂肪酸,具有较好的准确度和灵敏性,特异性强,稳定性好,能为临床诊断提供重要的生化依据.

Abstract：

Objective To establish a method for very long chain fatty acids( VLCFA )with liquid chromatography-tandem mass spectrometry( LC-MS/MS ). Methods One hundred and one healthy cases and 35 suspected ALD patients collected from April to June in 2009 were enrolled into this study. Quantitative analyzed the concentrations of VLCFA in serum was performed using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The precision, accuracy and recovery were analyzed, and the stability of VLCFA concentration of sample under room temperature and repeated freeze-thawing were also investigated. Serum levels of VLCFA in 101 normal cases were determined and analyzed statistically. The results for the 35 randomly chosen serum samples were compared with those from MDI in Germany. Results Serum VLCFA were separated well under these gradient condition with small interference. The linear range of C22:0 was from 2 mg/L to 64 mg/L, the recovery was 99. 92% -102. 05%, and the relative standard deviation ( RSD ) of intra-day and inter-day was less than 6% and 9% respectively. For C24:0 they were 2-64 mg/L. 95. 12%-100. 44%. ≤6%, ≤7%,respectively. For C26:0, they were 0-8 mg/L, 92.21%-103.71%, ≤7%, ≤8%, respectively. The accuracy of C22: 0,C24:0 and C26:0 were among 85% to 115%. The samples could be stable within 12 h at room temperature and repeated 10 times freeze-thawing. The values of VLCFA in 101 normal cases followed a normal distribution and the measured values were C22:0 =( 19. 43 ±4.43 ) mg/L,C24:0 =( 19. 10 ±4. 58 )mg/L, C26:0 = ( 0. 21 ± 0. 11 ) mg/L, the ratio of C24: 0/C22:0 and C26:0/C22: 0 were ( 0. 99 ± 0. 13 )and ( 0. 01 ±0. 01 ) respectively. The statistical analysis showed the concentration of C26:0 in adults ( 0. 18±0. 10 ) mg/L and children ( 0. 21 ± 0. 08 ) mg/L, C24: 0/C22:0 in adults ( 1.01 ± 0. 10 ) and children ( 0. 99 ±0. 14 ) has no significant( t values were 1. 439,0. 806, respectively, all P ＞ 0. 05 ); the ratio of C24:0/C22:0 in male (1.05 ± 0. 10 ) and female (0.97 ± 0. 10 ) has significant difference ( t =3. 394,P =0. 001 ). Compared the values determined by MDI laboratory, the results of C22: 0( 16. 93 ±4. 30 ) mg/L,C24: 0( 19. 57 ± 6. 40 ) mg/L by this method and C22:0 ( 13.85 ± 3. 17 ) mg/L, C24:0( 16. 10 ±5.84 ) mg/L by MDI have significant differences( t = 8. 401 ,P =0. 000;t =9. 914,P =0. 000 ),but C26:0( 0.68 ±0.48 ) mg/L, C24:0/C22:0( 1.20 ±0.40 ), C26: 0/C22:0 ( 0.04 ±0.04 )by this method and C26: 0( 0. 65 ± 0. 67 ) mg/L, C24:0/C22: 0( 1.19 ± 0. 43 ), C26:0/C22: 0 ( 0. 05 ± 0. 05 )by MDI have no differences( t values were 0. 372,0. 317,0. 945 ,respectively ,all P ＞0. 05 ). Conclusions The quantitative analysis method for serum very long chain fatty acid using LC-MS/MS is accurate, sensitive,specific and stable. It could provide important biochemistry information for diagnosis in clinic.     

高效液相色谱法测定人血清甜菜碱方法的建立

目的 采用柱前衍生高效液相色谱法-紫外检测法建立一种测定人血清甜菜碱浓度的方法.方法 以对溴苯乙酰溴和18-冠醚-6溶于乙腈制成衍生液,将其与甜菜碱反应形成的衍生物用Supelcosil LC-SCX色谱柱进行分离.流动相为乙腈∶水体积比90∶10,含16 mmol/L的氯化胆碱,等度洗脱,流速为0.8 ml/min,检测波长为259 nm,利用甜菜碱标准品绘制标准曲线,外标法定量检测20名健康大学生志愿者血清甜菜碱.结果 甜菜碱的测定线性范围为6.25～200.00 μmol/L,回归方程Y=1 568.1X-2 747.5,R2=0.999 8.最低检测限为3.0 μmol/L.批内不精密度为1.88%～3.79%(平均3.24%),批间不精密度为3.14%～6.76%(平均4.39%).方法 回收率为95.89%～102.86%(平均99.16%).结论 成功建立一种检测人血清甜菜碱浓度的方法,适用于实验室及临床常规检测.     

高效液相色谱测定血清高密度脂蛋白胆固醇分数和摩尔酯化速率

目的 建立一种高效液相色谱(HPLC)测定血清高密度脂蛋白胆固醇分数和摩尔酯化速率(FERHDL和MERHDDL)的方法.方法 用5,5'二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)抑制全血中的卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)活性,分离血清,制备HDL;HDL分别在含和不含2-巯基乙醇(ME)的条件下37℃温育1 h,HPLC法测定HDL游离胆固醇,计算FERHDL和MERHDL.结果 DTNB可以有效抑制全血中的LCAT活性,使游离胆固醇稳定在初始水平;ME可有效解除DTNB对LCAT的抑制作用;测定血清FERHDL和MERHDL的总变异系数分别为1.59%～3.74%和1.64%～2.88%;70名健康志愿者FERHDL.均值为18.7%/h(标准差7.2%/h),中位数16.1%/h;MERHDL均值42.7 μmol·L-1·h-1(标准差11.8 μmol·L-1·h-1),中位数41.6 μmol·L-1·h-1;FERHDL和MERHDL与多种心血管病危险因素显著相关.结论 本研究建立了血清FERHDL和MERHDL准确测定的方法,方法安全、简便、精密,将为进一步研究和应用FERHDL和MERHDL打下基础.     

超速离心-高效液相色谱测定血清高密度和低密度脂蛋白胆固醇

目的 建立一种新的预期用作参考方法的高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）准确测定方法。方法 血清与含2-琉基乙醇（ME）和脯氨酸的溴化钠溶液混合，使背景密度为1．063，超速离心分离高密度脂蛋白（HDL）；血清与含脯氨酸的溴化钠溶液混合，使背景密度为1.006，超速离心分离HDL和低密度脂蛋白（LDL）；用高效液相色谱测定两种脂蛋白组分胆固醇。结果 ME和脯氨酸可有效消除脂蛋白（a）对超速离心法分离HDL的影响；新方法测定HDLC和LDLC的总变异系数分别为0．96％～2、07％和0．65％～1．12％。结论 建立血清HDLC和LDLC准确测定方法，方法可靠、精密、简便，可望用作HDLC和LDLC测定参考方法。     

高效液相色谱评价血清胆固醇试剂中酶的性能

为了评价国内市场上血清胆固醇试剂中胆固醇酯酶（ＣＥＨ）和胆固醇氧化酶（ＣＯＤ）的性能，设计了测定反应液（血清加试剂）中未被水解的胆固醇酯（ＵＨＣＥ）和未被氧化的游离胆固醇（ＵＯＦＣ）的方法。该法用正己烷提取未经皂化的和皂化的反应液中的游离胆固醇，衍生为苯氨基甲酸酯，高效液相色谱测定其含量。未经皂化的反应液中的游离胆固醇是ＵＯＦＣ，皂化后的反应液中的游离胆固醇是ＵＯＦＣ与ＵＨＣＥ之和，从中减去ＵＯＦ     

超高效液相色谱－串联质谱联用检测血清胆汁酸谱方法的建立及初步临床应用

目的 建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)联用方法检测血清中胆汁酸表达的方法,并初步探讨胆汁酸亚型与肥胖的关系.方法 采用固相萃取方法处理血清标本,经UPLCHSS T3色谱柱梯度洗脱后,用负离子多反应监测模式对血清中的胆汁酸组分进行质谱检测,并根据中国国家食品药品监督管理局(SFDA)的指导原则对该方法的特异性、线性范围、灵敏度、不精密度和相对回收率进行性能验证.利用UPLC-MS/MS方法检测10例单纯性肥胖者和10名健康对照者血清胆汁酸浓度,并采用秩和检验进行统计分析.结果 UPLC-MS/MS方法可同时检测人血清中14种胆汁酸亚组分,在10～20 000 nmol/L范围内线性相关良好.其对不同亚组分的最低检出限(LOD)为0.02～7.90 nmol/L,最低定量限(LOQ)为0.07～44.20 nmol/L;其日内不精密度为0.35％～12.41％;日间不精密度为1.11％ ～13.04％;相对回收率为89.8％～114.6％.初步临床应用显示,单纯性肥胖者及健康对照者血清胆汁酸谱色谱图有一定差异,单纯性肥胖者血清中游离胆汁酸和结合胆汁酸浓度分别为0.49(0.45 ～1.90)、1.44(0.84～3.72) μmol/L,均低于健康对照组的0.98(0.53～3.06)、1.99(0.67 ～2.88) μmol/L,但差异均无统计学意义(Z=-0.958、-0.801,P均＞0.05).结论 建立的UPLC-MS/MS方法可有效分离并定量检测血清中各种胆汁酸亚型,其线性范围广、灵敏度高、精密度好,可用于临床标本游离胆汁酸和结合胆汁酸的分析测定.     

高效液相色谱评价血清胆固醇试剂中酶的性能

为了评价国内市场上血清胆固醇试剂中胆固醇酯酶（ＣＥＨ）和胆固醇氧化酶（ＣＯＤ）的性能，设计了测定反应液（血清加试剂）中未被水解的胆固醇酯（ＵＨＣＥ）和未被氧化的游离胆固醇（ＵＯＦＣ）的方法。该法用正己烷提取未经皂化的和皂化的反应液中的游离胆固醇，衍生为苯氨基甲酸酯，高效液相色谱测定其含量。未经皂化的反应液中的游离胆固醇是ＵＯＦＣ，皂化后的反应液中的游离胆固醇是ＵＯＦＣ与ＵＨＣＥ之和，从中减去ＵＯＦＣ即为ＵＨＣＥ。用此法检查了１２种国产和进口试剂盒，多数试剂的ＣＯＤ和ＣＥＨ性能良好，少数较差，表现为反应液中ＵＨＣＥ较高，其中有２种试剂为１％～２％，２种为２％～４％，１种高达５．４％，ＣＥＨ是影响试剂性能的主要因素。该法可以有效地鉴定胆固醇试剂中两种酶的性能是否能达到要求。     

用高效液相色谱法检测2型糖尿病患者血浆游离脂肪酸谱的分析研究

目的 用高效液相色谱法分析T2DM患者血浆游离脂肪酸谱的变化.方法 收集武汉大学中南医院体检人群和住院患者,其中健康对照组94名、单纯T2DM组101例、T2DM合并高脂血症组77例.取受试者空腹静脉血,分离新鲜血浆,以正十七酸作为内标,以改良Doles法萃取游离脂肪酸,溴苯乙酮作为柱前衍化剂,采用Dionex Summit高效液相色谱法分析系统检测血浆游离脂肪酸谱,内标标准曲线法定量.结果 健康对照组、单纯T2DM组与T2DM合并高脂血症组3组之间的总游离脂肪酸浓度分别为(355.63±100.35)、(421.21±200.83)、(473.04±213.40)μmol/L,3组之间差异有统计学意义(X2=13.08,P<0.01),不饱和游离脂肪酸浓度依次为(206.29±61.94)、(218.11±110.28)、(240.94±116.79)μmol/L,3组之间差异无统计学意义(x2=2.17,P>0.05).单纯T2DM组与健康对照组比较,总游离脂肪酸升高[(421.21±200.83)μmol/L vs(355.63±100.35)μmol/L,x2=7.22,P<0.05],不饱和游离脂肪酸浓度和健康对照组差异无统计学意义.T2DM合并高脂血症组与健康对照组比较,总游离脂肪酸浓度升高[(473.04±213.40)μmol/L vs (355.63±100.35)μmol/L,x2=27.93,P<0.01].日间及日内RSD均<5%,最低检测浓度为0.05～0.35 μmol/L,高、中、低浓度下的回收率为96.4%～104.8%.结论 T2DM患者血浆总游离脂肪酸浓度升高,以饱和游离脂肪酸升高为主,不饱和游离脂肪酸改变差异无统计学意义.可能与T2MD的发生发展有关,有望成为糖尿病脂代谢紊乱的临床早期监测新指标.     

高效液相色谱法测定米非司酮的血药浓度

目的：建立测定米非司酮血药浓度的方法。方法：以乙睛-甲醇-二氯甲烷三乙胺一水为流动相，血清样品经乙醚萃取，液氮冷冻分离后，在波长302nm处检测米非司酮。结果：线行范围0．02～2．21／μg／ml，米非司酮的工作曲线为y（μg）=0．07x-0．25（r^2=0．9996）。回收率在89％～93％之间。日内与日间RSD均小于4％。结论：高效液相色谱法快速、简便、准确、灵敏，可用于米非司酮的药物动力学研究。     

高效液相色谱-荧光检测法在慢性肾功能不全患者血清芳香族氨基酸检测中的临床价值

目的 建立同时测定血清AAA含量的HPLC-FLD法,探讨CRI患者血清AAA含量变化及其临床应用价值。方法血清标本来自于100名健康体检者和80例CRI患者。将CRI患者按2002年美国肾脏基金会(NKF)诊断分期标准进行分期：CKD 2期4例、CKD 3期12例、CKD 4期12例和CKD 5期52例;按CRI不同病因分组：慢性肾炎型32例、糖尿病型36例和高血压型12例。血清经高氯酸去蛋白后,离心取上清液测定,外标法定量。采用Megres C18色谱柱,流动相为乙腈：水（体积比为1∶9）,流速为1.0 ml/min,荧光检测器在不同时间段设定特定波长对血清AAA进行测定。对健康对照组和CRI患者组血清中AAA总量、Tyr、Phe和Trp含量及不同分期和不同病因CRI患者血清Tyr、Phe和Trp含量进行比较,同时评价血清AAA总量诊断CRI的敏感度与特异度。结果Tyr、Phe和Trp线性范围分别为0.550～275.000、3.050 ～1 220.000和0.049～49.000 μmol/L,最低检测限分别为0.014、0.500和0.005 μmol/L,平均回收率分别为100.9％、101.3％和98.5％,日内精密度为2.32％～3.92％（平均为3.13％）,日间精密度为3.18％ ～4.20％（平均为3.58％）。CRI患者组血清AAA总量、Tyr、Trp含量及Tyr/Phe比值分别为(135.74±12.23)、(52.27±8.25)、(21.49±4.25) μmoL/L和[0.87（0.68 ～1.05）],低于健康对照组的(174.47±11.57)、（63.53±4.68）、(44.22±3.67) μmol/L和[0.97（0.94～1.00）],差异均有统计学意义（t=- 14.709、4.452、22.100,U=266.000,P均＜0.05）。不同分期CRI患者Tyr、Phe和Trp含量差异无统计学意义;Tyr含量在慢性肾炎组、高血压组和糖尿病组间差异无统计学意义,Phe在慢性肾炎组与高血压组、慢性肾炎组与糖尿病组间差异有统计学意义（U= 114.00、395.00,P均＜0.05）,Trp在慢性肾炎组与糖尿病组间差异有统计学意义(U=349.00,P＜0.05)。血清AAA总量诊断CRI的敏感度、特异度分别为90％ (72/80)和100％ (100/100)。结论HPLC-FLD法测定血清AAA简便、快速,敏感度高及特异度好,同时测定血清AAA含量对CRI患者的诊断和评价有一定价值。     

高效液相色谱法同时测定血浆同型半胱氨酸及其相关硫醇物浓度方法的建立

目的建立一种柱前衍生反相高效液相色谱-荧光检测法同时测定血浆同型半胱氨酸（homocysteine，Hey）、半胱氨酸（cysteine，Cys）、半胱氨酰甘氨酸（cysteinylglycine，CysGly）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）的方法。方法 以tris-（2-carboxylethyl）-phosphine（TCEP）为还原剂，7-fluorbenzo-2-OX8-1，3-diazole-4-sulfonate（SBD-F）为衍生剂，N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcystine，NAC）为内标，C8柱分离。流动相为甲醇-磷酸盐缓冲液（25 mmo/L，pH 3．0），梯度洗脱，激发波长（kex）380nm，发射波长（hem）510 nm，内标标准曲线法定量。结果Hey、Cys、CysGly、GSH的线性范围分别为1．0—160．0μmol／L，30．0—1 040．0μmol／L，2．0—300．0μmol／L，1．0—130．0μmol／L，具有良好的相关性，r为0．999 4—0．999 9。最低检测限为0．1—2．0μmol/L。日内精密度不超过3．0％，日间精密度除GSH为13．21％外均小于6．0％。平均回收率为87．24％-114．99％。结论本方法准确、灵敏、快速、特异，适合于实验室研究和临床常规检测。     

一种新的高效液相色谱法选择性测定尿羟脯氨酸

目的　建立一种新的高效液相色谱法,选择性测定尿中羟脯氨酸的含量。方法　采用邻苯二甲醛和芴甲基氯甲酸酯两个衍生剂,先后处理尿标本,以国产 Ｃ８ 柱为固定相,在醋酸钠缓冲液中加入２３ ％ 的乙腈作为洗脱液,３ ,４脱氢脯氨酸作为内标。结果　测定结果的批内、批间变异系数分别为１ ．９２ ％ 和３ ．５８ ％ ,回收率为（９７ ．０ ±３ ．０） ％ ,在３１ ．２５ ～５００ ．００ μｍｏｌ／ Ｌ 范围内线性关系良好（ｒ 为０ ．９９７） 。结论　该法排除了尿液中具有一级胺结构的氨基酸在羟脯氨酸测定中的干扰,特异性好,无需梯度洗脱,适合临床检测需要。     

高效液相色谱检测全血贮存对血清总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇的影响

目的检查全血贮存对血清总胆固醇(TC)和高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)的影响,并探讨其可能机制。方法建立高效液相色谱(HPLC)方法,测定不同个体全血样品经不同温育后血清TC、总游离胆固醇(TFC)、HDLC和高密度脂蛋白游离胆固醇(HDLFC),计算有关参数或指标并做统计分析。结果建立的HPLC方法平均批内变异系数0.22%～0.51%;全血温育造成血清TC和HDLC变化(平均0.6%～2.1%和2.0%～4.1%),有些个体变化明显(TC>±3%,HDLC>±5%)。结论建立血清TC、TFC、HDLC和HDLFC的精密测定方法;血清TC和HDLC在不同条件下的全血贮存中,受血清体积变化、血细胞-脂蛋白间胆固醇交换或转移等许多复杂因素的影响而发生变化;血脂测定标本应尽量减少不必要的贮存。     

高效液相色谱-荧光法测定血清犬尿喹啉酸和色氨酸方法的建立

目的建立同时检测血清犬尿喹啉酸（kynurenic acid，KYNA）和色氨酸（tryptophan，Trp）的高效液相色谱-荧光法。方法采用高效液相色谱在线衍生技术，通过对最佳检测波长、流速、流动相中醋酸锌浓度和乙腈比例等因素的探讨，得出测定Trp和KYNA的最优实验方案，并对其进行方法学评价；测定50名正常人血清KYNA和Trp含量。结果KYNA保留时间约为8．1min，线性范围为1．05～2093nmoL／L，最低检出浓度为0．05nmoL／L，平均回收率为101．19％；Trp保留时间约为11．3min，线性范围为0．49～196μmoL／L，最低检出浓度为0．001μmoL／L，平均回收率为104．43％，二者日内、日间测定的变异系数均小于5％，苯丙氨酸、酪氨酸、5-羟色胺和犬尿氨酸等物质对该法均无干扰。健康成人血清KYNA和Trp含量分别为（24．25±9．11）nmol／L和（49．05±11．67）μmol／L。结论建立的方法简便、快速、稳定、可行，适用于临床和科研工作。     

高效液相色谱法同时测定血清色氨酸和犬尿氨酸浓度的方法建立及应用

目的建立一种高效液相色谱-紫外检测法同时测定血清中色氨酸(Trp)和犬尿氨酸(Kyn)浓度的方法。方法色谱柱采用Agilent Hypersil ODS(125.0mm×4.0mm,5μm),流动相为15mmol/L乙酸钠缓冲液(pH4.0)和乙腈95∶5(V/V),流速为0.8ml/min,柱温25℃,紫外检测λKyn=360nm,λTrp=278nm。结果Kyn和Trp的保留时间分别为3.3min和5.2min,线性范围分别为0.083~21.000μmol/L和2.650~678.000μmol/L,检测限分别为0.028μmol/L和0.053μmol/L,日内和日间相对标准偏差分别低于5%和10%,回收率分别为91.99%~113.89%和95.81%~118.82%。结论该方法简便、快速、特异,适合于临床检测。