人突变型TRAIL在大肠杆菌中的表达及诱导多种肿瘤细胞的凋亡

目的：研究突变型肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）的表达及体外诱导多种恶性肿瘤细胞的凋亡作用，为TRAIL临床治疗恶性肿瘤提供实验依据。方法：分段合成TRAIL寡核苷酸，并改变其中90个碱基，然后全长拼接，克服入原核表达载体pGEX-2T，转化E.coli DH 5a,丙基硫代－β-D－半乳糖苷诱导表达，亲和层析分离纯化融合蛋白，凝血酶酶切得到TRAIL蛋白。MTT法和流式细胞仪定量分析纯化产物对多种肿瘤细胞的诱导凋亡作用。结果：突变型TRAIL表达产物为可溶性，对人BGC823胃腺癌，A549肺腺癌，H69小细胞肺癌，KB鼻咽癌，A172人脑胶质细胞瘤，SKNSH人成神经细胞瘤株有明显的诱导凋亡作用，结论：原核表达突变型TRAIL具有明显的诱导多种恶性肿瘤细胞凋亡的作用。     

电离辐射联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对乳腺癌MCF-7细胞株作用的研究

目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）对人乳腺癌MCF．7细胞株的作用以及与放射治疗联合的可行性。方法1×10^4／ml MCF-7细胞接种至96孔板培养后加入不同浓度的TRAIL、给予不同剂量照射及TRAIL与电离辐射联合，Mrrr法检测细胞抑制率。MCF-7细胞接种至6孔板培养后，分别加入TRAIL（1μg／ml）、给予8Gy照射及TRAIL与8Gy照射联合，流式细胞术检测不同处理组细胞的凋亡率。应用RT-PCR法检测经不同处理后的细胞凋亡相关基因的表达情况。结果TRAIL（1μg／ml）与4、8和12Gy照射联合后对细胞的抑制率明显增加，与单独应用TRAIL及单独照射相比，差异有统计学意义。RT-PCR结果显示Bcl-2、Bcl-Xl基因在TRAIL与8Gy照射联合时表达减弱。结论在体外实验中，乳腺癌MCF-7细胞株对TRAIL不敏感，但TRAIL与电离辐射照射联合后抗肿瘤作用增强，TRAIL可能是一种有临床应用潜能的新型抗肿瘤生物制剂。     

肿瘤坏死因子在前列腺癌细胞凋亡中的作用

目的 :研究参与维甲酸诱导的前列腺癌细胞DU - 1 4 5凋亡过程的相关基因。方法 :应用浓度为 1 0 - 5mol·L- 1 全反式维甲酸作用前列腺癌细胞系DU - 1 4 5细胞 36h和 72h ,诱导DU - 1 4 5细胞凋亡 ,光镜及电子显微镜观察细胞形态及结构的改变 ,并采用基于PCR的改良消减杂交技术克隆与凋亡相关的基因。结果 :在DU - 1 4 5细胞凋亡过程中 ,有大量TNF基因及其家族成员的参与。结论 :TNF家族基因在由全反式维甲酸诱导的前列腺癌细胞系DU - 1 4 5细胞凋亡过程中 ,起着相当重要的作用     

达沙替尼提高胃癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体敏感性机制研究

目的探讨胃癌细胞中肝细胞生长因子受体(MET)活化的原因以及达沙替尼提高胃癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的敏感性。方法免疫印记法检测BGC823和MGC803胃癌细胞中MET、p-MET、Src、p-Src蛋白的表达,MTT法检测达沙替尼和TRAIL处理后胃癌细胞的增殖,免疫荧光法检测Src和MET之间的相互作用。结果 TRAIL作用BGC823和MGC803胃癌细胞后,诱导了Src和MET的磷酸化。Src激酶抑制剂达沙替尼预处理后,抑制了TRAIL诱导的Src和MET的磷酸化。TRAIL能明显提高BGC823胃癌细胞中Src和MET的结合,而达沙替尼联合TRAIL处理BGC823胃癌细胞,Src和MET的结合减少。与TRAIL和达沙替尼单纯用药比较,达沙替尼联合TRAIL对BGC823和MGC803胃癌细胞的增殖抑制作用增强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论达沙替尼通过阻止Src与MET的结合进而抑制了Src与MET的活化,提高了胃癌细胞对TRAIL的敏感性。     

人内皮抑素基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：获得具有抑制血管内皮细胞生长活性的重组人内皮抑制素蛋白。方法：从人胎肝中分离总RNA,经反转录聚合酶链反应（RT－PCR）得到endostatin全基因。用原核细胞表达载体构建pBV220/endostatin重组质粒,经DNA测序确认后,将其转化大肠杆菌DH5a进行表达,初步纯化及活性测定。结果：经SDS－PAGE电泳分析表达产物分子量约20Kda,薄层扫描显示表达产物可达细菌总蛋白的30％。结论：经生物学活性测定,表达蛋白能够抑制bFGF(碱性成纤维细胞生长因子）对牛毛细血管内皮细胞（BCEC）的增殖作用。     

肿瘤坏死因子在宫颈癌组织中表达的免疫组化研究

肿瘤坏死因子在宫颈癌组织中表达的免疫组化研究２６５２００莱阳解放军第１４５医院徐廷香，李西启，王剑波关键词肿瘤坏死因子；子宫颈肿瘤；免疫组织化学中国图书资料分类号Ｒ７１１．７４早期发现的ＴＮＦ是由活化巨噬细胞和淋巴细胞产生的多功能细胞因子，对某些肿瘤...     

不同启动子对肿瘤坏死因子α在大肠杆菌中表达水平的影响

不同启动子对肿瘤坏死因子α在大肠杆菌中表达水平的影响谢宝树，刘丽临床实验科主题词肿瘤坏死因子，基因表达肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）主要是由激活的巨噬细胞分泌产生的一种细胞因子，因它在体内外可以特异性地对多种肿瘤细胞产生杀伤作用而引起人们的重视。除具有抗肿瘤...     

细胞凋亡因子-Survivin 在肿瘤疾病中的研究进展

Survivin是凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protein。IAP）家族的重要成员之一。它是在1997年由耶鲁大学的Ambrosini等在人类基因组文库中用效应细胞蛋白酶受体1（effector cell protease receptor—1。EPR—1）的eDNA筛选克隆出来的一个新基因。由于其独特的组织学分布和强大的抗细胞凋亡能力。一经发现就引起科研人员的高度重视。本文就Survivin的结构、分子生物学特征、功能、组织分布及其在肿瘤研究中的进展作一综述。     

肿瘤坏死因子在内毒素诱导小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡中的作用

肺泡上皮细胞具有许多重要的功能 ,包括调节表面活性物质代谢、离子转运以及损伤后肺组织修复等[1 ] 。细菌内毒素 (ＬＰＳ)是革兰阴性菌引起的急性肺损伤的重要致病因素。研究表明 ,急性肺损伤可导致肺血管内皮细胞和上皮细胞凋亡[2 ] 。然而 ,ＬＰＳ对肺泡Ⅱ型上皮细胞 (ＡＥＣⅡ )的损伤效应和机制尚有待阐明。继往研究提示 ,肿瘤坏死因子(ＴＮＦ)在体外可诱导内皮细胞凋亡[3 5] 。但ＴＮＦ在ＬＰＳ诱导的ＡＥＣⅡ凋亡中的作用至今仍不清楚。笔者旨在明确内源性ＴＮＦ在ＬＰＳ诱导ＡＥＣⅡ凋亡中的作用。一、材料与方法1.试剂和实验动物 …     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的克隆、表达、纯化及生物学活性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的可溶性片段（soluble TNF-related apoptosis-inducing Ligand，sTRAIL），并鉴定其生物学活性。方法：以人胎盘cDNA为模板，根据GenBank中序列NM_003810设计引物，以PCR方法扩增sTRAIL基因，将其克隆人pET-32a，转化BL21（DE3），IPTG诱导后，收集菌体，超声破碎，离心取上清纯化，鉴定其生物学活性。结果：表达载体经DNA测序鉴定，氨基酸序列与预期一致。宿主菌高效表达目的蛋白，经SDS-PAGE、氨基酸测序鉴定均正确。可溶部分占表达总量的20％。经过两步纯化，sTRAIL纯度达到95％，表达量可达20mg／L培养基。纯化产物在体外能够明显诱导L929、NCI157、BEL7402、DU145等细胞凋亡，Hela细胞不敏感。对于L929，其半数致死量为0．10μg／ml。结论：本研究在原核表达系统中表达了sTRAIL，获得高纯度sTRAIL蛋白，为其进一步研究提供了良好基础。     

膀胱移行细胞癌中Survivin蛋白和Fas蛋白的表达和意义

目的：探讨Survivin蛋白和Fas蛋白在膀胱移行细胞癌中的表达和意义。方法：用免疫组化S-P法检测62例膀胱移行细胞癌组织及10例正常膀胱粘膜组织中Survivin蛋白和Fas蛋白的表达。结果：10例正常膀胱粘膜组织中Fas蛋白表达均为阳性，Survivin蛋白表达均为阴性；Fas在膀胱移行细胞癌中阳性表达率为46．77％（29／62），肿瘤不同分级中随恶性程度的增高，表达减少，Ⅰ级与Ⅲ级比较，差异有显著性意义（P〈O．05），不同临床分期中随分期的增高，表达减少，Tis～T1与T2～T4比较，差异无显著性意义（P〉O．05）；Survivin蛋白在膀胱移行细胞癌中阳性表达率为56．5％（35／62），肿瘤不同分级中随恶性程度的增高，表达增高（P〈O．05），不同临床分期中随分期的增高，表达增高，差异有显著性意义（p〈O．05）；Fas蛋白和Survivin蛋白表达负相关（P〈O．05）。结论：Survivin蛋白和Fas蛋白在膀胱移行细胞癌的发生、发展过程中起着重要的作用，其异常表达可作为膀胱移行细胞癌肿瘤标志物。     

非小细胞肺癌中survivin的表达及定位研究

目的 探讨survivin在非小细胞肺癌细胞中的表达和定位及其与p53、CD44表达和淋巴结转移的关系.方法 以免疫组化方法测定2002年1月～2004年5月手术获得的28例非小细胞肺癌标本的survivin、p53、CD44的表达情况,用SPSS软件分析survivin在细胞中的表达和定位情况及其与p53、CD44表达和淋巴结转移的关系.结果 28例非小细胞肺癌中survivin总阳性率为60.7%(17/28),其中单纯胞质阳性占25.0%(7/28),单纯胞核阳性占10.7%(3/28),胞质和胞核共同阳性者占25.0%(7/28),总的胞核表达阳性率为35.7%(10/28).survivin的积分值为2.00±2.92,与正常肺组织(积分值为0.10±0.32)差异显著(P＜0.005).survivin表达阳性组与阴性组中p53、CD44的表达以及淋巴结转移情况均无显著性差异(P＞0.05);但在survivin阳性组中,胞核survivin表达阳性者p53的阳性率明显高于胞核survivin表达阴性者(P＜0.005).结论 survivin在非小细胞肺癌中表达上调,且在非小细胞肺癌的发生发展过程中其胞核表达可能与p53具有一定的协同作用.     

宫颈癌中MTSS1基因的表达及其临床意义

目的：检测宫颈正常组织以及不同临床分期宫颈癌组织中转移抑制基因1（ metastasis suppressor 1, MTSS1）的表达,分析该基因在各组织中的变化与临床病理因素的关系,并初步探讨该基因在宫颈癌发生发展及转移过程中的作用及分子机制。方法取2011年12月至2014年12月期间采集的103例宫颈组织,病理切片诊断患者宫颈组织类型,判断分化程度,应用实时荧光定量PCR（ q-PCR）和Western印迹法检测不同宫颈组织中MTSS1基因及其蛋白的表达水平。结果 q-PCR结果提示,ⅡB-Ⅳ期宫颈癌组MTSS1基因表达量明显高于正常宫颈组及Ⅰ-ⅡA期宫颈癌组,3组间均有明显差异（P＝0．000）;Western印迹检测MTSS1蛋白在正常宫颈组织中的阳性表达率为23．3％,在宫颈癌组织中为53．3％,两组间差异明显（ P＝0．002）;MTSS1在宫颈癌组织中的表达与年龄、分化以及有无淋巴结转移均无明显相关性（P＞0．05）,而在临床分期中,ⅡB-Ⅳ期MTSS1蛋白表达率明显高于Ⅰ-ⅡA期的宫颈癌组织（P＝0．005）。结论 MTSS1的表达与宫颈癌的临床分期呈正相关趋势,该基因可能在宫颈癌的发生发展中起着重要的作用。     

hTERT启动子调控caspase 3基因的特异性表达及其抑癌作用

目的：探讨端粒酶催化亚基(KFERT)启动子调控caspase3(半胱天冬酶-3)基因在端粒酶阳性肿瘤细胞中表达的特异性及在体内外的抑癌作用。方法：构建hTERT启动子调控的caspase3基因的真核表达载体，通过RTPCR、瞬时转染、MTT法、流式细胞术和动物实验方法，检测hTERT启动子调控caspase3基因表达对肿瘤细胞生长的影响。结果：hTERT启动子调控caspase3基因在端粒酶阳性肿瘤细胞HepG2中有明显表达，而在正常人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblast，HEL)中未见表达；caspase3表达能对端粒酶阳性肿瘤细胞HepG2、HeLa、Glc和A549细胞的增殖产生明显抑制作用，抑制率为10．5％-37．9％；同时也可以诱导HepG2、HeLa、Glc和A549细胞发生凋亡，凋亡率为15．39％-35．19％；而对端粒酶阴性的正常细胞HEL没有明显的影响。动物实验结果显示，hTERT启动子调控的caspase3基因转染对HepC2细胞的体内增殖具有抑制作用。结论：hTERT启动子调控的caspase3基因表达载体是一种有应用潜力的肿瘤基因治疗载体。     

KDR启动子驱动双自杀基因诱导胃癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨KDR启动子驱动双自杀基因体系对胃癌细胞凋亡的诱导作用。方法以重组腺病毒AdEasy-KDR-CDglyTK体外感染表达KDR的SCG7901细胞株和不表达KDR的HepG2细胞株,并给予不同浓度的前药GCV和（或）5-FC,观察该体系对SCG7901细胞的杀伤效应。分别应用透射电镜、Hoechest33258／PI染色、流式细胞仪观察细胞超微结构、细胞凋亡率和细胞周期的变化。结果携带双自杀基因（CDglyTK）和报告基因（GFP）的重组腺病毒载体转染后,95％以上SCG7901和HepG2细胞中有GFP表达。表达KDR的SCG7901细胞对前药具有较高的敏感性,不表达KDR的HepG2细胞对前药不敏感（P〈0．01）。两种前药联合应用优于任一前药单独应用的疗效（P〈0．01）。流式细胞术检测表明该体系可抑制SCG7901细胞DNA的合成,表现为s期细胞比例增高及G2期细胞减少。同时,Hoechest33258／PI染色和电镜下可见SCG7901有凋亡改变。结论KDR启动子可以调控融合基因体系选择性地杀伤人胃癌SCG7901细胞,并且该体系可以诱导胃癌细胞凋亡。     

RCAS1蛋白在正常宫颈、宫颈上皮内瘤样病变和宫颈癌中的表达

目的 检测RCAS1在正常宫颈、宫颈上皮内瘤样病变及宫颈癌组织中的表达,探讨RCAS1在宫颈癌发生发展中的作用.方法 采用免疫组织化学S-P法,分别检测89例宫颈癌、82例子宫颈上皮内瘤样病变(CIN)及24例正常宫颈组织中RCAS1蛋白的表达.临床分期:Ⅰ期34例,Ⅱ期41例,Ⅲ～Ⅳ期14例;病理分级:G1 37例,G2 28例,G3 24例;病理类型:鳞癌58例,腺癌31例;有盆腔淋巴结转移者36例;肿瘤直径:≥4cm 31例,＜4cm 58例.另取同期因子宫肌瘤行子宫全切术的正常宫颈组织标本24例作为对照.结果 免疫组化结果显示:正常宫颈组织、CIN Ⅰ级、CINⅡ～Ⅲ级和宫颈癌组织中RCAS1蛋白的阳性表达率分别为0、31.4%、44.7%和77.5%.宫颈癌组与正常宫颈组和CIN各组间比较差异有显著性(P＜0.05);正常宫颈组与CIN组比较差异有显著性(P＜0.05).RCAS1阳性表达率在低分化宫颈癌组显著高于高、中分化癌组(P＜0.01);RCAS1阳性表达率在淋巴结转移组中为94.4%,而在无淋巴结转移组中为66.0%,两者相比差异有显著性(P＜0.01);肿瘤直径≥4cm的宫颈癌组织中RCAS1水平明显高于肿瘤直径＜4cm者(P＜0.05);但RCAS1阳性表达与患者年龄、临床分期及组织学分型无关(P＞0.05).结论 RCAS1表达与宫颈癌的发生、发展密切相关.随着宫颈病变恶性程度的进展RCAS1的表达逐渐增强,RCAS1的过度表达可作为宫颈癌恶性程度和不良预后的重要指标.     

存活素基因表达调控机制的研究

目的 :阐明凋亡抑制蛋白存活素 (survivin)的基因表达调控机制。方法 :采用PCR的方法从人HeLaS3细胞基因组DNA中扩增得到survivin基因上、下游侧翼序列 ,将它们分别克隆至报告基因表达载体中 ,依据报告基因的瞬时表达结果确定它们对survivin基因的表达调控作用 ,进而采用定向缺失的方法确定其核心启动子 ,并通过凝胶阻滞实验进行验证。结果与结论 :survivin基因起始密码子上游 2 6 8bp的序列是指导其在肿瘤细胞中周期性表达的最小核心启动子 (mini_promoter)。此外 ,体外培养的正常人外周血淋巴细胞经PHA_P与IL_2的刺激增殖的同时 ,survivin基因也得以表达 ,提示survivin基因的表达与细胞的增殖过程密切相关。     

TIG2基因在肺癌细胞中表达及启动子区甲基化的研究

 目的 探讨TIG2基因在原发性非小细胞肺癌中的表达及意义.方法 应用RT-PCR法检测TIG2基因在肺癌和正常肺细胞中表达变化,用CpG岛预测软件分析TIG2基因启动子和第一外显子区域CpG岛分布,用甲基化特异PCR法(MSP)检测TIG2基因甲基化.用RT-PCR法检测去甲基化试剂作用后TIG2基因的表达.结果 正常肺细胞和癌旁正常组织中TIG2mRNA呈高表达,而肺癌细胞系和组织中低表达或沉默.TIG2基因的启动子和(或)第一外显子区域存在典型的CpG岛.在肺癌细胞系均发生TIG2甲基化,肺癌组织中常发生甲基化,而肺癌旁组织中未见甲基化.去甲基化试剂作用后TIG2基因恢复表达.5-氮-2'-脱氧胞苷浓度越高,TIG2mRNA表达的强度越大.结论 甲基化是导致TIG2基因转录沉默的重要机制,TIG2可能是一种新的肺癌肿瘤抑制基因.     

基于生物信息学分析的人ID4基因启动子表达载体的构建及鉴定

目的:基于生物信息学分析构建人ID4基因启动子表达载体,以其作为研究ID4基因启动子表达调控分析的工作基础.方法:在分析人ID4基因启动子结构和调控元件的基础上,据UCSC基因组生物信息学中人ID4基因转录起始点(TSS)上游启动子区-643 bp及5'非翻译区(5'-UTR) 164 bp序列设计并合成引物,进行PCR扩增;以PCR产物作为模板经巢式PCR扩增了TSS上游启动子区-621 bp片段,将PCR产物回收、纯化后再连接到pGEM-T Easy载体上并转化至DH5α感受态大肠杆菌中构建成pGEM-T Easy-人ID4基因启动子重组质粒.转化产物经半巢式PCR及酶切鉴定,对得到的阳性克隆进行测序.结果与结论:成功构建出含有糖皮质激素受体、cAMP结合蛋白及雌激素受体反应调控元件序列的人ID4基因启动子表达载体.该表达载体的构建为进一步研究人ID4基因的启动子活性及表达调控奠定了基础.     

靶向肿瘤腺病毒介导IL-24抑制人胃癌细胞增殖

目的 探讨人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子特异驱动IL-24的重组腺病毒（Ad-phTERT-IL-24）对人胃癌SGC-7901细胞增殖及侵袭能力的影响.方法 将Ad-phTERT-IL-24感染人胃癌SGC-7901细胞,采用荧光实时定量PCR及Western blot检测IL-24表达;采用CCK-8方法检测细胞生长曲线;采用Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力.结果 与以PBS代替病毒液处理的SGC-7901细胞相比,感染Ad-phTERT-IL-24的SGC-7901细胞内IL-24 表达明显升高（P＜0.01）,于第5、6 d吸光度明显下降（P＜0.05）,细胞侵袭能力亦显著降低（P＜0.05）.结论 Ad-phTERT-IL-24可有效上调人胃癌SGC-7901细胞IL-24表达,进而抑制细胞增殖及侵袭能力.