晚期糖化终产物及其多克隆抗体的制备

目的制备晚期糖化终产物(advanced glycoslation endproducts,AGEs)及其多克隆抗体并鉴定其特异性用于糖尿病及其并发症的研究.方法牛血清白蛋白(BSA)与葡萄糖(100mg/L)孵育3个月和多点、多次免疫接种新西兰大耳白兔,所得抗血清用亲和层析纯化鉴定.结果AGEs-BSA荧光值为5.26±0.21,而BSA为0.16±0.01.荧光光谱扫描显示AGEs-BSA激发高峰位于365nm,发射高峰位于446nm.抗-BAGEs抗体亲和层析前抗体滴度为1:128,亲和层析后抗体滴度为1:2(P＜0.01).结论所制备的晚期糖化终产物及其抗体效价高,质量稳定.为进一步研究糖尿病及其并发症提供了必要的物质基础.     

兔抗人RBBP10多克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备兔抗人RBBP10多克隆抗体并进行鉴定.方法 用人工合成的RBBP10蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA及Western blot方法检测制备的抗血清效价和特异性.结果此次获得的抗血清ELISA方法检测抗体效价达到1:16000,检测RBBP10的灵敏度最低为10μg/μ1.Western blot检测表明抗体效价高,特异性强.结论 应用该方法成功制备了人RBBP10多克隆抗体,此抗体可通过免疫组化方法检测RBBP10蛋白在各种肿瘤中的表达,具有一定的应用价值.     

特异性RBBP10多克隆抗体的制备

目的：制备RBBP10多克隆抗体。方法：用纯化的RBBP10蛋白为抗原免疫家兔制备多克隆抗体，间接ELISA法检测抗体效价，Western印迹检测抗体特异性。结果：抗血清效价可达1：1000以上。结论：经Western印迹检测证明抗体效价高，特异性强．此抗体可通过免疫组化方法检测RBBP10蛋白在各种肿瘤中的表达。具有一定的应用价值。     

Tau40蛋白的纯化及其多克隆抗体的制备

目的快速纯化tau蛋白，制备tau蛋白的多克隆抗体。方法依次使用差速离心、热失活、离子交换层析的方法纯化体外重组的人tau蛋白；用此纯化的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体，用Western blot检测组织来源的样品，确定所制备抗体的特异性和效价。结果采用上述方法成功获得人类全长tau蛋白——tau 40；同时，所制备的tau蛋白多克隆抗体效价高，特异性好。结论本方法所获得的tau抗体效价高，特异性好，可以用于进一步的科学研究。     

兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶多克隆抗体的制备和应用

目的：采用已构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒纯化重组蛋白,制备兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP-oc）多克隆抗体并鉴定其性能。方法：将构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒转化至BL21（DE3）中,应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达。表达产物经过Q柱阴阳离子交换和Ni柱亲和层析获得纯化的PTP-oc重组蛋白,将纯化的重组蛋白作为抗原免疫家兔,获得PTP-oc多克隆抗体。采用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting法检测抗体的特异性。结果：成功纯化出PTP-oc重组蛋白。间接ELISA法检测,采用纯化诱导后的重组蛋白免疫家兔获得了兔抗PTP-oc多克隆抗体,多克隆抗体效价达1∶32000以上,Western blotting法检测,所得多克隆抗体有较高的特异性。结论：成功纯化了PTP-oc重组蛋白,制备出PTP-oc多克隆抗体。     

鲍曼不动杆菌外膜蛋白CarO的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

目的 表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的鲍曼不动杆菌杆菌外膜蛋白Caro(-binding protein)融合蛋白并制备抗Caro多克隆抗体,为研究临床鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制奠定基础.方法 构建pET23d-CarO重组表达质粒,转入大肠埃希菌BL21(DE3),以IPTG诱导6×His-CarO融合蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化出的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western印迹检测多克隆抗体的特异性.结果 在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的His-CarO融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫新西兰大白兔,获得了高特异性的抗CarO抗血清.结论 成功构建pET23d-CarO原核表达质粒,表达并纯化出目标蛋白,制备出高特异性的多克隆抗体.     

蛋白激酶SGK2α在大肠杆菌中的表达纯化及抗体制备

目的 该研究通过SGKα基因的克隆、原核蛋白表达以及纯化,制备抗SGK2α抗体,为进一步研究SGK2α蛋白的生物学功能奠定基础.方法 利用原核表达载体PGEX-4T-3构建重组质粒,并在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白:以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗SGK2α多克隆抗体,ELISA方法检测抗体效价,免疫印迹法检测抗体的特异性.结果 构建了PGEX-4T-3-SGK2α原核表达质粒,经原核表达和亲和层析获得GST-SGK2α融合蛋白,蛋白纯度在90%以上;利用GST-SGK2α融合蛋白制备多克隆抗体,抗体效价阳性且具有较强的特异性.结论 利用原核表达的GST-SGK2α融合蛋白成功地制备了抗SGK2α多克隆抗体,可用于免疫组织化学和免疫印迹检测以及功能研究.     

重组登革病毒2型NS1蛋白的分泌表达及其抗体制备

目的 分泌表达重组登革病毒2型NS1蛋白,并制备兔抗NS1多克隆抗体.方法 应用毕赤酵母表达系统表达全长登革病毒2型NS1蛋白,制备抗原,免疫家兔;采集免疫血清,制备兔抗NS1蛋白多克隆抗体;应用Western-blot、ELISA法鉴定和检测抗体效价;经辛酸-硫酸铵法、亲和层析法纯化抗体,SDS-PAGE电泳检测抗体的纯度;用Western-blot、ELISA法检测纯化后IsG性质及效价.结果 重组NS1蛋白获得分泌表达,其免疫血清经Western-blot、ELISA法证实获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,抗体效价为1:6000.结论 重组登革病毒2型NS1蛋白在毕赤酵母真核表达系统中高效表达,纯化产物有较强的免疫原性,成功获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体在登革病毒致病与免疫机制中的作用奠定了基础.     

兔抗人TGF-β_1多克隆抗体的制备

目的以人重组TGF-β1蛋白作为抗原,制备兔抗人TGF-β1多克隆抗体。方法重组蛋白与弗氏佐剂等体积混匀,免疫新西兰白兔,获得兔抗人TGF-β1多克隆抗血清。饱和硫酸铵盐析法纯化多克隆抗体,间接酶联免疫吸附试验检测多克隆抗体效价,Western-blot技术进行抗体特异性检测。结果成功获得兔抗人TGF-β1多克隆抗体,纯化后抗体效价达1∶110 000。结论获得的兔抗人TGF-β1多克隆抗体具有良好的特异性,能满足进一步实验的需要。     

ELF3多克隆抗体的制备及其免疫定位

目的 制备并鉴定兔抗小鼠胚肝血影蛋白3(embryonic liver fodrin 3,ELF3)的多克隆抗体,并探讨其在部分小鼠组织中的免疫定位.方法 合成ELF3氨基端特异性多肽片段,连接载体蛋白钥孔戚血蓝素(keyhole limpet hemocyanin,KLH),免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,用ELISA方法 检测抗体效价,Western blot和免疫组织化学方法 检测抗体特异性及在小鼠组织中的表达情况.结果合成ELF3特异性多肽,并连接KLH后免疫实验兔,制备得到兔抗小鼠ELF3多克隆抗体,ELISA及Western blot检测结果显示此抗体效价及特异性高;Western blot和免疫组织化学检测结果显示ELF3在心、肝、肾组织中表达,尤其是细胞膜上表达明显.结论 本实验成功制备ELF3多克隆抗体,并证实ELF3在小鼠心、肝、肾组织细胞膜表达明显,这将为ELF3功能研究提供有力的工具.     

大鼠神经球蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的 克隆Wistar大鼠神经球蛋白(NGB)基因,通过原核表达制备其多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础.方法 从雄性Wistar大鼠脑组织中提取总RNA,经逆转录PCR得到cDNA,测序证明该基因序列正确后,亚克隆人pET-28a( )载体中,通过双酶切和测序确定序列和阅读框正确.转化大肠杆菌BL21菌株,获得可溶性表达产物,经鉴定、纯化后免疫新西兰兔,分离血清,ELISA法测定抗体效价.结果 神经球蛋白多克隆抗体效价达1:100 000,此多抗可以与293细胞内表达的重组蛋白发生很好的抗原抗体反应.结论 成功制备了兔抗NGB的多抗,为后续研究提供了重要的实验材料.     

类鼻疽杆菌Ⅲ型分泌系统BPSS1395蛋白表达及其抗体制备与鉴定

目的 重组表达类鼻疽杆菌Ⅲ型分泌系统蛋白BPSS1395,利用其抗体检测该蛋白在细菌中的分布.方法 以pET-22b为表达系统,采用DNA重组技术在大肠杆菌中表达BPSS1395蛋白;用纯化重组蛋白免疫新西兰大白兔,Western blot及ELISA法鉴定其免疫学性质;以制备的抗血清Western blot分析该蛋白的亚细胞定位.结果 从类鼻疽杆菌BPC006株基因组DNA中PCR得到了BPSS1395目的基因,并成功构建pET-22b-BPSS1395重组质粒,转化到E.coli宿主菌BL21(DE3)经IPTG诱导表达、纯化得到了相对分子质量为32×103的高纯度BPSS1395蛋白,制备的兔抗血清ELISA效价均高达1:1280000,并能与目的蛋白发生特异性抗原抗体反应.亚细胞分离后BPSS1395在类鼻疽杆菌中主要定位于细胞质.结论 重组表达了具有生物活性的BPSS1395蛋白,制备了其特异性多克隆抗体,证明了该蛋白定位于细胞质.     

粉尘螨变应原Derf1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:原核表达、纯化粉尘螨主要变应原Der f1重组蛋白,并制备其多克隆抗体。方法:大量诱导表达含pET-28a(+)-Der f1质粒的BL21菌株,SDS-PAGE电泳并割胶纯化目的蛋白,以此为抗原免疫新西兰大白兔,收集血清进行效价检测并用Western blot检测其特异性。结果:割胶回收可有效纯化Der f1重组蛋白,抗Der f1抗体效价为1∶32 000。结论:成功制备Der f1多克隆抗体,以期为尘螨过敏性疾病的诊断和免疫治疗提供参考。     

基于表位多肽的抗TRIM22抗体的制备及其初步应用

 目的 制备抗TRIM22多肽抗体及鉴定其性能。 方法 将TRIM22 N端15个氨基酸的多肽（MDFSVKVDIEKEVTC）与钥孔嘁血蓝蛋白（KLH）偶联，免疫新西兰白兔制备抗血清；将TRIM22多肽与Affi-Gel 10偶联制备免疫亲和层析柱, 兔抗血清经亲和层析纯化后得到TRIM22多肽特异性抗体；采用ELISA测定抗体效价、Western blot来鉴定抗体特异性，并利用该抗体通过间接免疫荧光实验来检测TRIM22蛋白的细胞内定位。 结果 获得了抗TRIM22特异性抗体。Western blot结果显示该抗体能特异识别真核及原核表达的TRIM22蛋白。利用该抗体进行的间接免疫荧光实验发现TRIM22蛋白主要定位在HepG2细胞核中。 结论 该抗体的制备为TRIM22分子的功能研究提供了有力的工具。     

柯萨奇病毒B3的多克隆抗体制备

目的制备柯萨奇病毒B3(coxsackievirus B3,CVB3)的多克隆抗体。方法针对CVB3基因的VP1区设计特异性引物,RT-PCR扩增VP1基因并将其克隆到pGEX-6p-1中,经IPTG诱导表达后,以GST-VP1融合蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。采用ELISA、Western blot以及间接免疫荧光检测多克隆抗体的效价和特异性。结果 ELISA检测血清的效价不低于1∶64 000,Western blot和间接免疫荧光显示该抗体具有良好的特异性。结论成功制备了效价较高的CVB3多克隆抗体,可应用于CVB3蛋白的检测。     

人巨细胞病毒US31蛋白特异性抗体的制备及鉴定

目的：探讨人巨细胞病毒（HCMV）US31蛋白及其多克隆抗体的制备及鉴定方法。方法：HCMV US31基因经原核密码子优化后进行全基因合成,克隆至pET21a（+）原核表达载体,构建pET21a（+）/HCMV US31重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导目的蛋白表达,Ni-NTA亲和层析法纯化US31蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA、Western blot及免疫荧光方法检测抗体效价和特异性。结果：在大肠杆菌中诱导出高表达的HCMV US31融合蛋白,经Ni-NTA亲和纯化后获得高纯度的目的蛋白;免疫新西兰兔诱导产生特异性的IgG抗体,效价为1:49 600;经ELISA、Western blot以及免疫荧光均证实制备的特异性抗体可识别细胞中表达的US31蛋白。结论：成功制备了HCMV US31蛋白及特异性抗体,为进一步研究US31蛋白的生物学功能奠定了基础。     

癌症转移相关基因Syntenin1多克隆抗体的制备与鉴定

目的 获得原核表达GST-Syntenin1融合蛋白,制备高效价的抗Syntenin1多克隆抗体.方法 RT-PCR扩增Syntenin1 cDNA开放阅读框(CDS)序列,亚克隆到编码GST的pGEX-4T-2原核表达载体上,将编码Syntenin1的pGEX-4T-2-Syntenin1重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Syntenin1融合蛋白表达,对融合蛋白亲和纯化.SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体效价及特异性.结果 成功制备GST-Syntenin1融合蛋白及多克隆抗体.Western blot结果表明Syntenin1兔多克隆抗体效价可达到1∶20 000,且与Syntenin1蛋白特异结合.结论 成功制备Syntenin1多克隆抗体,为进一步研究Syntenin1基因的功能奠定了基础.     

糖基化终产物—牛血清白蛋白的制备和纯化

目的　制备高纯度的糖基化终产物(AGEs) 用作免疫原或检测标准品。方法　牛血清白蛋白(BSA) 与葡萄糖在体外共同孵育制备AGEs - BSA,经凝胶层析纯化后,应用荧光光谱和SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。结果　纯化后AGEs - BSA 与标准的AGEs - BSA 电泳图谱基本一致;激发和发射光谱均为单峰,分别位于360 nm 和446 nm 。结论　应用凝胶层析纯化AGEs - BSA 效果满意     

E血清型沙眼衣原体抗体的制备及检测

目的:制备高效价E血清型沙眼衣原体(CT)的多克隆抗体.方法:用hep-2细胞培养制备并用超速离心方法纯化E血清型CT作为抗原,采用弗氏佐剂乳化抗原,背部皮下多点免疫4只家兔,收获免疫后血清制备多克隆抗体,用Western blot方法进行鉴定,ELISA法检测抗体水平.结果:所有家兔在全程免疫后都产生了高效价的血清抗体,最高滴度达1∶1600.Western blot实验结果显示,本研究制备的CT血清抗体能与CT全菌体抗原发生b异结合.结论:CT菌体抗原免疫家兔可成功制备高效价的血清抗体,为建立沙眼衣原体免疫检测方法打下了基础.