巨细胞病毒诱导体外人血管内皮细胞凋亡的实验研究

目的探讨HCMV感染对体外培养人血管内皮细胞凋亡的影响。方法建立HCMV-AD169株感染体外培养人脐静脉血管内皮细胞模型,应用AV/PI双染法检测HCMV感染后ECs的凋亡变化。结果体外情况下HCMV感染后不同时相点(12、24、48、72h),ECs的凋亡率分别为(10.6±4.6)%,(23.8±6.9)%,(39.4±8.9)%,(31.4±7.8)%,明显高于对照组细胞。结论HCMV感染诱导ECs凋亡的异常改变可能参与了动脉粥样硬化的发生发展。     

大鼠移植肝再灌注损伤过程中肝细胞凋亡及其调控基因表达变化

目的 研究移植肝缺血冷保存再灌流损伤过程中肝细胞凋亡变化情况及凋亡调控基因Bcl-2,FasL的表达变化.方法 将72只SD大鼠分为假手术组及移植组,移植组建立原位肝移植模型,以4℃乳酸林格氏液为基液对供肝灌注并冷保存4 h后置人受体,于移植后1,6,24h处死大鼠取样,检测血清中AST、ALT水平,采用TUNEL法检测移植肝肝细胞凋亡情况,流式细胞仪检测凋亡相关基因Bcl-2,FasL蛋白的表达.结果 再灌注后移植组AST、ALT显著高于假手术组.与假手术组相比,移植组各时点肝细胞凋亡指数明显升高,肝组织中Bcl-2表达减少,FasL表达量增加(P<0.01),以再灌注后6h变化最为显著.结论 移植术后移植肝缺血-再灌注损伤过程中肝细胞凋亡加重,于冉灌注早期达到高峰,这可能与抗凋亡基因Bcl-2的表达减少,促凋亡基因FasL表达增加有关.     

人巨细胞病毒UL145基因在先天感染患儿临床株中的多态性研究

目的：研究人巨细胞病毒（HCMV）UL145序列在先天感染患儿临床株中的基因多态性，探讨HCMV基因多态性与先天感染引起的不同临床症状之间的关系。方法：对16株临床低传代分离株和15株未传代临床株的HCMV临床标本分别进行UL145全序列PCR扩增，对PCR扩增阳性的31例标本进行序列测定及分析，并且与9株已在GenBank递交的HCMVUL145序列进行比较分析。结果：序列分析结果表明31株HCMV临床株的UL145基因是高度保守的。所有临床株的HCMVUL145开放阅读框架均为393bp，编码蛋白含有130个氨基酸。所有临床株的核苷酸同源率为95．9％～100％，编码蛋白的同源率为97．7％～100％。临床症状不同的患儿其HCMVUL145基因及其编码蛋白具有相似的结构。所有先天感染患儿临床株的UL145编码蛋白具有蛋白激酶C（PKC）磷酸化功能位点和酪蛋白激酶（CK2）磷酸化功能位点。结论：HCMVUL145基因在临床株中是高度保守，未发现其与HCMV先天感染不同临床症状间存在明显的关系。HCMV UL145基因的高度保守性在先天感染中具有重要作用。     

大蒜新素对人巨细胞病毒感染的人胚肺成纤维细胞凋亡的影响

目的 研究大蒜新素对人巨细胞病毒(HCMV)诱导感染的人胚肺成纤维细胞(HELF)凋亡的动态变化及凋亡调控基因bcl-2和fas mRNA表达的影响。方法 用流式细胞术测定HELF在高、低感染复数(MOI分别为2．5、0．25)HCMV感染后1、12、24、36、48、72、96h凋亡细胞比率；大、中、小剂量大蒜新素(9、6和3μg／mL)处理正常的和感染的HELF细胞(MOI为2．5)后上述各时间点凋亡细胞比率。用原位杂交法检测大剂量大蒜新素处理感染细胞(MIO为0．25)72h后bcl-2和fas mRNA表达强度变化，并与正常细胞和感染细胞对比分析。结果 正常细胞凋亡比率保持恒定低水平(凋亡率平均2．68％)；低、高感染复数感染细胞随时间延长凋亡细胞逐渐增多，凋亡率峰值分别达8．85％(96h)和25．63％(72h)；各剂量大蒜新素处理的正常细胞凋亡率增加，呈剂量依赖性，峰值分别为4．88％、6．47％和8．35％；但各剂量药物处理感染细胞后却使细胞凋亡比率下降，大剂量药物处理72h时效应最为明显，凋亡细胞比率由25．63％降至16．24％。正常细胞高表达bcl-2，低表达fas基因；感染HCMV后，bcl-2表达显著下调，fas表达明显增强；大蒜新素处理感染细胞后使bcl-2表达强度明显高于感染细胞，fas表达水平明显低于感染细胞，但仍未恢复到正常细胞水平。结论HCMV是HELF凋亡的强诱导剂；病毒可通过下调凋亡抑制基因bcl-2和上调凋亡促进基因fas而发挥致凋亡作用。大蒜新素本身可诱导HELF凋亡，但却能明显抑制HCMV诱导的细胞凋亡，其抑制作用可能与药物干扰HCMV影响凋亡调控基因bcl-2和fas表达有关。     

体外人巨细胞病毒感染对人涎腺导管上皮细胞角蛋白表达的影响

目的探讨体外人巨细胞病毒（HCMV）感染对人涎腺导管上皮细胞（HSG）角蛋白表达的影响。方法应用免疫细胞化学法检测体外培养的HSG中角蛋白8和18（K8和K18）的表达;蛋白印迹法检测HCMV感染对体外培养的HSG中K8和K18表达的影响;半定量逆转录聚合酶链式反应法检测HCMV对体外培养的HSG中K8和K18转录水平的影响。结果体外培养的HSG中K8和K18呈阳性表达;HCMV感染体外培养的HSG0-96h,K8的表达呈逐渐下降趋势,K18的表达在感染后24h内表达升高,此后下降;K8和K18的mRNA水平和蛋白水平均呈反向平行关系。结论HCMV感染体外培养的HSG可引起角蛋白表型发生改变,K8和K18表达水平改变的调节发生在转录后水平。     

人类巨细胞病毒对人胚肺细胞HOX基因表达的影响

应用半定量RT PCR技术研究人胚肺 (HEL)细胞HOX基因的表达状态及人类巨细胞病毒 (HCMV)感染对HEL细胞HOX基因表达的影响。结果发现 :HEL细胞表达HOXB7基因 ;HCMV感染后 ,其表达上调 ;用全反式维甲酸 (ATRA)处理HEL细胞 ,HCMV对HOXB7基因表达的上调作用更强。提示HCMV可能通过影响HOXB7基因的表达导致胚胎发育畸形。 更多还原     

人巨细胞病毒诱导ECV304血管内皮样细胞凋亡

目的 探讨人巨细胞病毒（HCMV）感染ECV304血管内皮样细胞的致病机制。方法 常规方法传代细胞和接种病毒。以PCR法和间接免疫荧光法检测病毒即刻早期基因（IE gene）及其蛋白表达;相差显微镜及电子显微镜观察病毒感染后细胞和细胞器形态变化;DNA梯度法和流式细胞术检测细胞凋亡。结果 病毒感染后72h开始出现胞体变圆、缩小、脱壁,胞质内颗粒增多,细胞边缘模糊不清的特征,可明显检测出病毒特异IEgene及其蛋白表达;电镜结果显示病毒感染96h后,胞质内明显空泡化,细胞膜微绒毛减少,核染色质浓集、边缘化,线粒体出现溶酶体化、空泡化和自噬现象,呈早期凋亡特征;DNA梯度电泳结果显示感染细胞DNA片段化特征的条带：流式细胞仪检测发现感染4d和6d时,细胞调亡率分别为4．1％和45．7％。结论 巨细胞病毒在体外细胞培养中可诱导ECV304血管内皮样细胞的凋亡。     

人巨细胞病毒感染与系统性红斑狼疮的相关性

目的：分析人巨细胞病毒（HCMV）在系统性红斑狼疮（SLE）患者中的感染状况及与SLE临床指标的相关性。方法：采集并分离60例SLE患者和111例健康体检者的外周血白细胞及血清标本,建立细胞内HCMVUL55及UL138基因高度敏感特异的PCR方法,并检测SLE患者及健康体检者外周血白细胞内HCMVUL55及UL138基因,以确定HCMV感染情况,利用罗氏公司电化学发光法试剂盒检测血清HCMVIgG和IgM,比较SLE患者与健康体检者外周血白细胞内HCMVUL55、UL138检测及血清IgG、IgM检测的阳性率和相关性,统计分析外周血白细胞内HCMV感染与SLE常见临床指标的关系。结果：琼脂糖凝胶电泳及测序结果显示,建立的PCR方法能特异地检测外周血白细胞内HCMVUL55及UL138基因;血清HCMVIgG及细胞内HCMVUL138基因检测几乎全部呈阳性,SLE患者与健康体检者之间差异无统计学意义（P＞0.05）;血清HCMVIgM检测阳性率低,SLE患者血清HCMVIgM检测阳性率（为6.67%）略高于健康体检者（为0.90%）（P=0.052）;SLE患者外周血白细胞内HCMVUL55基因检测的阳性率明显高于健康体检者（P＜0.01）。HCMV感染4种检测方法的相关分析显示,细胞内HCMVUL138检测结果与血清HCMVIgG检测有较好的一致性。分析SLE患者外周血白细胞内HCMV感染状况与临床指标的相关性显示,与UL138基因不同,细胞内HCMVUL55检测呈阳性的SLE患者与检测呈阴性的SLE患者比较,存在多项明显差异的临床指标。结论：HCMV感染与SLE存在一定的相关性,但不同检测方法结果差异显著。     

器官移植病人HHV-6和HCMV感染的追踪研究

用病毒分离、ＰＣＲ和血清学方法追踪研究３１例器官移植病人ＨＣＭＶ和ＨＨＶ６感染情况及其对移植的影响。结果显示：ＨＣＭＶ和ＨＨＶ６分离率分别为３５５％和４５２％。术后ＤＮＡ阳性率分别为２５８％和３２３％;术前相应的ＩｇＭ阳性率分别为０％和３２％,术后ＩｇＭ阳性率分别为１９４％和２５８％;术前ＤＮＡ阳性率分别为３５０％和４５２％。术后ＤＮＡ阳性率分别高达４５２％和６１３％,并在３个月内维持高水平。早期死亡病例１００％有ＨＣＭＶ和／或ＨＨＶ６感染。活动性ＨＨＶ６和ＨＣＭＶ感染率分别为３２３％和２５８％,多为复发性,术后２周出现,３～４周达高峰,３月内均可发生。提示术后ＨＨＶ６和／或ＨＣＭＶ感染是移植成败的关键之一     

更昔洛韦联合中药金叶败毒制剂体外抗人巨细胞病毒作用观察

目的：研究更昔洛节(GCV)联合中药金叶败毒制剂(JYBD)抗人巨细胞病毒(HCMV)感染的可能机制。方法：采用体外细胞培养技术建立HCMV感染细胞模型．应用GCV、JYBD及两药联用进行干预,采用定量RT-PCR法检测干预后不同时间感染细胞HCMV即刻早期基因IE72 mRNA的表达水平,观察感染细胞的病变情况,同时采用放射免疫法测定受染细胞TNF-α和IL-6的分泌水平。结果：JYBD与GCV对HCMV IE72 mRNA的表达以及HC-MV所致细胞病变有明显的抑制作用,降低受染细胞的TNF-α、IL-6的分泌水平,JYBD作用弱于GCV,2药联合作用最强。结论：GCV联合JYBD可通过促进细胞因子的分泌,调节免疫功能,具有良好的体外抗HCMV作用。     

云南省无偿献血者巨细胞病毒感染情况的研究

目的 了解云南省无偿献血者巨细胞病毒(HCMV)感染情况,为制订科学的防治措施提供依据.方法 采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清巨细胞病毒IgM抗体,并对血清学阳性和随机选取的200份血清学阴性血样进行荧光定量PCR(fluorescent quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)检测,对两种方法的检测结果进行相关性分析.结果 云南省无偿献血者IgM阳性率为1.32%,IgM与FQ-PCR显著相关.结论 云南省无偿献血者巨细胞病毒阳性率与国内其他地区学者所报道相近,存在经输血传播巨细胞病毒安全隐患,在考虑成本因素的情况下,可以采用巨细胞病毒IgM检测的方法对献血者进行选择性筛查.     

Laboratory and clinical diagnosis of human cytomegalovirus infection after transplantation

Summary Urine and blood specimens from 32 recipients of allograft organ transplant were investigated for human cytomegalovirus (HCMV) by conventional cell culture, indirect immunofluo.rescent assay subsequent to the rapid cell culture and DNA-DNA hybridization. The results showed that the rapid cell culture technique might be the best method for rapid detection of active HCMV infection after transplantation because it possesses the advantages of simplicity, speediness, sensitiveness, and high reliability of detecting productive HCMV infection. The major symptoms were prolonged or intermittent fever unresponsive to antibiotics, dysfunction or loss of function of the transplanted organ, pulmonary infiltrates and leukopenia. As our results suggested, reactivation of a latent infection appears to be the most probable etiologic factor contributing to HCMV infection after transplantation.     

人巨细胞病毒UL144基因克隆表达及其对树突状细胞功能的影响

目的:构建携带人巨细胞病毒(hCMV) UL144基因的重组腺病毒,研究UL144基因修饰的树突状细胞(dendritic cell,DC)的功能变化。方法:从hCMV-DNA阳性患者外周血提取cDNA,采用PCR技术扩增出UL144基因。采用AdEasy系统构建携带hCMV UL144基因的重组腺病毒载体pAd-UL144,转染HEK293细胞后包装产生重组腺病毒Ad-UL144。通过RT-PCR检测目的基因的表达。将此重组腺病毒转染小鼠骨髓来源的DC,采用流式细胞术检测DC表面分子,采用ELISA技术分析DC培养上清中的细胞因子,采用3H-TdR掺入法检测UL144基因修饰的DC激活T细胞增殖的能力。结果:成功将UL144基因片段克隆至载体上,并经HEK293细胞包装出病毒颗粒,经测定病毒滴度为3×1010 pfu/ml。流式细胞术检测显示,UL144基因修饰的DC表面分子CD80、CD86和I-Ad表达水平低于对照组(P<0.01)。ELISA分析表明,UL144基因修饰的DC分泌TNF-α、IL-6和IL-1β的能力减弱(P<0.05)。UL144基因修饰的DC介导的T细胞增殖功能明显低于DC对照组(P<0.01)。结论:UL144基因修饰的DC具有维持相对未成熟状态的能力,并减弱了对抗原特异性T效应细胞的刺激功能。     

Sequence variability of human cytomegalovirus UL143 in low-passage clinical isolates

Background Human cytomegalovirus （HCMV） infects a number of organs and tissues in vivo. The different symptoms and tissue tropisms of HCMV infection perhaps result from genetic polymorphism. A new region of DNA containing at least 19 open reading frames （ORFs） （denoted UL133 to 151） was found in the low-passage HCMV clinical strain, Toledo, and several other low-passage clinical isolates, but not present in the HCMV laboratory strain, AD169. One of these genes, UL143, was studied to explore the sequence variability of UL143 ORF in HCMV clinical isolates and examine the possible association between gcne variability and the outcome of HCMV infection. Methods The UL143 gone of the strains obtained from suspected congenitally HCMV-infectcd infants was amplified by polymerase chain reaction （PCR） and sequenced. Results Nineteen sequences of the strains were divided into 2 major groups, G1（n=16） and G2（n=3）. All of the sequences had frame-shift mutation compared to Toledo. Nucleotide polymorphisms conferred substantial amino acid substitutions when compared with Toledo. All 16 UL143 putative proteins of the strains in G1 had a new myristylation site and loss of two PKC sites owing to missense mutations. No convincing relationships were observed between the presence of HCMV disease and the UL143 sequence group. Conclusions HCMV-UL143 existed in low passage isolates. Sequence variability caused by frame -shift mutation was found in all HCMV clinical strains. No obvious linkage was observed between UL143 polymorphisms and the outcome of suspected congenital HCMV infection.     

Diagnostic value of human cytomegalovirus late mRNA detection in active intrauterine infection

目的：探讨人巨细胞病毒晚期mRNA检测在宫内活动性感染中的应用价值。方法：采用逆转录-PCR法对42例HCMV-IgM阳性孕妇外周血及部分胎儿附属物进行HCMV晚期mRNA检测。结果：42例IgM阳性孕妇检出晚期mRNA23例,两符合率为54.7％。对其中13例mRNA阳性孕妇胎儿附属物进行检测发现7例阳性,母婴传播率为53.8％;而12例mRNA阴性HCMV-DNA阳性孕妇胎儿附属物中仅1例阳性,母婴传播率为8.3％;两有非常显性差异。结论：HCMV-IgM的阳性结果并不能完全准确地反映受检时HCMV的活动状态。HCMV的活动状态与母婴传播率密切相关,mRNA的检测不仅能够正确反映HCMV活动性感染时的宫内传播率,而且可以了解受检时胚胎或胎儿组织内HCMV的活动状态,并估计其愈后。     

SAT法检测人巨细胞病毒pp67 mRNA在人类免疫缺陷病毒合并人巨细胞病毒感染患者临床诊疗中的价值探讨

目的 探讨实时荧光核酸恒温扩增检测技术(simultaneous amplification and testing,SAT)检测人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)基质表层蛋白pp67(phosphoprotein67, pp67) mRNA在人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)合并HCMV感染患者临床诊疗中的价值。方法 利用SAT技术构建检测HCMV pp67 mRNA的方法,评估SAT法检测HCMV pp67 mRNA重复性、特异性以及检测下限;收集HIV阳性HCMV活动性感染患者69例、HIV阳性HCMV非活动性/潜伏感染154例、HIV阴性HCMV非活动性/潜伏感染 79例患者的血清、肺泡灌洗液、脑脊液等样本进行HCMV pp67 mRNA检测,评估特异度、灵敏度、正确率、阴性预测值、阳性预测值以及约登指数,评估HCMV pp67 mRNA在辨别HCMV活动性感染中的临床价值。结果 SAT法检测HCMV pp67 mRNA的精密度(变异系数<10%)可满足临床检测要求,与其他病原体无交叉反应,特异性良好,试剂检测下限为400 copies/mL;特异度87.55%,灵敏度60.87%,正确率81.46%,阴性预测值0.88,阳性预测值0.59以及约登指数0.48;SAT法检测HCMV pp67 mRNA结果阳性率与临床诊断结果差异无统计学意义(P=0.894)。结论 SAT法检测HCMV pp67 mRNA可用于HCMV活动性感染的辅助诊断。     

人巨细胞病毒UL137基因在临床低传代分离株中的多态性研究

目的：研究人巨细胞病毒（HCMV）UL137基因在先天巨细胞病毒感染临床低传代分离株中的多态性。方法：选择经荧光定量PCR方法检测HCMV-DNA为阳性的临床分离株进行涵盖UL137全序列的UL136，UL138基因全序列PCR扩增，对扩增阳性的标本进行全序列的测序，核实测序结果，拼接出UL137基因编码序列，进行相关分析。结果：经分析获得22株HCMV临床分离株UL137ORF核苷酸序列，核苷酸变异分布于整个编码区，但主要集中在5’端220—290bp处，均为核苷酸碱基替换，无插入及移码突变。在UL137预测编码蛋白氨基酸序列中，新增2个半胱氨酸位点，导致17株临床分离株在71-76位氨基酸出现了N相连豆蔻酰化位点（MYR）的新增，及第90～92位氨基酸硫化cAMP位点的相应缺失。结论：HCMVUL137基因在临床低传代分离株中高度保守，但存在一定的多态性。     

人巨细胞病毒感染与婴儿肝炎综合征及肝功能损害的相关性研究

目的：探讨人巨细胞病毒（HCMV）感染与婴儿肝炎综合征（IHS）和肝功能损害的关系。方法采用荧光定量 PCR对236例 IHS 患儿和对照组健康婴儿行尿 HCMV DNA 检测,并对254例 HCMV 感染阳性的患儿行肝功能回顾性分析。结果236例 IHS 患儿尿 HCMV DNA 阳性率为62．7％（148／236）。 IHS 患儿 HCMV DNA 和 HCMV IgM 阳性率明显高于对照组,差异有统计学意义（P＜0．01）。254例 HCMV 感染阳性的患儿肝功能指标：血清总胆红素（TBIL）、谷氨酰转肽酶（GGT ）、总胆汁酸（TBA）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST ）和丙氨酸氨基转移酶（ALT ）均高于正常参考范围,差异均有统计学意义（P ＜0．01）。结论广西地区 IHS 患儿 HCMV 检出率高,HCMV 是 IHS 的重要病原体,对婴儿肝功能有损害。     

TNF-α、IL-10、bcl-2、bax与人巨细胞病毒导致胚胎停育的相关性

目的 探讨人巨细胞病毒(HCMV)导致胚胎停育的分子机制. 方法 采用荧光定量PCR(FQ-PCR)分别对41例胚胎停育妇女(病例组)及30例正常孕妇(对照组)的流产组织进行HCMV DNA检测;对HCMV阳性病例进行HE染色观察形态学的改变,采用免疫组织化学(IHC)检测其局部细胞因子1NF-α、IL-10、bd-2、bax的变化,并与对照组进行比较. 结果 病例组HCMVDNA的阳性检出率为41.46%,对照组的阳性检出率为13.33%,两组之间比较差异具有统计学意义(P<0.01);HCMV阳性病例胎盘绒毛水肿明显,炎细胞浸润,鲜见巨细胞形成;病例组IL-10较对照组升高(P<0.05),bcl-2较对照组降低(P<0.05),TNF-α、bax表达两组差异无统计学意义. 结论 HCMV可能是导致胚胎停育的病原之一,HCMV感染加重了孕妇"免疫抑制"引起胎盘绒毛及蜕膜组织的凋亡致使胎儿宫内发育受限最终导致胚胎停育.     

巨细胞病毒感染与儿童免疫性血小板减少性紫癜的关系探讨

目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)感染与儿童免疫性血小板减少性紫癜(ITP)的关系。方法采集154例ITP患儿(ITP组)和50例健康儿童(对照组)的血清样本,用Real-time PCR检测HCMV DNA,ELISA方法检测HCMV IgM、IgG抗体;其中105例ITP患儿和50例健康对照儿童采集了尿液标本,用Real-time PCR检测HCMV DNA,并比较ITP组HCMV DNA阳性患儿与阴性患儿的血小板数量的差异。结果 ITP患儿血清HCMV DNA、HCMV IgM及IgG抗体和尿HCMV DNA阳性率均明显高于健康对照儿童,两组比较差异均有统计学意义(P<0.01);ITP组HCMV DNA阳性患儿的血小板数量(29.72±14.54)×109/L与阴性患儿(41.28±18.35)×109/L比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论儿童感染HCMV可能是发生ITP的重要致病因素之一,这对指导临床有效治疗及预防ITP的发生有着积极的意义。