雌激素影响急性大鼠脊髓损伤后细胞凋亡的相关性实验研究

目的在建立大鼠脊髓损伤模型基础上,观察不同时间点雌激素对脊髓胶质细胞,神经元凋亡的影响,以期为临床急性脊髓损伤的治疗提供理论依据。方法健康成年大鼠72只,随机分为两组,其中单纯损伤组（单纯打击损伤）36只,雌激素组（手术加雌激素）36只。脊髓损伤动物模型的制备：用自制Allen打击器25gcm致伤力撞击脊髓,制成脊髓损伤动物模型。雌激素组每日肌注雌激素（100μg／kg）直至处死,单纯损伤组仍每日肌注生理盐水0．5ml直至处死。组织切片的制备：脊髓损伤后1d、3d、5d、8d、14d、21d共6个时间段分批处死动物。4％多聚甲醛心肌灌注固定24h,切取每只大鼠T5～T13节段脊髓组织,常规制成切片,给于Bcl－2检测,TUNEL原位末端标记,检测大鼠脊髓损伤后细胞凋亡的情况。脊髓损伤后2周给予Gale评分及斜板维持试验。结果Bcl－2蛋白检测：在脊髓损伤后的第1天,脊髓组织即开始较高表达Bel－2蛋白。单纯损伤组Bcl－2高峰发生在损伤后3天,而雌激素组伤后8天达到高峰,此时Bcl－2蛋白不仅表达在神经细胞中,更多的在胶质细胞中大量表达,且此状态一直维持到伤后14天才开始下降,伤后21天仅少量表达（P〈0．05）。TUNEL原位标记检测：单纯损伤组24小时已出现不少阳性细胞,以胶质细胞为主．3～8天达到高峰,此后逐渐回落,但21天时仍有阳性细胞,应用雌激素治疗后,凋亡细胞明显减少（P〈0．05）。脊髓损伤后2周Gale评分及斜板维持率雌激素组优于单纯损伤组（P〈0．01）。结论雌激素在脊髓损伤中通过改善微循环,促进Bcl－2蛋白的表达,清除氧自由基,抗氧化作用能够抑制脊髓损伤早期神经细胞和胶质细胞的凋亡,从而减轻脊髓继发性损伤．促进脊髓神经功能的恢复。所以脊髓损伤后早期应用雌激素配合其它药物阻止神经细胞和胶质细胞的凋亡可能有助于减轻脊髓损伤的损害程度,促进脊髓神经功能的恢复,为SCI的治疗提供一个新的途径。     

脊髓损伤的细胞凋亡及其调控

脊髓损伤后 ,除神经细胞坏死外 ,还存在细胞凋亡 ,并在继发性脊髓损伤中起重要作用。笔者对近年来脊髓损伤后细胞凋亡及其分子调控机制作如下综述。一、细胞凋亡在继发性脊髓损伤中起重要作用脊髓损伤包括原发性损伤和继发性损伤 ,而神经细胞的凋亡是继发性脊髓损伤的重要组成部分。在不同脊髓损伤模型中的许多研究证实 ,继发性脊髓损伤广泛存在着神经细胞凋亡[1～ 1 0 ] 。Ｌｉ等[1 ,4] 观察大鼠脊髓压迫损伤后 4～ 9ｄ ,在损伤部位 (Ｔ8,9)及相邻节段 (Ｔ7、Ｔ1 0 )白质有大量的胶质细胞凋亡 ,细胞主要是少突胶质细胞 ,而灰质的神经元不表…     

慢性压迫性脊髓损伤细胞凋亡的实验研究

目的：观察慢性压迫性脊髓损伤的细胞凋亡现象,方法：45只2个月龄Wistar大鼠,置入后路渐进压迫装置,根据脊髓压迫程度分为轻,中,重3组,应用Feulgen染色,末端脱氧核苷酸转移酶介导生物素化dUTP缺口末端标记（TUNEL）技术,观察不同和蔼慢必压迫性脊髓损伤后各种细胞凋亡的特点,结果：不同程度损伤直接受压段中,中度损伤的凋亡现象是了为显著,与轻度,重度损伤的凋亡率比较,差异有显才性产意义（P＜0．01）,凋亡细胞主要分布在白质纵向传导束上髓的区域,主要为少突胶质细胞,神经元存在少量凋亡现象,分布在III－IX板层,主要在后角,结论：细胞凋亡是慢性脊髓损继发病理变化的重要级成部分,神经元和胶质细胞凋亡是损伤后细胞死亡的主要原因之一,少突胶质细胞凋亡可能是白质脱髓鞘的主要原因。     

潜艇脱险中极快速减压后大鼠小胶质细胞与神经元凋亡的变化

目的 研究成年大鼠极快速减压致中枢神经损伤后脑组织内小胶质细胞的变化及其与损伤后神经元凋亡的关系。方法 采用1MPa暴露5．5min、50s快速减压制备SD大鼠中枢减压损伤模型,在减压后6、24、48、72h取材,分别用FITC标记的凝集素B4（IB4）标记小胶质细胞和原位末端TUNEL。法标记凋亡神经元细胞。结果 快速减压后6h组可见少量IB4阳性小胶质细胞;24h组达高峰（P〈0．01）;48h组阳性小胶质细胞数量有所下降,但仍高于6h组（P〈0．01）;72h组阳性小胶质细胞数量明显下降。6h组仅见少量散在TUNEL,阳性细胞;48h组达高峰（P〈0．01）;72组阳性细胞数量有所下降,但仍高于6h组（P〈0．01）。凝集素阳性小胶质细胞分布区域与神经元凋亡分布区域一致,达到高峰的时间前者先于后者,两者的变化趋势相同（r=O．645,P〈0．01）。结论 不安全极快速减压致中枢型减压病的中枢神经损伤中存在神经元凋亡和小胶质细胞的活化,激活的小胶质细胞可能参与了快速减压后的神经元凋亡过程。     

低温预处理对大鼠脊髓内牵拉后脊髓神经细胞凋亡及神经功能的影响

目的 探讨局部低温预处理对大鼠脊髓内牵拉型脊髓损伤病理形态学改变、神经细胞凋亡和神经功能的影响。方法 将80只4个月龄SD大鼠随机分为低温预处理组（A组）和对照组（B组），建立大鼠脊髓内牵拉型脊髓损伤模型，于损伤后2，4，8，24，48，72h和7d评估脊髓损伤后大鼠运动功能，用HE染色观察损伤脊髓组织病理变化，原位末端标记（TUNEL）法标记凋亡细胞。结果 HE染色镜检显示A组脊髓组织病理学改变明显轻于B组。A、B两组运动功能评分和神经细胞凋亡指数比较，差异有统计学意义（P〈0．05或0．01）。结论 低温预处理可明显减轻大鼠脊髓内牵拉型脊髓损伤早期病理形态学损伤，抑制细胞凋亡，有助于神经功能的恢复。     

大鼠脊髓缺血损伤后神经微丝及胶质纤维酸性蛋白的改变

目的神经微丝（ＮＦ）和胶质纤维酸性蛋白（ＧＦＡＰ）分别为神经细胞和胶质细胞特异的中间丝蛋白。着重探讨大鼠脊髓缺血损伤后ＮＦ和ＧＦＡＰ的改变及其可能的病理意义。方法利用ＮＦ和ＧＦＡＰ的单抗，借助于免疫组化、图像分析等手段，对大鼠腹主动脉再灌流缺血模型损伤脊髓神经细胞ＮＦ６８染色强度及胶质细胞数进行定性定量研究。结果伤后１天，ＮＦ的变化不明显；伤后３天，ＮＦ染色明显降低；７天达最低水平，并持续至２１天；２８天基本恢复至伤前。而胶质细胞数与正常相比，伤后１，３，７天无明显变化；至伤后１４天明显增加，并随时间而增加；至２８天达高峰。结论脊髓损伤后ＮＦ的降低与创伤性脑损伤中ＮＦ的变化相似，提示亦具有扩散性轴突损伤的存在。而胶质细胞的增生可能参与脊髓损伤的修复过程。     

大鼠脊髓占位损伤后细胞凋亡在不同脊髓平面、不同时间的变化及其意义

目的 探讨脊髓占位损伤后不同观察时间、损伤中心两端不同平面神经细胞凋亡的变化。方法 采用脊髓占位损伤模型，在伤后6，24，48，72h、5，7d6个时相点观察损伤中心两侧1．5，3．5，5．5，7．5mm脊髓平面的细胞凋亡情况。结果 脊髓损伤后继发性改变可影响到损伤中心头侧7．5mm、尾侧7．5mm区域，变化开始时间分别在伤后48h和72h；另外在损伤中心，灰质区细胞凋亡高峰晚于白质区出现，灰质区凋亡细胞指数在不同时间变化较大。结论 脊髓占位损伤后神经细胞凋亡在不同平面、不同时间存在明显差异。继发性损伤与神经系统固有的传导通路有关，也与损伤信号中介因素有关。     

依达拉奉对实验性急性脊髓损伤后细胞凋亡的影响

目的观察依达拉奉（MCI-186）对脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响。方法选择SD雄性大鼠40只,随机分成对照组和MCI-186组,均采用改良的Allen打击（WD）法制成150gcf（克厘米势能）中度急性脊髓损伤模型,术后实验组给予MCI-186,3mg/kg对照组给予等量生理盐水。分别于术后6h、12h、24h、72h、7d处死动物取材,采用流式细胞仪检测损伤段脊髓细胞凋亡的情况。结果对照组和MCI-186组均发现凋亡细胞,均在1d达到高峰,但MCI-186组凋亡细胞比率显著低于对照组（P〈0．05）。结论MCI-186通过有效地清除氧自由基,可明显抑制急性脊髓损伤后的脂质过氧化反应及降低神经细胞的凋亡,从而达到保护其神经组织的作用。     

Bcl-xL基因转染对脊髓损伤细胞凋亡的影响

目的观察脂质体介导的Bcl—xL基因体内转染对大鼠脊髓损伤后伤区脊髓细胞凋亡和神经功能恢复的影响。方法制备大鼠胸段脊髓T8.9压迫损伤模型。38只大鼠分成三组：(1)损伤 pSFFV．Bcl—xL转染组(实验组，15只)；(2)损伤 pSFFV．GFP转染组(对照组，15只)；(3)假损伤组(8只)。将阳离子脂质体质粒混合后直接注入大鼠损伤脊髓，伤后3d和7d利用半定量逆转录一聚合酶链式反应(RT—PCR)和免疫组化检测Bcl—xL基因体内表达；原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡；采用开放场地试验BBB评分和斜板试验，评价神经功能。结果脊髓损伤后3d和7d损伤局部Bcl—xL mRNA和蛋白较对照组和假损伤组表达明显增多；TUNEL结果显示，实验组损伤节段细胞凋亡数比对照组明显减少，神经功能改善。结论脂质体介导Bcl—xL体内转基因治疗可有效转染脊髓的神经细胞；外源性Bcl—xL在损伤脊髓的过度表达可减少脊髓不完全性损伤后凋亡引起的神经元死亡和增强神经细胞成活，促进神经功能恢复。     

大鼠坐骨神经损伤后脊髓组织中Caspase 3、Bcl-xl表达变化的实验研究

目的：探讨大鼠坐骨神经损伤后脊髓组织中Caspase3、Bcl-xl的表达变化以及与脊髓神经细胞凋亡的关系。为进一步研究坐标神经损伤后的神经再生提供依据。方法：成年Wistar大鼠96只,随机分为对照组（12只）和实验组（84只）,实验组大鼠切除右侧长约6mm的坐骨神经,分为伤后3d和1,2,3,4,5,6周组,采用Caspase3、Bcl-xl免疫组化检测大鼠脊髓组织Caspase3、Bcl-xl表达变化,测定Caspase3的活性;采用流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双标检测和原位末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法（TUNEL）检测脊髓细胞凋亡情况。结果Caspase3、Bcl-xl免疫组化阳性反应主要位于灰质神经元细胞,高表达区在前角。伤后1周实验组伤侧脊髓组织中Caspase3表达轻度升高,2－4周显著升高,5周后下降,伤后1－3周脊髓Bcl-xl表达减弱,4周后明显升高,高水平持续到伤后6周;伤后2－4周在鼠伤侧脊髓有较多TNEL阳性标记细胞;伤后3d伤侧Caspase3活性荧光值开始升高,1－3周明显升高,4周逐渐下降;流式细胞仪检测,伤后1周伤侧脊髓凋亡细胞开始增加,2,3周为高峰,4周伤侧凋亡细胞逐渐减少。实验组末伤侧与对照组比较,各项检查差异无显著性意义。结论：Caspase3的活化是细胞凋亡的早期生化。与细胞凋亡的形态学表现相互关系;Bcl-xl对减轻大鼠坐骨神经损伤后脊髓组织细胞凋亡有重要作用,及早识别细胞凋亡的早期特征,对促进神经再生具有重要意义。     

慢性压迫性脊髓损伤后神经前体细胞的增殖情况

目的　通过分析成年大鼠慢性压迫性脊髓损伤后及减压后巢蛋白表达的变化 ,探讨神经前体细胞的增殖。　方法　选用健康Wistar大鼠 5 0只 ,体重 2 80～ 32 0g。制备慢性压迫性脊髓中度、重度损伤及重度压迫损伤减压后 3,10d模型 ,自距压迫边缘至 5mm段脊髓组织切片。正常成年健康大鼠作为正常对照组。巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白采用免疫组织化学染色 ,计算机图像分析仪定量分析 ,观察神经前体细胞的增殖情况。　结果　成年大鼠慢性压迫性脊髓中、重度损伤及重度压迫损伤减压后 3d ,巢蛋白在白质、灰质及脊髓中央管的室管膜细胞和减压后 10d组白质中均有明显表达 (P <0 .0 5 ) ,以重度压迫组最为显著 (P <0 .0 1)。减压后 10d组灰质与正常对照组比较 ,差异无显著性意义 (P >0 .0 5 )。与正常对照组相比 ,各损伤组脊髓内胶质纤维酸性蛋白表达增强 ;胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数目增多 ,胞体肥大 ,突起增粗、增长。　结论　成年大鼠慢性压迫性脊髓损伤及减压后早期存在神经前体细胞增殖。星形胶质细胞参与神经前体细胞的增殖与迁移 ,对脊髓具有重要的营养修复作用。     

少突胶质前体细胞移植治疗对大鼠脊髓损伤轴突髓鞘化的影响

目的 探讨少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)移植治疗对大鼠脊髓损伤轴突髓鞘化的影响.方法 采用Allen法制作大鼠T10脊髓损伤模型,亚急性期OPCs移植治疗.通过HE染色、免疫组化染色、髓鞘染色及透射电镜观察等方法,研究OPCs移植治疗对大鼠脊髓损伤轴突髓鞘化的影响.结果 移植术后8周时大鼠损伤脊髓内检测到移植细胞分布,HE染色显示OPCs移植组大鼠脊髓组织结构较对照组改善,勒克司坚牢蓝(LFB)髓鞘染色表明OPCs移植组大鼠脊髓内髓鞘含量(7 802.42±1 085.58)明显高于对照组(5 055.98±916.74)(P＜0.01),OPCs移植组大鼠脊髓组织内髓鞘碱性蛋白(MBP)表达水平(8 544.44±812.78)较对照组(5 243.83±808.27)显著增高(P＜0.01),透射电镜示OPCs移植组大鼠脊髓组织髓鞘化超微结构改善也较对照组明显.结论 OPCs移植治疗有助于改善大鼠脊髓损伤轴突髓鞘化情况.     

兔坐骨神经高速弹丸震荡伤后腰段脊髓运动神经元及胶质细胞凋亡规律

目的：探讨坐骨神经高速弹丸震荡伤后腰段脊髓运动神经元及胶质细胞凋亡规律。方法：65只大耳白兔分为正常对照组，高速弹丸震荡伤组（震荡伤组）和功能伤组，震荡伤组致伤靶点为兔右大腿外侧坐骨神经体表投影线中点，切割伤组在同一水平切断右坐骨神经，应用DNA电泳，原位末端标记法（TUNEL）染色和流式细胞仪进行细胞凋亡定性定量检测。结果：震荡伤组伤后2周运动神经元数明显减少，伤后1，2周，可见TUNEL阳性运动神经元及胶质细胞，DNA电泳出现凋亡梯形带，流式细胞仪检测可见亚二倍体峰，震荡伤组伤后1，2周，细胞凋亡百分比分别为10．6％和26．4％，切割伤组仅在4周时有少量阳性运动神经元，结论：与切割伤组比较，震荡伤组细胞凋亡发生早，数量多，凋亡是坐骨神经高速弹丸震荡伤后运动神经元数量减少的主要机制。     

NF-κB配体受体激动因子在脊髓损伤后骨髓间充质干细胞移植中的作用

目的探讨NF-κB配体受体激动因子(receptor activator of NF-kappa B ligand,RANKL)在脊髓损伤后人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)移植中对神经功能恢复的影响。方法Wistar大鼠60只,体重250～350 g,雌雄不限,随机分为3组:(1)hBMSCs组,脊髓半横切后行hBMSCs移植;(2)RANKL hBMSCs组,脊髓半横切后hBMSCs和RANKL协同移植;(3)PBS组,脊髓半横切,移植物以PBS代替。移植后1,7,14,21,28 d采用行为学指标观察大鼠神经功能恢复情况,应用免疫组化和免疫荧光技术检测移植的BrdU标记hBMSCs在宿主脊髓内胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性核蛋白(NeuN)的表达情况。结果大鼠脊髓半横切损伤后,hBMSCs组和RANKL hBMSCs组均较PBS对照组有明显的神经功能恢复;而移植7,14 d时,RANKL hBMSCs组动物较hBMSCs组神经功能恢复明显。RANKL hBMSCs组中hBMSCs-Ne- uN和hBMSCs-GFAP双标阳性率高于hBMSCs组。结论RANKL和hBMSCs协同移植可提高脊髓损伤后神经病学预后,提高hBMSCs在宿主体内向神经细胞的分化。     

依达拉奉对大鼠急性脊髓损伤后bcl-2/bax表达及细胞凋亡的实验研究

目的观察依达拉奉对大鼠急性脊髓损伤后bcl-2/bax表达及细胞凋亡率的影响,探讨其对急性脊髓损伤后脊髓组织的保护作用。方法成年SD雄性大鼠60只,随机分成对照组和依达拉奉组,均采用改良Allen’s撞击法,致伤力为50gcf（10g×5cm）损伤T9～10制作动物模型,术后实验组给予依达拉奉3mg/kg,对照组给予等量生理盐水。每组分别于6h、12h、24h、72h、7d5个时间点处死动物取材,每个时间点6只大鼠,对受损脊髓部位进行免疫组织化学检测神经细胞凋亡因子bcl-2和bax基因的表达及用原位末端标记法（TUNEL法）标记神经元凋亡细胞。结果与对照组相比,依达拉奉组bcl-2蛋白表达水平显著提高,bax蛋白表达水平明显下降。对照组检测到较高的细胞凋亡率。依达拉奉组细胞凋亡率较对照组明显下降。结论依达拉奉可能通过清除氧自由基、上调bcl-2和下调bax蛋白表达来抑制大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡,从而保护大鼠神经组织。     

TNF-α、Caspase-3在大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡中相关性研究

目的探讨大鼠脊髓损伤后肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)在神经细胞凋亡中的动态表达,验证TNF-α和Caspase-3之间的相关性。方法将70只成年健康SD大鼠按Nystrom法建立大鼠脊髓(T8、T9)急性压迫损伤模型,HE染色观察脊髓组织病理学变化;免疫组化染色测定各时间点TNF-α、Caspase-3的表达变化;原位末端脱氧核糖核酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸(d UTP)标记法(TUNEL法)检测神经细胞的凋亡水平;通过Western blot法检测大鼠脊髓中TNF-α、Caspase-3蛋白的表达水平。结果正常大鼠脊髓神经细胞TNF-α、Caspase-3的阳性细胞表达率较少;脊髓损伤后8 h,脊髓神经细胞中TNF-α、Caspase-3的阳性表达率明显增多,分别为(24.13%±3.02%)及(40.79%±3.43%),1 d达高峰,分别为(51.36%±4.26%)及(70.78%±5.97%),3 d表达减弱,分别为(20.24%±2.93%)及(37.71%±2.88%),与正常大鼠比较,差异有统计学意义(P<0.01)。TUNEL阳性细胞率在大鼠脊髓损伤后8 h明显增多(39.81%±2.27%),1 d达高峰(71.58%±3.87%),3 d表达减弱(40.55%±2.36%),与正常大鼠比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。大鼠脊髓损伤后1 d,与损伤组比较,抑制剂组TNF-α、Caspase-3、TUNEL阳性细胞率明显减少,差异有统计学意义(P<0.01)。造模后7 d,与空白对照组比较,损伤组TNF-α、Caspase-3蛋白的表达上升;与损伤组比较,抑制剂组TNF-α、Caspase-3蛋白的表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论脊髓损伤后TNF-α、Caspase-3的表达增强,TNF-α抑制剂使Caspase-3表达减弱,且其参与了脊髓损伤细胞凋亡的调节。