HT22细胞系铁死亡敏感性研究

目的 检测HT22细胞系可否作为研究神经元铁死亡的良好细胞模型,在细胞水平上为研究神经元铁死亡的机制提供基础。方法 用经典铁死亡诱导剂Erastin和RSL3处理HT22细胞系,显微镜下观察细胞存活情况;使用CCK-8法检测细胞存活率;使用丙二醛法或菲罗嗪法分别检测细胞内脂质活性氧（reactive oxygen species,ROS）、Fe²⁺浓度;实时定量聚合酶链反应（quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）法检测细胞铁死亡关键基因SLC7A11（solute carrier family 7 member 11）、PTGS2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2）的mRNA水平。结果 Erastin或RSL3处理HT22后,显微镜下发现细胞发生明显死亡,加入铁死亡抑制剂Ferrostatin-1后,细胞死亡显著减少。Erastin或RSL3诱导后HT22细胞内的Fe²⁺浓度无明显变化（P>0.05）,脂质过氧化水平明显增加（P<0.05）;Erastin或RSL3导致细胞SLC7A11、PTGS2的mRNA表达水平增加（P<0.05）,进一步验证了处理后细胞发生铁死亡。结论 HT22细胞系是一种铁死亡敏感细胞系,Erastin或RSL3诱导HT22铁死亡,HT22细胞系可用于研究神经元中铁死亡的发生及胞内脂质过氧化物蓄积机制。     

18 F-硼氨酸细胞摄取机制研究

目的 本研究采用半自动方法对¹⁸F标记的苯丙硼氨酸(¹⁸F-BF₃-Phe)进行标记,通过系统的细胞实验,建立¹⁸F-硼氨酸细胞摄取与L型氨基酸转运体-1(large-neutral amino acid transporter-1,LAT-1)表达的定量关系,初步阐述¹⁸F-硼氨酸在癌细胞中的摄取机制。方法 制备LAT-1转染细胞,用不同浓度LAT-1转染细胞进行¹⁸F-BF₃-Phe放射性摄取实验。培养PC9、 BXPC3、PC3、HEPG2细胞,进行不同时间点¹⁸F-BF₃-Phe放射性摄取实验。结果 LAT-1转染细胞放射性摄取实验中,细胞的放射性摄取随着LAT-1转染细胞比例的增加而逐渐增加,基本呈线性正相关。¹⁸F-BF₃-Phe在PC9、BXPC3、PC3、HEPG2 4种肿瘤细胞中均有摄取,并随时间推移呈逐渐增加趋势。其中PC9及BXPC3细胞对¹⁸F-BF₃-Phe的摄取更为显著。结论 通过LAT-1转染细胞摄取实验明确了¹⁸F-BF₃-Phe摄取与LAT-1转运体表达之间呈正相关,为进一步的体内实验提供了重要的理论依据。¹⁸F-BF₃-Phe在多种肿瘤细胞中均有高摄取,显示该探针在肿瘤显像方面进行临床转化的良好前景。     

N-精氨酰壳寡糖聚合物纳米粒的构建及其作为药物载体的可行性研究

目的 构建N-精氨酰壳寡糖聚合物纳米粒 (N-arginyl-chitooligosaccharidenanoparticles,ACOS NPs),研究其作为药物载体的可行性。方法 合成N-精氨酰壳寡糖 (N-arginyl-chitooligosaccharide,ACOS),利用FT-IR、1H NMR对其结构进行表征。离子凝胶法制备ACOS NPs,利用透射电镜观察其形貌,ZetasizerNano-ZS纳米粒度仪测定其粒径分布及表面ζ电位。利用MTT法研究ACOS NPs对HeLa细胞的体外细胞毒性。利用流式细胞仪和共聚焦显微镜研究HeLa细胞对FITC荧光标记的ACOS NPs的体外细胞摄取情况。结果 FT-IR和1H NMR结果确证了精氨酸对壳寡糖的修饰。ACOS NPs近似球形,平均粒径为146.3 nm,表面电位为9.76 mV,且具有良好的分散性。MTT实验结果证实ACOS NPs对HeLa细胞未表现出明显的细胞毒性,具有良好的细胞相容性。ACOS NPs可被HeLa细胞快速、持续摄取,摄取率较高且表现出一定的时间和浓度依赖性。结论 ACOS纳米粒具有良好的细胞相容性,作为药物载体可显著促进药物的跨膜转运,有望成为一种高效无毒的药物递送载体。     

低分子量鱼精蛋白介导的天花粉蛋白的抗肿瘤应用

【目的】研究重组穿膜肽天花粉蛋白的抗肿瘤作用。【方法】利用蛋白重组技术,在天花粉蛋白的C端引入半胱氨酸,并以此作为修饰位点偶联穿膜肽,通过亲和色谱法分离纯化得到目的蛋白。以十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目的蛋白的生成以及其对还原性物质的响应性。通过细胞摄取实验研究穿膜肽介导蛋白内吞摄取效率,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法,测定穿膜肽天花粉蛋白修饰物的抗肿瘤活性。【结果】成功制备穿膜肽—天花粉蛋白复合物,此复合物具有一定还原响应性。且经过穿膜肽修饰后,天花粉蛋白在HeLa、MCF-7肿瘤细胞的摄取率明显增强,对HeLa、MCF-7细胞的抗肿瘤作用也显著提高。【结论】穿膜肽修饰天花粉蛋白可显著提高其抗肿瘤作用。     

Twist基因对结肠癌细胞系侵袭转移能力影响的体外研究

目的 :探讨Twist基因在SW480、HCT116和HT29结肠癌细胞系上皮-间质转化（EMT）中的作用,明确其对恶性肿瘤侵袭转移能力的影响。方法:利用重组质粒pTracer-CMV/BSD-Twist 和pGenesil1.2-Twist-shRNA转染SW480、HT29和HCT116;流式细胞术检测转染率;Real time-PCR和Western blot检测Twist,E-cadherin和Vimentin转录及蛋白表达水平;Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力。结果:转染高表达Twist质粒后,各结肠癌细胞系中Twist和Vimentin表达水平显著升高（P<0.05）,E-cadherin显著降低（P<0.05）;转染低表达Twist质粒后,SW480和HT29中各指标均无显著变化（P>0.05）,HCT116中Twist 和Vimentin表达水平显著降低（P<0.05）,E-cadherin无显著变化（P>0.05）;Transwell实验表明抑制HCT116细胞系Twist表达后,其侵袭和迁移能力明显减弱（P<0.01）。结论:上调Twist表达可以促进EMT;抑制HCT116 中Twist表达能减弱结肠癌细胞的侵袭和转移能力。     

人端粒酶反转录酶启动子的克隆与肿瘤靶向治疗的研究

目的 克隆hTERT启动子,并观察hTERT启动子调控下tk/GCV系统对人肺癌细胞系A549的特异性杀伤效果。方法 设计特异性引物,以HepG2基因组DNA为模板,用PCR方法扩增hTERT启动子;分别构建hTERT启动子和hCMV启动子调控的LacZ、tk基因真核表达载体;将上述质粒用脂质体转染A549细胞和人胚肺成纤维细胞系MRC5后,通过RT-PCR和β-Gal染色观察hTERT启动子工作情况;用MTT法检测不同浓度的GCV对A549和MRC5细胞的细胞毒作用。结果 成功克隆hTERT上游-280bp~+40bp的核心启动子。RT-PCR和β-Gal染色显示hTERT启动子能有效地调控其下游tk基因、LacZ基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性转录和表达;hTERT启动子调控的tk/GCV系统对端粒酶阳性的肿瘤细胞系A549有明显的特异性杀伤效应。结论 hTERT启动子可特异性地调控目的基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达而不影响正常的细胞,表明端粒酶启动子调控自杀基因的表达是一种很有希望的肿瘤靶向基因治疗策略。     

人大肠癌线粒体DNA重组质粒的构建

目的 了解大肠癌细胞株(SW480,LoVo,HT29)线粒体DNA的突变,克隆突变的大肠癌线粒体DNA(mtDNA)基因,构建pcDNA3.I(+)-mtDNA真核表达重组体,并导入NIH3T3细胞,以探讨线粒体基因突变与肿瘤发生的关系。方法 提取大肠癌细胞株(SW480,LoVo,HT29)mtDNA,扩增D-LOOP区,产物用DNA自动测序法进行序列分析。利用DNA重组技术将其定向插人真核表达质粒pcDNA3.1(+),并用脂质体法导人NIH3T3细胞。结果 检测出大肠癌细胞株SW480、LoVo、HT29细胞mtDNAD-LOOP分别有10、9、8个突变位点。成功克隆1119bp的mtDNAD-LOOP区至表达质粒pcDNA3.1(+),并导入NIH3T3细胞中。结论 线粒体DNAD-LOOP区是一个具有高度多态性和突变性的区域,在大肠癌细胞株中突变率较高。     

石蒜碱衍生物LY-09对两种癌细胞增殖和迁移的影响

目的 观察石蒜碱衍生物LY-09对人肺癌细胞A549和人乳腺癌细胞MCF-7细胞增殖、迁移的影响,初步探讨其可能的作用机制。方法 已上市药物阿霉素和SAHA(组蛋白去乙酰化酶抑制剂)为阳性对照药,对数期稳定生长的A549细胞和MCF-7细胞分别加入不同浓度(9,3,1,0.3,0.1,0.03,0.01,0.003 μM)的LY-09进行培养。MTT法检测LY-09对肿瘤细胞增殖的影响,细胞划痕实验检测LY-09对肿瘤细胞迁移能力的影响,考察LY-09分别与阿霉素、SAHA联合使用对肿瘤细胞的影响。结果 LY-09可显著抑制 A549和MCF-7的增殖(EC₅₀分别为0.081 ± 0.024和0.275±0.083 μM),呈浓度依赖性;LY-09还可以抑制A549和MCF-7的细胞迁移;LY-09与SAHA联合用药可以发挥协同作用。结论 石蒜碱衍生物LY-09可以抑制肿瘤细胞的增殖与迁移,有望进一步发展成为抗肿瘤药的化学前体。     

乳腺癌细胞原位移植模型的建立及紫杉醇和表柔比星联合用药疗效

目的 建立乳腺癌细胞原位移植瘤模型,观察紫杉醇及联合表柔比星的抑瘤效果,为临床联合用药提供实验依据。方法 用乳腺癌细胞悬液接种于动物脂肪垫下建立荷瘤鼠,待瘤块直径≥1 cm时,处死动物剥离肿瘤,接种于裸小鼠脂肪垫下,建立原位移植的乳腺癌肿瘤模型。成模动物按瘤体积大小随机分为紫杉醇组、表柔比星组、联合用药组及模型对照组4组,连续给药3周后,观察各组小鼠的肿瘤生长情况,抑瘤率及肿瘤组织中P53蛋白的表达情况。结果 成功建立原位移植的乳腺癌肿瘤模型,成模小鼠给药3周后,与模型对照组相比,各给药组小鼠体重和瘤重均有显著下降（P<0.05）,其中,紫杉醇组抑瘤效果显著;给药后第8天,紫杉醇组小鼠肿瘤体积与模型对照组比较有显著性差异（P<0.05）,给药后第21天,紫杉醇组的抑瘤率达到82.53%;肿瘤组织中P53蛋白的表达情况,与模型对照组相比,紫杉醇组和联合给药组表达显著减弱（P<0.05）。结论 成功构建原位乳腺癌模型,实验结果显示紫杉醇及其与表柔比星的联合用药对肿瘤均有一定抑制作用。     

介孔TiO2纳米粒在声动力学治疗肝细胞肝癌应用的生物相容性评估

 目的 评估介孔二氧化钛（titanium dioxide，TiO₂）纳米粒在声动力学抗人肝癌HepG2肿瘤的生物安全性。方法 采用软模版法合成介孔TiO₂纳米粒，与HepG2细胞共培养后通过噻唑蓝还原法评估毒性，应用荧光探针测定其介导声动力学治疗在HepG2细胞内产生活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的情况。采用血液凝集实验测评血液相容性，并通过静脉注射后小鼠血液生化指标及脏器组织切片HE染色来评估安全性。昆明小鼠与HepG2种植瘤裸鼠静脉给药后，在指定时间取脏器及肿瘤于王水中消化，应用电感耦合等离子体发射光谱绘制药物脏器分布图。结果 介孔TiO₂纳米粒具有高度分散性和均一性，细胞共培养后显示无毒性，联合超声在HepG2细胞中产生ROS。血液凝集实验所有指标、小鼠血液生化指标及脏器组织切片（最高剂量150 mg/kg）与对照组差异均无统计学意义。静脉给药后主要分布于肝脾，8 h达峰（含51.32%），1 h时肿瘤组织的药物分布达6.74%，并于24 h内显现出维持浓度。结论 介孔TiO₂纳米粒作为声敏剂能有效产生ROS，具有良好静脉注射安全性，主要通过网状内皮系统代谢，能蓄积于肿瘤组织内为声动力学治疗提供良好时间窗口。     

不同亚型的囊性肾癌诊疗与预后分析

?目的:探讨不同亚型的囊性肾癌的诊疗及预后情况。方法:回顾性分析75例囊性肾癌患者的临床资料。患者术前影像学检查:56例考虑恶性病变,13例考虑单纯性肾囊肿,6例考虑为多房性肾囊肿。47例行根治性肾切除术,其中开放手术20例,腹腔镜手术27例;保留肾单位手术14例,其中开放手术9例,腹腔镜手术5例;后腹腔镜下肾囊肿去顶减压术13例 ,其中2例术中冰冻病理检查提示恶性,同期行根治性肾切除术,9例术后2～3周二期行根治性肾切除术,2例密切随访;1例行保留肾单位手术,术中冰冻病理检查提示恶性病变,同期行根治性肾切除术。结果:75例术后病理报告均为囊性肾癌,其中肾细胞癌囊性变38例,多房囊性肾癌16例,单房囊性肾癌（囊腺癌）8例,肾囊肿恶变13例。随访25～147个月,平均63个月,未见肿瘤复发和转移。结论:囊性肾癌的诊疗及预后需根据不同的亚型分析,保留肾单位手术可作为囊性肾癌的一种可选择的治疗方式。     

叶酸靶向修饰载新藤黄酸纳米结构脂质载体的研究

[目的]构建叶酸（FA）修饰的载新藤黄酸纳米结构脂质载体（FA-GNA-NLC）,提高新藤黄酸（GNA）的生物利用度,增强其在肿瘤部位的蓄积,降低全身毒副作用,并对该制剂进行理化表征和体内外药效学评价。[方法]通过乳化蒸发-低温固化法构建包载GNA的纳米结构脂质载体（GNA-NLC）,通过聚乙二醇（PEG）链将FA连接到NLC表面,对制剂的粒径、Zeta电位和外观形貌进行初步表征。以小鼠乳腺癌4T1细胞和人乳腺癌MDA-MB-231细胞为体外模型评价其对FA-NLC的摄取能力,以4T1细胞为体外细胞模型评价FA-GNA-NLC对肿瘤细胞的增殖抑制作用。构建乳腺癌小鼠模型,进行组织分布和体内抗肿瘤药效实验。[结果]制备得到形貌圆整、粒度均一、粒径为（16.01±0.03）nm、电位为（-6.8±0.59）mV、包封率为99%的FA-GNA-NLC。细胞毒性实验及体内抗肿瘤实验表明FA-GNA-NLC具有良好的抗肿瘤效果,细胞摄取实验及组织分布实验表明FA-NLC具有更好的靶向性,增强了药物在靶细胞、靶组织的蓄积。[结论]构建的FA-GNA-NLC增强了GNA的抗肿瘤活性,提高了GNA在肿...     

新型八核铜配合物乳剂的体内外抗肿瘤作用

目的探讨新型八核铜配合物乳剂(N-Cu)的体内、外抗肿瘤作用。方法采用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测不同浓度N-Cu对HT29、HeLa、SGC7901和EC9706肿瘤细胞增殖的影响。利用S180腹水瘤小鼠模型观察不同浓度N-Cu的体内抗肿瘤作用。采用流式细胞仪测定不同浓度N-Cu对S180细胞周期的影响。结果 N-Cu作用4种肿瘤细胞24h后,细胞增殖均受到了不同程度的抑制,且呈浓度依赖性。N-Cu对荷S180小鼠的肿瘤生长有明显的抑制作用。N-Cu能使G0/G1期细胞明显增多,S期细胞减少,细胞被阻滞于G0/G1期,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 N-Cu在体内、外具有抗肿瘤作用。     

双响应性透明质酸碳量子点-明胶纳米递药系统的构建及抗肿瘤效果评价

目的 通过构建pH和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)双响应性粒径可变纳米递药系统,协同提高化疗药物在肿瘤组织的高效滞留和高效穿透,增强肿瘤治疗效果.方法 构建了透明质酸(hyaluronic acid,HA)碳量子点(carbon quantum dots,CD)偶联明胶纳米粒...     

载胰岛素口服固体脂质纳米粒的构建及其跨肠上皮细胞转运的研究

目的 采用混合溶剂构建载多肽蛋白类药物的固体脂质纳米递药系统(solid lipid nanoparticles,SNPs),探究SNPs跨肠上皮细胞的转运机理,提高多肽蛋白类药物的细胞摄取和跨膜转运效率.方法 采用甲醇-氯仿混合溶剂制备载胰岛素的水包油包水型固体脂质纳米粒(INS-SNPs).通过单因素筛选法优化IN...     

壳聚糖修饰对细胞摄入和细胞毒性的影响

目的研究精氨酸或十六烷基修饰壳聚糖对其细胞摄入和细胞毒性的影响及作用机制。方法用α-32P-dATP标记质粒DNA,分别与十六烷基化壳聚糖和精氨酸修饰的壳聚糖通过复凝聚方法形成壳聚糖DNA纳米复合物。采用血管平滑肌A10细胞进行摄入测试,并用β液闪计数仪检测结果。用MTT方法对壳聚糖DNA纳米复合物的细胞毒性进行评价。结果经32P标记的DNA与不同修饰的壳聚糖复合所形成的纳米复合物粒径约为55·9~174·9nm,zeta电位约为1·8~10·8mV。细胞摄入实验显示通过精氨酸或十六烷基修饰的壳聚糖与DNA形成的纳米复合物更易于进入细胞。其中十六烷基化壳聚糖DNA纳米复合物(HCNC)在N/P为1∶1时细胞摄入量最高,精氨酸修饰的壳聚糖DNA纳米复合物(ACNC)细胞摄入次之,与未经修饰的壳聚糖DNA纳米复合物(UCNC)相比,差异具有显著性(HCNC、ACNC比UCNC高1·3倍,P<0·05)。细胞毒性实验显示,修饰后的壳聚糖纳米复合物的毒性远远小于商品化的细胞转染试剂Lipofectamine2000。结论两种修饰对壳聚糖DNA纳米复合物的血管平滑肌细胞摄入有明显促进作用,其作用机制各不相同;同时其细胞毒性远小于商品化的细胞转染试剂Lipofectamine2000。     

肝癌血清中miRNA-183的表达及临床意义

目的:比较肝癌及良性肝病患者血清中miRNA-183的表达并探讨其临床意义。方法:收集肝癌患者血清标本54例,肝硬化患者血清标本45例,肝炎患者血清标本30例及健康体检者血清标本45例,荧光定量PCR检测miRNA-183在各组中的表达量及分析肝癌组与临床病理特征之间的关系。结果:肝癌患者血清中miR-183表达量高于正常对照组,也高于肝炎组及肝硬化组（P <0.05）;肝硬化组血清miR-183表达量高于正常对照组（P <0.05）。肝癌患者的血清miR-183表达量与TNM分期有关,Ⅲ～Ⅳ期的表达水平高于Ⅰ～Ⅱ期（P <0.05）;低分化肝癌患者血清miR-183的表达水平高于高-中分化患者（P <0.05）;伴有肝硬化的肝癌患者其血清miR-183表达水平高于不伴肝硬化者（P <0.05）。ROC曲线下面积为0.699（95% CI 0.613～0.784）,最佳临界值为1.38,相应的敏感性为53.7%,特异性为83.3%,阳性预测值为60.1%,阴性预测值为76.9%。结论:血清miR-183可能作为诊断肝癌的新型肿瘤标志物,并可能预测肝癌预后。     

膝关节机械加载改善小鼠乳腺癌肺转移的实验研究

目的: 探讨脉冲式机械加载对小鼠乳腺癌肺转移的抑制作用。 方法:30只4～6周龄BALB/c雌性小鼠随机分为模型组 与治疗组 ,通过每只尾静脉注射鼠源性乳腺癌细胞（4T1）,建立小鼠乳腺癌肺转移模型。治疗组小鼠每天接受膝关节机械加载治疗,治疗18 d后处死。取肺脏,解剖显微镜下计数肺部转移瘤数目,TUNEL法分析肿瘤细胞凋亡情况,墨汁灌注肺脏切片观察转移灶周围血管生成情况,免疫组化分析细胞增殖和血管生成情况。结果:与模型组相比,治疗组肺部转移瘤数目明显减少（P<0.05）,TUNEL阳性细胞明显增多（P<0.01）,转移灶周围血管面积明显降低（P<0.05）。结论:机械加载能够有效地抑制小鼠乳腺癌肺转移,该抑制作用可能与机械加载能够促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成有关。?     

中西医结合治疗膀胱肿瘤的基础研究

目的：探讨转基因肿瘤疫苗与大蒜素联合治疗膀胱肿瘤的效果与机理.方法：脂质体转染法将B7.1基因导入鼠膀胱肿瘤（MBT-2）细胞.免疫荧光染色测定B7.1分子的表达.混合淋巴细胞培养MTT法和LDH释放法观察对免疫系统的影响.MTT法测定大蒜素对肿瘤细胞生长的影响.动物实验测定联合治疗效果.结果：B7.1转基因肿瘤疫苗能有效刺激淋巴细胞增殖.与大蒜素能产生协同抗癌效果.这种协同抗癌效果与淋巴细胞的特异性杀伤活性有关.结论：转基因肿瘤疫苗与大蒜素合用有更好的抗肿瘤效果.     

硫酸软骨素载药胶束靶向肿瘤细胞内高尔基体治疗肿瘤转移的初步研究

  目的  本研究旨在初步探究共载吡柔比星（pirarubicin, THP）与长春瑞宾（vinorelbine, VRL）的硫酸软骨素胶束（chondroitin sulfate-modified micelles, CSmicelles）的肿瘤细胞内高尔基体的靶向性及其体外抗肿瘤转移效果。  方法  采用流式细胞术考察小鼠乳腺癌细胞株4T1摄取CSmicelles情况及摄取机制;通过共定位实验对CSmicelles的高尔基体靶向性进行初步研究;采用GM130免疫荧光实验考察共载THP与VRL的CSmicelles（THP+VTL-CSmicelles）对高尔基体结构的影响;最后通过细胞划痕实验和Transwell迁移/侵袭实验对THP+VTL-CSmicelles的体外抗肿瘤转移效果进行初步评价。  结果  CSmicelles能显著增加药物的入胞能力,其细胞摄取途径为网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞,为能量依赖性的主动转运,并具有良好的肿瘤细胞内高尔基体靶向性。THP+VTL-CSmicelles能破坏高尔基体结构,显著抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。  结论  THP+VTL-CSmicelles具有肿瘤细胞高尔基体靶向性,可发挥靶向效应,抑制肿瘤细胞转移。