诱导型一氧化氮合酶基因转染对人舌癌细胞体内致瘤力的影响

目的研究外源性基因诱导型一氧化氮合酶(iNOS)转染人舌癌细胞系Tca8113后,对肿瘤细胞生物学特性以及裸鼠体内致瘤力的影响。方法采用脂质体转染法将真核表达载体pCMV-iNOS/Tca转染入舌癌细胞系Tca8113,得到高表达iNOS的细胞系pCMV-iNOS/Tca,转染空白质粒的细胞系pCMV-Tca,并以Western blot方法鉴定转染效果。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色绘制生长曲线;流式细胞仪检测细胞周期分布;通过裸鼠成瘤实验,比较转染前后体内成瘤能力的差别。结果与未转染组和转染空白载体组比较,pCMV-iNOS/Tca组的细胞生长速度比Tca组快(P>0.05),细胞周期中G2/M和S期比例增加(P<0.05)。体内成瘤能力试验结果显示,pCMV-Tca、pCMV-iNOS/Tca组和Tca组平均瘤重分别为(1.1±0.24)g、(2.5±0.48)g和(1.3±0.32)g,pCMV-iNOS/Tca组的成瘤力高于pCMV-Tca和Tca组(P<0.01)。结论转染iNOS基因后,Tca8113细胞具有更强的体外增殖能力和体内致瘤能力。     

VEGFsiRNA对人舌癌Tca8113细胞移植瘤血管生成影响的研究

目的:观察小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达对裸鼠皮下人舌癌Tca8113细胞移植瘤血管生成的影响.方法:构建人舌癌Tca8113细胞20只裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为4组.将两对针对VEGF的siRNA真核表达载体(Pu-VEGF-siRNA1,Pu-VEGF-siRNA2)脂质体法作瘤体内及瘤周注射;以注射空质粒组作实验对照组;未注射组作空白对照组.注射1次/3 d×10次,末次注射3d后,剥离瘤体,RT-PCR检测瘤组织VEGF-mRNA表达,免疫印迹技术检测瘤组织VEGF蛋白表达.免疫组化染色法观察VEGF阳性染色及微血管参数.结果:Pu-VEGF-siRNA2组移植瘤VEGF-mRNA表达及VEGF蛋白表达、总体微血管密度、有腔微血管密度、有腔血管平均血管周长及管腔面积均较空质粒组及空白对照组低(p＜0.05).而Pu-VEGF-siRNA1组未观察到上述差别(P＞0.05).结论:siRNA能在体内抑制舌癌VEGF表达,有效减少肿瘤血管生成.不同的干扰片段体内作用效果存在差异.     

反义微小RNA-21寡核苷酸抑制Tb3.1人舌鳞状细胞癌增殖的体外研究

目的 探讨反义微小RNA-21寡核苷酸(antisense oligonucleotide micro RNA-21,AS-miRNA-21)抑制Tb3.1人舌鳞状细胞癌增殖的效果和机制.方法 实验分3组,①空白对照组;②无义寡核苷酸转染组;③AS-miRNA-21转染组.寡核苷酸介导转染反义寡核苷酸敲低Tb3.1细胞miRNA-21表达.使用荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)鉴定转染后Tb 3.1细胞miRNA-21表达水平;甲基噻唑基四唑(MTT)法检测转染后Tb 3.1细胞生存率;流式细胞术检测转染后Tb3.1早期凋亡;Matrigel基质生长实验检测转染后Tb 3.1细胞生长形成球形集落能力;Transwell体外迁移实验检测转染后Tb 3.1细胞迁移能力;蛋白质印迹法检测转染后Tb3.1细胞增殖核抗原(antigen KI-.67,Ki67)、B细胞淋巴瘤2(B cell lymphoma 2,Bcl-2)、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog,PTEN)、基质金属蛋白酶2、9(matrix metalloproteinase 2/9,MMP-2、MMP-9)和组织基质蛋白酶抑制因子蛋白1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP-1)蛋白表达.结果 荧光实时定量PCR显示转染后miRNA-21表达水平下调;转染第4天,AS-miRNA-21转染组肿瘤细胞生长速度[(53.43±11.83)%]低于其他两组[(91.32±8.02)%和100%](F=27.02,P=0.00);细胞凋亡率显著升高[(12.23±2.92)%,F=26.641,P=0.001];AS-miRNA-21转染组细胞生长不能形成球形克隆且通过Transwell小室聚碳酸酯膜的细胞数小于空白对照组(F=268.231,P=0.000);Ki67、Bcl-2、MMP-2和MMP-9蛋白表达下调,PTEN和TIMP-1蛋白表达上调.结论 敲低miRNA-21后Tb3.1人舌癌细胞增殖与侵袭能力被抑制,并为探索miRNA-21调控人舌癌发生机制提供实验依据.

Abstract：

Objective To investigate the effect of micro RNA-21 (miRNA-21) knocking on the Tb3.1 human tongue squamous cell carcinoma growth. Methods Anti-sense miRNA-21 oligonucleotide was delivered with oligofectamine to suppress Tb 3. 1 tongue cancer cell growth in vitro. Real-time polymerase chain reaction (PCR) was conducted to detect the miRNA-21 expression after transfection. Methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) assay was used to determine Tb 3. 1 cell survival rate. Apoptosis were examined by flowcytometry. Matrigel matrix and transwell assay were used to determine Tb 3.1 cell colony formation and migration ability. Antigen KI-67 (Ki67), B cell lymphoma (Bcl-2), phosphatase and tensin homolog (PTEN), matrirx metalloproteinase 2(MMP-2, MMP-9) and tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1) protein expression in Tb 3. 1 cell were measured by Western blotting. Results miRNA-21 expression was decreased in miRNA-21 antisense oligonucleotide (ASODN) group. The survival rate of Tb 3. 1 cells with AS-miRNA-21 transfection was significantly suppressed (F=27.02, P = 0.00) and early phase apoptosis(F =26. 641 ,P = 0. 001) induced in Tb 3.1 cell. Ki67, Bcl-2, MMP-2 and MMP-9 protein weredown regulated while PTEN and TIMP-1 protein expression was increased. Conclusions Blocking miRNA-21 expression in Tb3.1 cell could suppress cancer cell growth in vitro and miRNA-21 can serve as a novel target candidate for human tongue cancer gene therapy.     

siRNA抑制人舌癌细胞VEGF表达对MMP-2、-9及TIMP-1、-2蛋白表达的影响

【摘要】目的利用小干扰RNA （ small interfering RNA ,siRNA） 抑制人舌癌TcaSll3细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF ）表达,观察其对培养细胞和移植瘤基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs ）2、-9及基质金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitors of metalloproteinases ,T IMPs）-1、-2蛋白表达的影响。方法以稳定转染携带VEGF．siRNA真核表达载体的Tca8113细胞（VEGF—siRNAl、VEGF—siRNA2）为实验组,以转染空载体的及未转染的Tca8113细胞为实验对照组和空白对照组。将细胞分别接种于裸鼠皮下,用免疫组化法分别测定各组培养细胞和移植瘤VEGF、MMP-2、-9及TIMP．1、-2的蛋白表达。结果各组培养细胞及移植瘤VEGF免疫组化染色：VEGF．siRNAl组、VEGF—siRNA2组与实验和空白对照组相比,平均阳性率降低,平均灰度值增高（P〈0．05）;各组培养细胞均未检测出MMP-2、-9及TIMP-1、-2蛋白的阳性表达。各组移植瘤MMP-9、TIMP-1、-2可见阳性表达,但各组染色平均阳性率及平均灰度值之间的差异无统计学意义（P〉0．05）,而MMP-2未见明显阳性表达。结论以siRNA干扰沉默人舌癌Tca8113细胞VEGF基因,可明显抑制细胞及移植瘤内VEGF蛋白表达,但是对MMP-2、-9及TIMP-1、-2蛋白的表达无明显影响。     

神经钙黏素表达下调对舌鳞状细胞癌细胞生物学能力的影响

目的 研究神经钙黏素(N-cadherin)表达下调对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖、细胞周期、凋亡以及迁移的影响,并探讨其可能的分子机制.方法 利用LipofectamineTM2000将神经钙黏素siRNA转染舌鳞状细胞癌Tca8113细胞,将细胞分为3组:①未处理组;②对照siRNA组;③神经钙黏素siRNA组.分别收集转染后48 h的细胞,采用新型的细胞计数试剂盒(cell counting kit,CCK)8试剂分析转染神经钙黏素siRNA后对细胞增殖能力的影响;运用流式细胞术检测下调神经钙黏素表达对Tca8113细胞周期及细胞凋亡的影响;采用Boyden 小室实验分析下调神经钙黏素对舌鳞状细胞癌细胞Tca8113细胞迁移能力的影响;进一步采用蛋白质印迹法检测神经钙黏素表达下调对细胞增殖、细胞周期以及细胞迁移相关基因表达的影响.结果 神经钙黏素siRNA能明显下调舌鳞状细胞癌Tca8113细胞中神经钙黏素蛋白的表达,并显著抑制Tca8113细胞的增殖(P<0.05).细胞周期结果显示,神经钙黏素siRNA组中在G0/G1的细胞比率[(65.41±0.92)%]明显高于未处理组[(41.59±1.43)%]和对照siRNA组[(43.70±2.08)%],差异有统计学意义(F=216.839,P＝0.000).神经钙黏素siRNA组中细胞凋亡的比率[(25.66±1.36)%]明显高于未处理组[(2.38±0.14)%]和对照siRNA组[(2.81±0.12)%],差异有统计学意义(F=850.364,P=0.000).Boyden 小室体外侵袭实验结果表明,与未处理组和对照siRNA组相比,神经钙黏素siRNA组中Tca8113细胞的迁移能力显著下降,差异有统计学意义(F=140.858,P=0.000).蛋白质印迹法结果表明,与未处理组和对照siRNA组相比,神经钙黏素siRNA组中的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)2和MMP-9明显下调,而p21明显上调,且差异有统计学意义(P<0.05).结论 神经钙黏素在舌鳞状细胞癌的发生发展中可能具有重要的作用.

Abstract：

Objective To investigate the effect of downregulation of N-cadherin expression on cell proliferation, cell cycle, cell apoptosis and cell migration in tongue squamous cell carcinoma cell line Tca8113 cells. Methods N-cadherin siRNA was transfected into tongue squamous cell carcinoma cell line Tca8113 cells and Tca8113 cells were divided into three groups: untreated group, control siRNA group and N-cadherin siRNA group. The cells were harvested 48 h after transfection with N-cadherin siRNA. Cell proliferation of Tca8113 cells was examined by cell counting kit(CCK)-8 after transfection with N-cadherin, and the effects of downregulation of N-cadherin on cell cycle and cell apoptosis of Tca8113 cells were investigated by flow cytometry.The effect of downregulation of N-cadherin expression on cell migration of Tca8113 cells was observed by Boyden chamber experiment, and further expression changes of gene-related cell proliferation, cell cycle and cell migration were detected by Western blotting. Results N-cadherin siRNA downregulated the N-cadherin expression and significantly inhibited cell proliferation of Tca8113 cells (P<0.05). The results of cell cycle revealed that the percentage of G0/G1 phase in N-cadherin group [(65.41±0.92) %] was significantly higher than that in untreated group [(41.59±1.43)%] or control siRNA group [(43.70±2.08)%], and there was significant difference among the three groups (F=216.839,P＝0.000).The percentage of cell apoptosis in N-cadherin group [(25.66±1.36)%] was significantly higher than that in untreated group [(2.38±0.14)%] or control siRNA group [(2.81±0.12)%], and there was significant difference among the three groups (F=850.364,P=0.000). The cell number migrated into memebrane in N-cadherin group was significantly lower than that in untreated group and control siRNA group, and there was significant difference among the three groups (F=140.858,P=0.000). Further, compared with untreated group and control siRNA group, the expressions of matrix metalloproteinase(MMP)-2 and MMP-9 proteins were significantly downregulated and expression of p21 protein was significantly upregulated (P<0.05). Conclusions N-cadherin may play a role in occurrence and development of tongue squamous cell carcinoma.     

加热联合黄体酮对人舌癌耐药细胞株Tca8113/BLM耐药性的影响

目的:研究加热(hyperthermia, HT)联合黄体酮(progresterone, Prog)对人舌癌细胞Tca8113和耐药细胞Tca8113/BLM耐药性的影响.方法:采用MTT法检测加热41 ℃ 1 h后联合Prog对人舌癌亲本细胞Tca8113和耐药细胞Tca8113/BLM化疗药物的敏感性;流式细胞仪(FCM)检测细胞内阿霉素(ADM)浓度聚积以及细胞膜上P-gp和MRP的表达.结果:与黄体酮作用细胞相比,加热41 ℃ 1 h联合2 μmol/L Prog作用细胞后,Tca8113和Tca8113/BLM细胞的IC_50显著下降(P<0.01),且各组之间均有显著差异(P<0.01),ADM浓度聚积在2 种细胞中明显增加(P<0.01),细胞膜上的P-gp 和MPR荧光强度显著下降(P<0.01).结论:加热联合Prog能协同增加细胞内药物浓度的聚积,显著提高细胞对化疗药物BLM的敏感性,其二者协同作用与降低细胞膜上的P-gp和MRP的表达有关.     

HSV-TK/GCV联合IL-2治疗舌癌移植瘤的机制探讨

目的:观察HSV-TK联合IL-2对舌癌细胞的生长抑制作用,并探讨HSV-TK与IL-2联合应用对舌癌抑制和杀伤的机制.方法:建立舌癌Tca8113移植瘤动物模型,采用HSV-TK联合IL-2对移植瘤进行体内转染,观察肿瘤生长情况.使用RT-PCR检测HSV-TK基因和IL-2基因的表达情况;应用流式细胞仪检测移植瘤的凋亡情况;采用免疫组化法检测移植瘤中CD4和CD8蛋白的表达情况.结果:移植瘤体积生长曲线表明TK组(C组)及TK联合IL-2 组(D组)肿瘤的生长明显受到抑制.TK组抑瘤率为40.1%,TK联合IL-2组抑瘤率为80.2%.RT-PCR检测目的基因HSV-TK基因和IL-2基因已整合入肿瘤细胞中且稳定表达.流式细胞仪检测A组(对照组)和B组(病毒组)凋亡峰不明显,而C组和D组凋亡峰明显.对照组、病毒组、TK组、TK联合IL-2组凋亡率分别为(6.77±1.31)、(7.08±1.28)、(13.22±3.28)、(28.90±6.50).除对照组、病毒组无明显差异(P＞0.05),其他任2 组之间比较均有显著性差异(P＜0.01).在TK联合IL-2组,肿瘤细胞周围有大量CD4和CD8阳性的淋巴细胞浸润.结论:HSV-TK和IL-2治疗后可显著抑制Tca8113移植瘤的生长.HSV-TK与IL-2基因联合应用,其治疗效果较单独应用HSV-TK明显提高.HSV-TK可明显杀伤Tca8113移植瘤细胞,而IL-2可以诱导机体抗肿瘤免疫反应.     

人内皮抑素基因转染对舌鳞癌Tca8113细胞生长的影响

目的 探讨人内皮抑素(hES)基因导入舌鳞癌Tca8113细胞后的表达情况及其抑制肿瘤生长效应。方法 以脂质体为载体将hES基因导入Tca8113细胞,通过动物实验观察转基因Tca8113细胞移植瘤生长情况,免疫组织化学检测肿瘤组织中hES及血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达,Weidner法行肿瘤微血管密度(MVD)计数,流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率。结果 移植瘤生长第27天,实验组肿瘤组织中hES的表达率高于对照组(P<0.01);VEGF的表达率低于对照组(P<0.01)。实验组MVD计数低于对照组(P<0.01),而肿瘤细胞凋亡率则明显高于对照组(P<0.01)。hES基因转染对肿瘤生长的抑制率78.9％。结论 hES基因转染舌鳞癌细胞可体内诱导hES蛋白高效表达并具有抑制移植瘤生长的效应。     

血管内皮生长因子小干扰RNA抑制人舌鳞状细胞癌细胞移植瘤生长及血管生成的实验

目的 观察小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达对人舌癌Tca8113细胞移植瘤的治疗作用.方法 构建Tea8113细胞裸鼠皮下移植瘤模型,随机分成4组,A组、B组为实验组,C组:以空载体注射为治疗对照组,D组:未治疗为空白对照组,每组5只.脂质体法将两对VEGF siRNA真核表达载体(PU-VEGF-siRNAl、PU-VEGF-siRNA2)作瘤体内及瘤周注射,1次/3 d,共10次后处死裸鼠;测量瘤体积及瘤重;反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blotting和免疫组化法分别检测瘤组织VEGF-mRNA及VEGF蛋白表达,并检测瘤内微血管密度;流式细胞仪检测肿瘤细胞悬液的细胞周期比例,Tunel法检测组织细胞凋亡.结果 B组瘤体积(0.402±0.158)cm3、瘤重量(2.12±0.58)g,均低于C、D组,细胞G1期比例为(40.26±1.42)%,较C、D组增加,B组瘤组织VEGF mRNA(0.752±0.048)和蛋白表达(1.12±0.15),组织切片VEGF阳性细胞表达率(12.56±1.30)%、平均灰度值(164.2±15.42)及微血管密度(3.50±1.58)个,均低于C、D组(P<0.05),凋亡细胞增加(P<0.01).结论 siRNA能在体内抑制舌癌VEGF表达,减少肿瘤血管生成,延缓肿瘤生长.不同的干扰片段体内作用效果存在差异.     

沉默RohA基因对舌鳞状细胞癌细胞增殖的影响

目的 通过RNA干扰技术沉默RhoA基因从而探讨RhoA对舌癌细胞增殖和生长的影响及其作用机制。方法体外培养舌鳞状细胞癌SCC-4细胞,以小分子干扰RNA转染沉默RhoA基因的表达。实验分为3组：实验组（又分为实验1组和实验2组,脂质体分别转染对应序列1的RhoA-siRNA和序列2的RhoA-siRNA）、阴性对照组（脂质体转染NC-siRNA）和空白对照组（不转染siRNA）。采用实时定量聚合酶链反应技术检测SCC-4细胞转染后RhoA mRNA的表达,Western blot检测RhoA、Cyclin D1、p21和p27蛋白的表达,四唑盐比色法检测舌癌细胞生长水平和倍增时间。结果 与阴性对照组和空白对照组相比,实验组舌癌细胞的RhoA基因及蛋白表达降低,p21、p27蛋白表达升高,Cyclin D1蛋白表达降低,细胞倍增时间延长,增殖能力降低（P<0.05）。结论 沉默RhoA基因可以抑制舌癌细胞的增殖和生长,RhoA基因通过调控细胞周期信号转导途径影响舌癌细胞的增殖,RhoA基因可以成为舌癌基因治疗的靶点。     

RNA干扰双泛素对舌鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响

目的 应用RNA干扰技术抑制人舌鳞状细胞癌细胞株Tca8113中双泛素(diubiquitin)的表达,探讨双泛素表达下调对舌鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响.方法 构建针对双泛素特异性小干扰RNA( small interfering RNA,siRNA)真核表达载体pU-双泛素-siRNA,将其转染至Tca8113细胞,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹法检测转染后的Tca8113细胞中双泛素的表达.通过流式细胞仪分析siRNA对舌鳞状细胞癌细胞周期的影响,并通过细胞侵袭能力实验观察siRNA对Tca8113细胞恶性生物学行为的变化.结果 siRNA干扰Tca8113细胞后,双泛素的表达无论是在mRNA水平还是在蛋白质水平均显著下降[mRNA:实验组(0.36±0.03)、空白对照组(0.92±0.07)、空载体组(0.95±0.05);蛋白:实验组(0.39±0.04)、空白对照组(0.64±0.05)、空载体组(0.69±0.05)](P＜0.05),细胞周期被阻滞在G1期,细胞生长缓慢,体外侵袭能力下降(P＜0.05).结论 通过RNAi技术阻断双泛素的表达,可抑制Tca8113细胞的生长、增殖、侵袭,提示双泛素在舌鳞状细胞癌的发生、发展过程中起重要作用.     

核因子-κB/p65 siRNA介导的舌鳞状细胞癌Tca8113细胞凋亡及相关分子机制

目的：研究下调核因子κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）/p65基因的表达对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞凋亡的影响,并探讨Tca8113细胞凋亡可能的分子机制。方法：利用脂质体2000将终浓度为100nmol/L的p65 siRNA转染舌鳞状细胞癌Tca8113细胞,通过RT-PCR检测0、24、48和72hp65 mRNA的表达,并通过流式细胞术检测转染前后细胞凋亡变化,通过Caspase-Glo○R-3/7,-8和-9检测试剂盒分析caspase-3/9活性,用Western blotting技术检测p65、bcl-2和bax蛋白表达。结果：Tca8113细胞转染p65siRNA后,在48hp65 mRNA的相对表达量为0.181±0.028,显著低于未处理组0.595±0.038和对照siRNA组0.613±0.067（P〈0.05）。流式细胞术结果显示,p65 siRNA能促使Tca8113细胞凋亡,其早期凋亡比率为（23.16±1.72）%,显著高于未处理组和对照siRNA组（P〈0.01）。转染48h后,p65和bcl-2蛋白的相对表达水平明显下调,而促凋亡蛋白bax的表达显著上升,并伴随着caspase-3/9活性的显著上升。结论：NF-κB信号途径中的p65亚基可能在舌鳞状细胞癌凋亡中发挥重要作用,该研究有望为舌鳞状细胞癌的分子靶向治疗提供理论依据。     

体外沉默二牛龙牛儿基转移酶Ⅰ对舌癌细胞迁移和侵袭的影响

目的 应用RNA干扰技术,体外沉默二牛龙牛儿基转移酶Ⅰ(GGTase-Ⅰ),研究其在舌癌迁移、侵袭中的作用.方法 登录Genebank确定人GGTase-Ⅰ基因序列,针对GGTase-Ⅰ的基因序列设计并构建3条siRNA,分别将RNA干扰组(GGTase-ⅠsiRNA1、GGTase-ⅠsiRNA2、GGTase-ⅠsiRNA3)、阴性对照组(NC-siRNA)和空白对照组转染至舌癌细胞Cal-27,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测各组细胞转染后GGTase-Ⅰ、RhoA基因的mRNA、蛋白表达;选取沉默效率最高的一组siRNA作为实验组,蛋白质印迹法检测各组细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9的表达,GST-pull down实验检测GTP-RhoA蛋白的表达,划痕实验检测细胞迁移能力变化,Transwell小室检测细胞侵袭能力变化.结果干扰后细胞的GGTase-ⅠmRNA、蛋白表达明显下降(P<0.05),RhoA mRNA和蛋白表达无明显改变,MMP-2、MMP-9、GTP-RhoA的表达下降,迁移、侵袭能力明显下降(P<0.05).结论 抑制GGTase-Ⅰ表达,可降低舌癌细胞的迁移、侵袭能力,对GGTase-Ⅰ的深入研究可能为舌癌的治疗提供新的有效分子靶点.     

载体携带小干扰RNA抑制Tca8113细胞血管内皮生长因子的表达

目的了解小干扰RNA（siRNA）对人舌癌细胞株Tca8113血管内皮生长因子（VEGF）表达的抑制作用。方法构建2对针对血管内皮生长因子的siRNA真核表达载体（Pu-VEGF-siRNA1，Pu-VEGF-siRNA2），经脂质体Lipofectamine2000转染Tca8113细胞，以空载体组作实验对照组，未转染组作空白对照组。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫组化、酶联免疫吸附（ELISA）方法分别检测转染后的Tca8113细胞VEGF mRNA及蛋白表达。结果与实验对照组和空白对照相比较，转染Pu-VEGF-siRNA1和Pu-VEGF-siRNA2后Tca8113细胞的VEGF mRNA 和蛋白表达明显下降。结论通过RNA干扰技术能有效抑制舌癌Tca8113细胞VEGF mRNA和蛋白的表达。     

体外沉默法尼基转移酶对舌鳞状细胞癌迁移和侵袭的影响

目的 通过RNA干扰沉默法尼基转移酶（FTase）,探讨沉默FTase对舌鳞状细胞癌迁移和侵袭的影响及其相关机制。方法 针对FTase设计并构建3条小干扰RNA（siRNA）,转染人舌鳞状细胞癌CAL27和SCC-4细胞（实验组）,同时设置阴性对照组（转染NC-siRNA）和空白对照组（不转染siRNA）。应用实时荧光定量PCR检测各组细胞FTase、HRAS的mRNA表达,根据FTase mRNA的表达量,选取沉默效率最高的FTase-siRNA转染组作为进一步研究的实验组。蛋白质免疫印迹法检测各组细胞FTase、HRAS、p65、p-p65(S536)、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、低氧诱导因子1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）的蛋白表达,Transwell侵袭实验和细胞划痕实验检测各组细胞的侵袭和迁移能力。结果 与阴性对照组和空白对照组相比,实验组FTase的mRNA和蛋白表达下降（P<0.05）,HRAS的mRNA和蛋白表达无明显变化（P>0.05）,p-p65(S536)、MMP-9、HIF-1α、VEGF蛋白表达下降（P<0.05）,p65蛋白表达无明显变化（P>0.05）;实验组的细胞侵袭和迁移能力降低（P<0.05）。结论 体外沉默舌鳞状细胞癌细胞FTase,可以抑制细胞体外迁移和侵袭能力,为FTase可能作为舌癌治疗的分子靶点提供了一定的理论和实验依据。     

短发卡RNA介导的表皮生长因子受体基因沉默对舌鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡的影响

目的 研究短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)介导的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因沉默对舌鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响,为治疗舌鳞状细胞癌提供依据.方法 构建靶向人EGFR的shRNA真核表达载体并瞬时转染人舌鳞状细胞癌细胞株Tca8113细胞,用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法检测转染前后EGFR的mRNA和蛋白的变化,用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测细胞增殖活性,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 转染后Tca8113细胞的EGFR mRNA和蛋白的表达(0.217±0.047)和(0.324±0.059)均明显下调(P＜0.05),细胞增殖活性(0.340±0.009)明显降低(P＜0.05),细胞凋亡率(39.4±7.7)%显著增高(P＜0.05).结论 shRNA介导的EGFR基因沉默可抑制舌鳞状细胞癌细胞增殖并诱导其凋亡.     

体外沉默二牛龙牛儿基转移酶Ⅰ对舌癌细胞迁移和侵袭的影响

目的 应用RNA干扰技术,体外沉默二牛龙牛儿基转移酶Ⅰ（GGTase-Ⅰ）,研究其在舌癌迁移、侵袭中的作用。方法 登录Genebank确定人GGTase-Ⅰ基因序列,针对GGTase-Ⅰ的基因序列设计并构建3条siRNA,分别将RNA干扰组（GGTase-Ⅰ siRNA1、GGTase-ⅠsiRNA2、GGTase-Ⅰ siRNA3）、阴性对照组（NC-siRNA）和空白对照组转染至舌癌细胞Cal-27,实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测各组细胞转染后GGTase-Ⅰ、RhoA基因的mRNA、蛋白表达;选取沉默效率最高的一组siRNA作为实验组,蛋白质印迹法检测各组细胞基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9的表达,GST-pull down实验检测GTP-RhoA蛋白的表达,划痕实验检测细胞迁移能力变化,Transwell小室检测细胞侵袭能力变化。结果 干扰后细胞的GGTase-Ⅰ mRNA、蛋白表达明显下降（P<0.05）,RhoA mRNA和蛋白表达无明显改变,MMP-2、MMP-9、GTP-RhoA的表达下降,迁移、侵袭能力明显下降（P<0.05）。结论 抑制GGTase-Ⅰ表达,可降低舌癌细胞的迁移、侵袭能力,对GGTase-Ⅰ的深入研究可能为舌癌的治疗提供新的有效分子靶点。