Rac1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

背景:Rac1是通过信号转导来调节癌细胞的侵袭、增殖,它在各种肿瘤中都有表达。目的:构建RAC1基因RNA干扰慢病毒载体,并检测其干扰效率。方法:应用Western blot检测Rac1基因在舌癌细胞中的表达。针对筛选确定的Rac1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI双酶切后的pMagic4.1载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定后将质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,采用Real-TimePCR筛靶,将筛靶成功的质粒进行慢病毒包装,再感染Tca8113细胞。荧光定量PCR和Western blot检测鉴定Rac1基因表达的干扰效果以确定其生物活性。结果与结论:成功构建了RAC1干扰载体,Western blot检测显著抑制Rac1蛋白表达,经Real-time PCR检测pLVT447的抑制率达70%。成功的构建了Rac1基因RNAi慢病毒载体,为RNAi用于靶向Rac1的基因治疗舌癌(Tca8113)提供了有效的siRNA靶序列。     

Nesprin基因RNAi慢病毒载体的构建

背景：Nesprin蛋白缺失将影响细胞骨架组织和动态平衡,引起细胞骨架刚性丧失或导致细胞过早成熟老化,其对间充质干细胞的作用如何？目的：构建Nesprin蛋白siRNA慢病毒载体,并转染骨髓间充质干细胞.方法：针对Nesprin靶基因序列设计并合成4对miRNA oligo,将4种miRNA干扰质粒转入大鼠血管平滑肌细胞,筛选最有效干扰序列;将最佳干扰序列和pDONR221载体进行重组反应,获得含干扰序列的入门载体,再将入门载体和慢病毒表达目的载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应,获得含干扰序列的慢病毒表达载体,转染包装细胞293T细胞,包装慢病毒,以293T细胞GFP蛋白水平测定病毒滴度.慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞.结果与结论：测序证实合成的4对miRNA oligo正确,RT-PCR和western-blot筛选出最佳干扰miRNA质粒为SR-3,成功构建了Nesprin siRNA的慢病毒载体LV-siNesprin.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的活性滴度为106 TU/mL.慢病毒成功了转染骨髓间充质干细胞细胞.     

Nesprin基因RNAi慢病毒载体的构建

背景:Nesprin蛋白缺失将影响细胞骨架组织和动态平衡,引起细胞骨架刚性丧失或导致细胞过早成熟老化,其对间充质干细胞的作用如何?目的:构建Nesprin蛋白siRNA慢病毒载体,并转染骨髓间充质干细胞.方法:针对Nesprin靶基因序列设计并合成4对miRNA oligo,将4种miRNA干扰质粒转入大鼠血管平滑肌细胞,筛选最有效干扰序列;将最佳干扰序列和pDONR221载体进行重组反应,获得含干扰序列的入门载体,再将入门载体和慢病毒表达目的载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应,获得含干扰序列的慢病毒表达载体,转染包装细胞293T细胞,包装慢病毒,以293T细胞GFP蛋白水平测定病毒滴度.慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞.结果与结论:测序证实合成的4对miRNA oligo正确,RT-PCR和western-blot筛选出最佳干扰miRNA质粒为SR-3,成功构建了Nesprin siRNA的慢病毒载体LV-siNesprin.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的活性滴度为106 TU/mL.慢病毒成功了转染骨髓间充质干细胞细胞.     

人GLIPR-2基因慢病毒RNAi载体的构建及鉴定

目的 构建人GLIPR-2基因慢病毒RNA干扰（RNAi）载体,并鉴定其感染人肝癌细胞系HepG2后缺氧条件下的GLIPR-2基因表达变化.方法 根据GLIPR-2基因序列合成siRNA片段,克隆至慢病毒载体pMAGic7.1上,转染293T细胞进行包装,收获并浓缩重组慢病毒颗粒.感染HepG2细胞,流式细胞术检测GFP的表达率,并用Western blot检测目的 蛋白在缺氧条件下的表达变化.结果 重组RNAi质粒pMAGic7.1-shRNA-GLIPR-2经菌落PCR鉴定及测序证实构建正确;稳定感染HepG2 细胞后,GFP的表达率为分别为84.48%、69.97% 和39.82%;Western blot结果显示慢病毒转染组GLIPR-2蛋白的表达水平较对照组明显降低.结论成功构建了GLIPR-2基因慢病毒RNAi载体,该载体在缺氧条件下可明显抑制目的 蛋白在HepG2细胞中表达,为进一步研究GLIPR-2的生物学功能奠定了基础.     

Kir2ds4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

本研究旨在构建kir2ds4基因RNAi慢病毒载体。针对已经筛选确定的kff2ds4基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，退火形成双链DNA，与经HpaI和XhoI酶切后的pSicoR-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白（GFP）]连接产生LV-shkir2ds4慢病毒载体，应用PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。用LV-shkir2ds4，包装系统质粒共转染包装细胞293T细胞，产生慢病毒颗粒，以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果表明，PCR和测序结果证实成功地构建了kir2ds4shRNA的慢病毒载体LV-shkir2ds4。293T细胞测定病毒滴度为6×10^8TU／ml。结论：成功地构建了人kff2ds4基因RNAi慢病喜载体．     

大鼠CRBP-1基因shRNA慢病毒载体的构建与测序

[目的]构建测序大鼠视黄醇结合蛋白-1(CRBP-1)基因短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体.[方法]针对已经筛选确定的大鼠CRBP-1基因RNA干扰(RNAi)有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa Ⅰ和Xho Ⅰ酶切后的pGCL-GFP载体连接产生shRNA慢病毒裁体,命名为Lv-shCRBP-1,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.[结果]PCR鉴定与DNA测序证实合成的Lv-shCRBP-1寡核苷酸链插入正确.[结论]成功构建大鼠CRBP-1基因shRNA慢病毒载体.     

增殖诱导配体基因短发夹RNA慢病毒表达载体的构建

目的 构建针对人的增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)基因的短发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒表达载体,并在感染293T细胞后检测病毒滴度及适合的感染复数(multiplicity of infection,MOI)值.方法 以人APRIL基因为靶点,筛选出3条shRNA靶序列:shAPRIL1210、shAPRIL1754、shAPRIL1604;各自合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA后分别与经酶切的pGEL-GFP载体连接,构建3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604;将连接产物分别转化到DH5α感受态细胞,经PCR及DNA测序鉴定.再用LV-shAPRIL与包装质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白的表达水平确定病毒滴度及适合的MOI值.结果 PCR和测序结果与构建的3个慢病毒载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604的预期结果一致,经包装产生的慢病毒滴度分别为5×107、6×107、4×107转导单位(TU)/ml;适合高效感染的MOI值为5.结论 成功构建人APRIL基因3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL,为后继的在相关靶细胞中诱导特异性的APRIL基因沉默奠定基础.     

PC4基因RNAi慢病毒载体的构建及有效靶序列鉴定

目的：筛选慢病毒介导PC4 RNA干扰的有效靶序列。方法：通过数据库设计3条PC4干扰候选靶序列,将靶序列构建到慢病毒载体中,转入HEK-293T细胞后,感染H9C2心肌细胞。通过实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法鉴定靶序列干扰PC4的效果。结果：成功构建shPC4慢病毒载体,获得高效感染心肌细胞的慢病毒;感染心肌细胞后实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹显示,shPC4-1具有较高的干扰效果（P<0.05）。结论：成功筛选出高效的PC4 RNAi靶序列。     

靶向Egr-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建靶向人早期生长反应因子(early growth response-1,Egr-1)基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体。方法针对Egr-1基因设计并合成1条Egr-1过表达序列和4条干扰序列,过表达序列与双酶切Ubi-MCS-3FLAG载体连接,干扰序列与双酶切hU6-MCS-CMV-EGFP连接,DNA测序鉴定重组载体。共转染人脐静脉血管内皮细胞后(OE-RNAi-1,OE-RNAi-2,OE-RNAi-3,OE-RNAi-4)Western blot检测Egr-1蛋白表达,筛选有效干扰靶点,实时定量荧光PCR检测Egr-1mRNA,验证干扰效果。结果测序表明Egr-1过表达及RNAi慢病毒载体构建成功;Western blot结果显示,OE-RNAi-4组Egr-1蛋白表达抑制率最高(P<0.05);实时荧光定量PCR验证结果显示,OE-RNAi-4组Egr-1mRNA表达受到明显抑制(P<0.05)。结论本研究成功构建了靶向Egr-1基因RNAi慢病毒载体,为进一步研究Egr-1在静脉桥血管再狭窄中早期内皮功能失调作用机制及基因治疗提供了实验依据。     

PTEN基因重组慢病毒的构建

目的:构建PTEN基因重组慢病毒,转染真核细胞Ishikawa并检测PTEN基因在真核细胞内的表达.方法:分子克隆重组人PTEN基因与含有CMV启动子和绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体PLIG,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.将重组子PLIG-PTEN和包装质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,感染子宫内膜癌细胞株Ishikawa,观察慢病毒表达载体所携带的GFP基因在细胞内的表达,使用RT-PCR和western-blot检测PIEN基因在细胞内的表达水平.结果:PCR和测序证实,成功克隆慢病毒载体PLIG-PTEN,包装慢病毒,感染真核细胞Ishikawa后48 h,观察到绿色荧光的广泛表述并检测出宿主细胞内表达的PTENmRNA成功表达PTEN蛋白.结论:本实验成功地构建了人PTEN基因慢病毒载体,并观察到PTEN基因在真核细胞中的成功表达.     

小鼠CDK4基因RNAi慢病毒载体的构建及体外研究

目的:探讨CDK4在神经系统变性疾病中的作用,并构建携带小鼠CDK4-siRNA的慢病毒载体进行体外研究。方法:设计3个CDK4-siRNA序列和1个无关对照序列,化学合成后退火形成双链,克隆到酶切的pSIH1-H1-copGFP siRNA载体。重组质粒经PCR和测序鉴定后,脂质体介导下转染BV-2细胞,Western blot检测CDK4的表达,筛选出干扰效果最佳的pSIH1-siRNA2。将对照序列和pSIH-siRNA2分别与慢病毒包装质粒共转染293T细胞生成病毒,收集病毒上清并浓缩,测定浓度。结果:慢病毒感染BV-2细胞后可表达GFP,RT-PCR和Western blot检测CDK4的表达明显下降。结论:成功构建携带CDK4-siRNA的慢病毒载体,体外研究显示其能明显下调CDK4的表达。     

人组织因子RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的通过构建携带人组织因子基因的RNAi慢病毒载体,获得可供转染的滴度,为下一步研究该基因缺陷在真核细胞中的影响提供物质基础：方法根据人组织因子基因设计的2条互补的单链寡核苷酸退火后形成双链,插入到pENTR^TM／U6载体的粘性末端,生成含RNAi盒的pENTR／U6载体,测序;与目标载体pLenti6／BLOCK-iT^TM-DEST vector进行位点特异性重组,再测序;经脂质体导入293FT细胞,包装成慢病毒,收集病毒上清并采用系列稀释法测定病毒滴度。结果经测序分析证实pENTR^TM／U6-TF-shRNA为阳性克隆,与载体pLenti6／BLOCK-iT^TM-DEST vector重组后测序结果显示也为阳性克隆,包装病毒,病毒悬液的滴度为5×10’^5TU／mL。结论成功构建了携带人组织因子（TF）基因的RNAi慢病毒载体,为血栓栓塞性疾病的防治提供了新的思路。     

人HMGN5基因shRNA慢病毒载体构建与RNAi效率的鉴定

目的构建人HMGN5基因的shRNA慢病毒载体并鉴定在肺癌A549和H1299细胞上的沉默效率。方法设计HMGN5基因特异性siRNA靶点,构建于慢病毒pLL-3.7载体,并筛选获得有效的shRNA慢病毒载体,在293T细胞包装成病毒颗粒,将其感染肺癌A549和H1299细胞,应用Real-time PCR方法从mRNA水平上检测HMGN5的沉默效率。结果构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度达到5×108TU/ml。shRNA慢病毒颗粒感染A549和H1299细胞后HMGN5基因的mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组分别下降了71.7%和50.7%。结论成功构建了HMGN5基因的shRNA慢病毒表达载体,在分子水平能够有效沉默靶基因,为探讨HMGN5在肿瘤基因治疗中的作用奠定了基础。     

靶向Arnt的RNAi慢病毒载体的构建及其在HCCLM6中对Arnt基因表达的影响

目的：构建并鉴定Arnt基因特异性RNAi慢病毒载体，将其导入HCCLM6肝癌细胞中，筛选有效抑制ARNT表达的稳定细胞株。方法：针对已经筛选确定的Arnt基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，退火形成双链DNA，与经HpaI和XhoI酶切后的pLVTHM载体连接[含U6启动子和绿色荧光蛋白（GFP）]产生LV-shArnt慢病毒载体，PCR筛选阳性克隆，测序鉴定。用LV—shArnt载体，pCMV—dR8．74载体，pMD2G载体三质粒共转染包装细胞293T细胞，包装产生慢病毒，以293T细胞GFP蛋白表达水平测定病毒滴度，挑选细胞克隆，收获病毒上清，将病毒上清转染HCCLM6中，经过GFP筛选得到稳定抑制Arnt表达的HCCLM6细胞株，通过RT—PCR鉴定抑制Arnt表达的效果。结果：双酶切与测序鉴定证实成功构建了ArntshRNA的慢病毒载体，转染包装病毒细胞株获得的病毒上清成功转染了HCCLM6，并且抑制了Arnt的表达。结论：运用pLVTHM载体构建的LV—shArnt慢病毒载体可有效抑制Arnt在肝癌细胞株HCCLM6中的表达，为观察转染shRNA慢病毒表达载体的肿瘤细胞的恶性生物学行为变化奠定了实验基础。     

Rac1基NRNAi慢病毒载体的构建与鉴定

背景：Rac1是通过信号转导来调节癌细胞的侵袭、增殖,它在各种肿瘤中都有表达。目的：构建RAC1基因RNA干扰慢病毒载体,并检测其干扰效率。方法：应用Western blot检测Rac1基因在舌癌细胞中的表达。针对筛选确定的Rac1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI双酶切后的pMagic4.1载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定后将质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,采用Real-Time PCR筛靶,将筛靶成功的质粒进行慢病毒包装,再感染Tca8113细胞。荧光定量PCR和Western blot检测鉴定Rac1基因表达的干扰效果以确定其生物活性。结果与结论：成功构建了RAC1干扰载体,Western blot检测显著抑制Rac1蛋白表达,经Real-time PCR检测pLVT447的抑制率达70%。成功的构建了Rac1基因RNAi慢病毒载体,为RNAi用于靶向Rac1的基因治疗舌癌（Tca8113）提供了有效的siRNA靶序列。     

沉默Toll样受体4基因表达的RNAi慢病毒载体的构建

背景:Toll样受体4(toll-like receptor4,TLR4)是介导内毒素/脂多糖应答的主要受体,在由内毒素诱导的炎性反应的信号通路中发挥着重要作用。目的:构建人TLR4基因的RNA干扰慢病毒载体,并观察其对人脐静脉内皮细胞TLR4在蛋白水平的沉默效应。方法:利用Invitrogen在线软件设计人TLR4基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核苷酸后克隆到线性载体pENTRTM/H1/TO的黏性末端,并进行DNA测序。得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组反应,从而获得干扰TLR4基因真核表达的慢病毒载体。在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助复合体和TLR4基因的真核表达慢病毒载体导入293FT细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染人脐静脉内皮细胞,检验其干扰TLR4基因表达的有效性。结果与结论:实验成功构建TLR4基因真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒滴度为8.7×106U/mL。免疫印迹杂交结果表明,所获得的慢病毒感染人脐静脉内皮细胞TLR4基因在蛋白水平的表达显著降低。实验成功构建了人TLR4基因慢病毒RNA干扰表达载体,并验证了其在人脐静脉内皮细胞上的有效性。     

慢病毒介导TIEG1基因乳腺癌靶向载体的构建及活性测定

目的:构建慢病毒介导的TIEG1基因乳腺癌特异性靶向载体,并鉴定其活性。方法:将乳腺癌特异性survivin启动子片段和TIEG1基因先后克隆进带有绿色荧光蛋白的慢病毒载体中,构建survivin启动子驱动的TIEG1基因慢病毒表达载体,酶切及测序鉴定。包装纯化慢病毒颗粒,感染人脐静脉内皮细胞HUVEC和乳腺癌细胞SK-BR-3,观察绿色荧光蛋白的特异性表达。结果:成功构建带有肿瘤特异性survivin启动子驱动的TIEG1基因慢病毒表达载体。感染细胞后,乳腺癌SK-BR-3细胞可观察到绿色荧光表达,而人正常脐静脉内皮细胞基本无表达。半定量RT-PCR证实TIEG1基因在乳腺癌SK-BR-3细胞中过表达。结论:构建的survivin启动子驱动的慢病毒表达载体具有一定的肿瘤特异性,将为实现以慢病毒为载体的TIEG1基因肿瘤靶向治疗提供良好的实验基础。     

沉默Toll样受体4基因表达的RNAi慢病毒载体的构建

背景：Toll样受体4（toll-like receptor4,TLR4）是介导内毒素/脂多糖应答的主要受体,在由内毒素诱导的炎性反应的信号通路中发挥着重要作用。目的：构建人TLR4基因的RNA干扰慢病毒载体,并观察其对人脐静脉内皮细胞TLR4在蛋白水平的沉默效应。方法：利用Invitrogen在线软件设计人TLR4基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核苷酸后克隆到线性载体pENTRTM/H1/TO的黏性末端,并进行DNA测序。得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组反应,从而获得干扰TLR4基因真核表达的慢病毒载体。在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助复合体和TLR4基因的真核表达慢病毒载体导入293FT细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染人脐静脉内皮细胞,检验其干扰TLR4基因表达的有效性。结果与结论：实验成功构建TLR4基因真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒滴度为8.7×106U/mL。免疫印迹杂交结果表明,所获得的慢病毒感染人脐静脉内皮细胞TLR4基因在蛋白水平的表达显著降低。实验成功构建了人TLR4基因慢病毒RNA干扰表达载体,并验证了其在人脐静脉内皮细胞上的有效性。