间充质干细胞成软骨分化相关研究进展

软骨细胞移植疗法已成功应用于软骨损伤修复和软骨组织工程研究,但软骨细胞取材有限,因此探索软骨细胞替代物成为研究热点。间充质干细胞具有分化为骨、软骨等组织的潜能,在软骨损伤、骨关节炎修复及软骨组织工程等方面起着重要作用。该文就间充质干细胞成软骨分化相关研究进展作一综述。     

骨髓间充质干细胞成软骨分化研究进展

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于骨髓基质中的一种多能干细胞，在特定的培养条件下，MSCs可分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞等多种间充质细胞。由于它们可以作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也被称为骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)。本文就骨髓MSCs的分离培养及成软骨分化的研究进展作一综述。     

Wnt3a对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响

[目的]探讨Wnt3a基因对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成软骨分化的影响。[方法]分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),携带Wnt3a及阴性对照基因(Mock)的慢病毒感染骨髓间充质干细胞,构建过表达Wnt3a骨髓间充质干细胞;采用甲苯胺蓝染色及QPCR观察Wnt3a对骨髓间充质干细胞成软骨分化能力的影响;使用MTT法观察Wnt3a对骨髓间充质干细胞增殖能力的影响。[结果]在0~72 h内,实验组MTT法检测吸光值明显大于对照组(P0.05);BMSCs体外成软骨诱导后,实验组细胞团明显小于对照组,且甲苯胺蓝染色较浅;实验组与对照组比较,成软骨指标Col2A1、Aggrecan和SOX9的m RNA表达降低(P0.05)。[结论]Wnt3a可促进骨髓间充质干细胞增殖,但抑制了骨髓间充质干细胞的成软骨分化。     

定向诱导间充质干细胞成软骨分化相关活性因子研究进展

关节软骨受损或缺失,是导致关节炎等渐进性疾病的主要原因,严重影响患者生活质量。成熟的透明软骨由于缺乏神经支配和血管供应,且软骨细胞增殖能力差,所以很难自我修复。自体软骨细胞移植尚存在局限性,且操作复杂,阻碍了临床应用。间充质干细胞增殖能力较强,并保留有分化潜力,但向成软骨分化需要一定的条件,如细胞因子、支架材料、培养基等。寻找促进诱导间充质干细胞成软骨分化的活性因子,是目前关节软骨再生的重要研究方向。本文就诱导间充质干细胞向软骨分化的相关活性因子的研究进展进行综述。     

脂肪间充质干细胞的成骨诱导分化

目的　研究脂肪间充质干细胞 (MSCs)在特定培养条件下向成骨细胞分化 ,探讨其作为骨组织工程的种子细胞的可行性。方法　取 3周龄Lewis大鼠的腹股沟脂肪垫 ,消化法获得脂肪MSCs,用成骨诱导培养基诱导其向成骨细胞分化 ,组织化学染色、免疫细胞化学染色和Westernblotting检测细胞分化的情况。结果　从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪MSCs,能大量稳定增殖传代。在地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的诱导下 ,脂肪MSCs的ALP活性增高 ,VonKossa染色出现钙结节 ,OPN、BMP - 2免疫细胞化学染色阳性 ,Westernblotting检测到诱导后细胞OPN、BMP - 2的表达 ,且随诱导时间延长表达增强。结论　从脂肪组织中可获得具有多分化潜能的MSCs,并能在体外稳定增殖传代 ,经诱导后可分化为脂肪细胞和成骨细胞 ,有可能成为骨组织工程较理想的种子细胞之一     

骨髓间充质干细胞软骨分化生物学的影响因素

间充质干细胞(MSCs)因具有在适宜的体内或体外条件下分化形成软骨组织的潜能，且易于从骨髓中分离和体外大量扩增纯化，便于自体移植，故被认为是软骨组织工程最有希望的种子细胞来源之一。然而，MSCs在体外培养条件下软骨表型的分化却是一个受多种因素限制的复杂过程。目前其调控机制仍不是很清楚。已知局部环境是影响MSCs向软骨细胞转化的重要因素，低氧张力、高细胞密度、局部应     

不同相对分子质量透明质酸对兔骨髓来源间充质干细胞成软骨分化的影响

目的 观察不同相对分子质量透明质酸(HA)对兔骨髓来源间充质干细胞(MSCs)向软骨方向定向分化的影响.方法 取P3代未诱导的骨髓来源间充质干细胞,培养液中分别添加不同相对分子质量透明质酸做诱导剂,分为3个实验组,A组:相对低分子质量组(基础培养基+ HA 0.1 g/L,相对分子质量约1000×103),B组:相对中分子质量组(基础培养基+HA0.1 g/L,相对分子质量约1800×103),C组:相对高分子质量组(基础培养基+HA 0.1 g/L,相对分子质量约2000×103).同时设立阳性对照组[基础培养基+ 10 μg/L转化生长因子-β3( TGF-β3)]及空白对照组(基础培养基),观察细胞形态及增殖情况,分别于诱导后第7、14、21天行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,另外采用免疫组织化学染色及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测细胞Ⅱ型胶原表达.结果 经添加软骨诱导剂后,干细胞细胞增殖速度放缓,形态逐渐改变,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性.RT-PCR检测示实验组Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,诱导至21 d可见各实验组Ⅱ型胶原基因相对表达量分别为0.64±0.06、0.72±0.03、0.75±0.01,与阴性对照组(0.09±0.03)、阳性对照组(0.96±0.15)比较差异均有统计学意义,但B、C组间Ⅱ型胶原表达相似.结论 不同相对分子质量外源性HA诱导兔MSCs向软骨细胞分化的能力存在差异,相对高分子质量的HA的诱导能力较相对低分子质量HA的诱导能力强.证明透明质酸的相对分子质量与MSCs的软骨分化有关联性,但均比TGF-β3的诱导能力弱.     

骨形态发生蛋白对兔骨髓间充质干细胞成软骨分化的定向诱导作用

目的研究骨形态发生蛋白(BMP)对兔骨髓间充质干细胞(MSCs)的定向诱导作用,探讨MSCs的成软骨能力。方法分离并培养兔MSCs,BMP诱导MSCs向软骨细胞分化,观察其形态学改变及碱性磷酸酶(ALP)活性。将诱导后的MSCs接种PGA无纺网体外培养2周,将MSCsPGA无纺网复合体植入裸鼠背部皮下,2个月后取材,进行组织学观察。结果经BMP诱导后,MSCs的形态由长梭形向多角形和三角形转化,群体倍增时间约为3.0d。诱导5、10d后,ALP活性为0.282±0.015,0.502±0.012,明显高于对照组0.265±0.010,0.315±0.021(P<0.01),ALP染色阳性。MSCsPGA无纺网复合体植入裸鼠后,组织学可见软骨陷窝,陷窝内可见核蓝染的成软骨细胞,证实MSCs具有体内成软骨能力。结论经BMP诱导的MSCs向软骨细胞分化和增殖,在裸鼠体内可形成软骨组织。     

间充质干细胞成软骨分化的表观遗传学研究

表观遗传学机制包括DNA甲基化,组蛋白修饰和microRNA,表观遗传学调控基因表达改变持久、可遗传并且不涉及DNA序列改变,各个领域中对于表观遗传学机制的研究和应用已经成为新的热点。软骨组织再生医学领域中的表观遗传学机制研究,为干细胞向软骨细胞分化以及软骨细胞终末分化提供了多种调控方式。但是,目前的研究主要是在体外常氧条件下,软骨组织工程细胞最终将应用于体内低氧环境中,低氧环境与表观遗传学机制之间相互影响将是研究者们需要关注的重点。本综述意在收集近年来干细胞成软骨分化中表观遗传学调控的研究成果以及各个研究领域中低氧环境与表观遗传学机制间的相互影响,希望能够为软骨组织工程细胞体内应用研究提供新的思路。     

间充质干细胞成软骨分化诱导相关细胞因子的研究进展

软骨的破坏、缺损是包括骨关节炎（osteoarthritis,OA）在内的多种骨科疾病的重要病理改变。由于软骨特殊的解剖及组织特性,如缺乏血管和淋巴管的分布,使得其自我修复能力异常不足,因此通过人工方法修复软骨破坏具有重要临床意义。近年来,随着间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的发现和研究的深入,其来源广泛、良好的增殖能力、多分化潜能、与各种3D支架材料具有良好的生物相容性等特性使得其在软骨修复应用中具有令人期待的潜力。     

尼古丁对大鼠骨髓间充质干细胞软骨分化的干预作用研究

目的 从细胞水平证实尼古丁对大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导分化为软骨细胞的干预作用.方法 大鼠BMSCs传代至第3代,以海藻酸钠微球生物支架进行BMSCs三维培养.加入转化生长因子β1(TGF-β1)进行诱导分化,在细胞分化过程中,分别给予0.1、1、10、100μmol/L尼古丁干预,设对照组.第28天收获细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞代谢活力、阿利新蓝特殊染色检测细胞中氨基葡聚糖的含量、实时荧光定量PCR检测软骨分化标志基因(COL2A1、Aggrecan、COL1A1、COL10A1)的表达情况.结果 诱导培养28 d后,MTT法结果示不同浓度尼古丁干预后的各组细胞代谢活力与对照组细胞相比,没有明显改变;当尼古丁作用浓度分别为0、0.1、1、10和100μmol/L时,其BMSCs海藻酸钠微球的阳性染色区域占切片的百分比分别为90.1％、76.5％、64.8％、44.1％、4.5％;与对照组比较,尼古丁能显著抑制软骨诱导分化下的BMSCs细胞中Aggrecan、COL2A1的表达,同时促进COL1A1、COL10A1的表达(P均<0.05),并且存在浓度依赖性.结论 尼古丁能够明显抑制大鼠BMSCs的软骨分化,导致其软骨分化质量差.     

小鼠羊水间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的  探讨小鼠羊水间充质干细胞（AF-MSC）的分离、培养及鉴定。方法  在无菌条件下获取孕鼠子宫,收集羊水后进行过滤和离心,对沉淀细胞团进行培养并传代。观察AF-MSC的形态,分析AF-MSC的增殖特点,采用流式细胞术鉴定AF-MSC的表面标志物,检测AF-MSC的三系分化能力及冷冻复苏后的细胞活力。结果  小鼠AF-MSC呈典型的梭形,融合度 > 80%时会出现典型的漩涡状结构。小鼠AF-MSC传代培养无明显潜伏期,培养2~3 d进入对数增长期,增长速度最快,之后增殖速度减慢,进入平台期。AF-MSC表达干细胞抗原（Sca）-1、CD29、CD44,不表达CD34、CD45。小鼠AF-MSC成骨分化后,矿化结晶被茜素红染成深红色的点状;成软骨分化后,分泌的酸性粘多糖被阿利新蓝染成淡蓝色;成脂分化后,胞质脂滴被油红O染成红色。细胞冷冻复苏后存活率 > 95%,生长状态良好,6 d时增殖能力高于冻存前（P < 0.05）,其他时间增殖能力与冻存前比较,差异无统计学意义（均为P > 0.05）。结论  本实验成功分离了小鼠AF-MSC,过程简便、成本低,且分离的细胞可随传代次数的增加而纯化,冻存不影响其增殖能力。     

非接触式共培养体系对脐带间充质干细胞向类髓核细胞的诱导分化效应

目的探讨人脐带间充质干细胞向类髓核细胞的分化潜能,为椎间盘退变性疾病的生物学治疗探索新的细胞来源。方法取人正常足月产婴儿脐带及成人椎间盘,分离消化华通胶组织和髓核组织,收集培养脐带间充质干细胞及成人髓核细胞。利用带有插入层的Transwell 6孔培养板进行细胞非接触式共培养,细胞比例为1∶1,以脐带间充质干细胞单独培养作为对照组。共培养1周后,提取脐带间充质干细胞总RNA,利用Real-Time PCR检测其Ⅱ型胶原、蛋白多糖及SOX9基因的相对表达改变。结果成功分离提取脐带间充质干细胞;Real-Time PCR检测结果显示实验组脐带间充质干细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX9基因相对表达较对照组显著增加,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论人脐带间充质干细胞能够被髓核细胞诱导分化为类髓核细胞,有可能为椎间盘退变性疾病的生物学治疗提供一种新的细胞来源。     

间充质干细胞向髓核分化研究进展

正椎间盘退行性变为下腰痛的重要原因之一[1]。非手术或手术治疗均不能彻底治愈椎间盘退行性变,且有复发的可能[2-3]。间充质干细胞(MSCs)具有体外扩增及分化成正常组织的潜能,在一定的诱导条件下可以向成骨、成软骨、成脂及髓核细胞分化,且具有免疫原性低和免疫调节性的特点[4-7],一直是组织修复研究的热点。近年来,诱导MSCs向髓核分化,用于修复椎间盘退行性变备受关注,     

体外诱导BMSCs向软骨分化的方法研究进展

目的全面了解目前体外诱导BMSCs向软骨分化的方法,为软骨组织工程研究提供参考。方法广泛查阅近年来有关软骨组织工程中诱导BMSCs向软骨分化的文献,并进行综合分析。结果目前BMSCs诱导成软骨方法主要是添加外源性生长因子,其中TGF-β家族被公认为最重要的诱导和调节因子。其他重要的诱导方法包括添加多种化学因子、物理因素、转基因技术和微环境诱导等方法,但这些方法仍存在诱导效率低、诱导效果不稳定的问题。结论诱导方法的进展促进了BMSCs在软骨组织工程中的应用,建立更高效、简便、安全的诱导方法仍是软骨组织工程领域重要研究课题之一。     

Chondrogenic differentiation of mesenchymal progenitor cells encapsulated in ultrahigh-viscosity alginate.

One major problem of current cartilage repair techniques is that three-dimensional encapsulated mesenchymal progenitor cells frequently differentiate into hypertrophic cells that express type X collagen and osteogenic marker genes. Studies on wild-type cells of murine mesenchymal C3H10T1/2 progenitor cells as well as on cells transfected with cDNA encoding for bone morphogenetic protein (BMP)-2 or -4 in alginate revealed that the formation of markers for osteogenesis and chondrogenic hypertrophy apparently depended on the BMP-transfection. Cells were encapsulated in ultrahigh-viscosity, clinical grade alginate and differentiation was studied over a period of 17 days. Consistent with results published previously staining with haematoxylin-eosin or Alcian blue, immunohistochemical analysis, and quantitative RT-PCR confirmed the expression of chondrogenic markers (chondroitin-4- and -6-sulfate as well as type II collagen). Production of chondrogenic markers was particularly high in BMP-4 transfected cells. Hypertrophic chondrogenesis did not occur in BMP-4 transfected cells, as revealed by measurement of type X collagen, but could be demonstrated for wild-type cells and to some extent for BMP-2 transfected cells. The osteogenic markers, type I collagen, alkaline phosphatase, and Cbfa1 were upregulated in all cell lines even though the levels and the time of upregulation differed significantly. In any case, the markers were less and only very shortly expressed in BMP-4 transfected cells as revealed quantitatively by real time RT-PCR. Thus, the in vitro results suggested that BMP-4 is a very promising candidate for suppressing chondrogenic hypertrophy, while simultaneously enhancing the production of chondrogenic components.     

人脐血间充质干/祖细胞诱导为心肌样细胞的实验研究

目的　了解脐血间充质干 /祖细胞用于心肌细胞再生的可行性 ,并探讨其最佳的诱导培养条件。方法　将脐血单个核细胞置于低血清 (2 % )DMEM培养基中生成贴壁细胞层 ,依传代方法 ,用相同培养条件进行扩增 ,扩增后的贴壁细胞置入心肌诱导培养液中 ,并添加 5 氮杂胞苷进行诱导分化、采用心肌特异性收缩蛋白 肌钙蛋白T染色鉴定被诱生的心肌样细胞。结果　脐血间充质干 /祖细胞克隆在脐血单个核细胞中出现频率为 0 .5× 10 -6,在传 2 0代时 ,可有效扩增 1.3× 10 7倍 ,诱导后 ,70 %的脐血间充质干 /祖细胞分化为心肌样细胞。结论　采用上述扩增与诱导条件 ,脐血间充质干 /祖细胞可得到有效扩增 ,并可高效向心肌样细胞分化。     

Imaging early stage osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells

Stem cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), contribute to bone fracture repair if they are delivered to the injury site. However, it is difficult to assess the retention and differentiation of these cells after implantation. Current options for non‐invasively tracking the transplanted stem cells are limited. Cell‐based therapies using MSCs would benefit greatly through the use of an imaging methodology that allows cells to be tracked in vivo and in a timely fashion. In this study, we implemented an in vivo imaging methodology to specifically track early events such as differentiation of implanted human MSCs (hMSCs). This system uses the collagen type 1 (Col1α1) promoter to drive expression of firefly luciferase (luc) in addition to a constitutively active promoter to drive the expression of green fluorescent protein (GFP). The resulting dual‐promoter reporter gene system provides the opportunity for osteogenic differentiation‐specific luc expression for in vivo imaging and constitutive expression of GFP for cell sorting. The function of this dual‐promoter reporter gene was validated both in vitro and in vivo. In addition, the ability of this dual‐promoter reporter system to image an early event of osteogenic differentiation of hMSCs was demonstrated in a murine segmental bone defect model in which reporter‐labeled hMSCs were seeded into an alginate hydrogel scaffold and implanted directly into the defect. Bioluminescence imaging (BLI) was performed to visualize the turn‐on of Col1α1 upon osteogenic differentiation and followed by X‐ray imaging to assess the healing process for correlation with histological analyses. © 2013 Orthopaedic Research Society Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res XX:XXX–XXX, 2013 © 2013 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 31: 871–879, 2013     

人骨髓间质干细胞向表皮细胞分化的研究

目的探讨人骨髓间质干细胞（MSC）在体外培养条件下能否定向诱导分化为表皮细胞。方法抽取无造血系统恶性疾病的成人骨髓标本，采用Percoll细胞分离液（1．073g／ml）分离MSC，在体外传代培养至第3代，分为对照组和实验组。两组分别用普通L-DMEM培养基和含表皮生长因子、胰岛素、维甲酸、氯化钙的L-DMEM培养基诱导7d。在倒置相差显微镜下每天观察两组细胞的形态；采用免疫组织化学法检测P63和广谱细胞角蛋白（PCK）的表达情况。结果实验组细胞由长梭形逐渐转变为扁圆形或形态不规则，部分细胞P63和PCK呈阳性表达；对照组细胞持续呈长梭形，P63和PCK未见表达。结论人骨髓MSC在体外可诱导分化为表皮细胞。     

软骨寡聚基质蛋白对BMP 2诱导骨髓间质干细胞分化的影响

 目的 探讨过表达软骨寡聚基质蛋白（cartilage oligomeric matrix protein,COMP）对BMP-2诱导骨髓间质干细胞成骨及成软骨分化的影响。方法 用BMP-2诱导骨髓间质干细胞分化,通过脂质体转染含人COMP基因的质粒使骨髓间质干细胞过表达COMP,空载质粒作为对照。以RT-PCR检测成骨相关基因Ⅰ型胶原、RUNX2、骨桥蛋白、骨钙蛋白以及成软骨相关基因Ⅱ型胶原、SOX9、蛋白聚糖的表达变化;通过碱性磷酸酶染色观察成骨过程中的碱性磷酸酶活性,茜素红染色观察成骨终末阶段矿化结节的生成情况,阿利新蓝染色观察细胞基质蛋白多糖的合成情况。结果 COMP组目的基因COMP mRNA的表达显著升高;骨桥蛋白mRNA表达水平较对照组低,呈现出一致的下调趋势（P<0.05）;Ⅰ型胶原、RUNX2、骨钙蛋白mRNA表达水平在诱导早期均高于对照组（P<0.05）,但在诱导晚期均明显低于对照组（P<0.05）;成软骨指标（Ⅱ型胶原、SOX9、蛋白聚糖）的基因表达水平强于对照组,呈一致的上调趋势（P<0.05）;SOX9 mRNA表达水平高于对照组,仅在第7天时差异具有统计学意义（P<0.05）;细胞成骨染色（碱性磷酸酶染色、茜素红染色）均弱于对照组,而阿利新蓝染色强于对照组。结论 COMP能抑制BMP-2诱导骨髓间质干细胞成骨分化,促进BMP-2诱导骨髓间质干细胞成软骨分化。