联合应用反义bcl-2和反义IL-6寡核苷酸对小细胞肺癌细胞株NC1-H446的作用

目的 观察联合应用反义bcl-2硫代磷酸寡脱氧核苷酸(bcl-2AS-PS-ODN)和白细胞介素6(IL-6)AS-PS-ODN对小细胞肺癌细胞株NCI-H446增殖和活力的影响。方法 以bc1-2AS-PS-ODN和IL-6AS-PS-ODN单独及联合作用于NCI-H446，经细胞克隆形成实验、细胞增殖实验观察其对细胞增殖和活力的影响，经细胞凋亡线粒体流式检测试剂盒检测细胞凋亡的变化，经半定量RT-PCR检测IL-6 mRNA表达水平的变化。结果 细胞增殖曲线、细胞克隆形成实验及细胞凋亡实验显示联合用药能更强地抑制细胞活力，促进细胞凋亡。bc1-2AS-PS-ODN单独作用时，IL-6mRNA表达上升74．3％，IL-6AS-PS-ODN单独作用以及与bcl-2AS-PS-ODN联合作用时，IL-6分别下调67．7％和52．4％。结论 联合用药较单独用药对NCI-H446细胞株显示出更好的抑制效果。     

反义bcl-2基因抗白血病作用的研究

目的 研究反义bcl-2基因抗白血病作用及其特点,探讨反义基因或联合药物体外净化和治疗白血病可行性。方法 （1）RT－PCR和蛋白印迹方法检测HL－60、U937、K562、CEM白血病细胞株以及常见白血病类型的bcl-2 mRNA和P26蛋白表达情况。（2）选择高表达bcl-2基因的HL－60细胞株作为靶细胞,用人工合成bcl-2正反义硫代寡聚脱氧核苷酸（PS－ODN）体外培养处理。检测bcl-2 mRNA和P26蛋白的变化;DNA梯形分析细胞凋亡,锥虫蓝拒染法和克隆培养观察细胞生长;同时将HL－60细胞与PS－ODN培养孵育7天后的活细胞腹腔接种Scid鼠,半巢式RT－PCR和病理分析该HL－60细胞在体内生物学行为改变。（3）建立三种白血病细胞株CEM、K562、HL－60 Scid鼠白血病模型和有效监测与追踪白血病细胞株的方法,掌握体内白血病细胞株生物学行为;用bcl-2正反义PS－ODN腹腔给药治疗HL－60 Scid鼠白血病模型,观察治疗后体内白血病进展变化。（4）用RT－PCR方法克隆bcl-2基因和构建其两种不同的反义RNA逆转录病毒表达载体。（5）转染高表达bcl-2的HL－60细胞,比较两种反义RNA在对抗bcl-2的作用与降低内源性bcl-2蛋白水平上的异同性。观察两种反义RNA介导的靶基因抑制对烷化溶血磷脂（ALP）和四种化疗药物诱导的HL－60细胞凋亡的影响。（6）RT－PCR检测基因转染HL－60在化疗药物作用下FGFβ1表达。结果 （1）白血病细胞株表达bcl-2有差异,bcl-2 mRNA和它的P26蛋白不平行。（2）三种白血病细胞株HL－60,K562,CEM可在Scid鼠增殖,产生典型白血病浸润模型特征,白血病增殖和浸润程度与白血病细胞生物特性有关,其顺序为CEM＞K562＞HL－60。（3）人工合成的bcl-2反义硫化寡脱氧核苷酸（ASPO）能够下调HL－60细胞bcl-2表达,诱导凋亡,抑制增殖和克隆形成;同时使其失去在体内的致白血病能力。（4）bcl-2反义硫代寡脱氧核苷酸,腹腔给药能够抑制肿块增长,白血病扩张,延长Scid鼠生存期,呈剂量依赖性。（5）部分编码区的反义RNA能够降低HL－60细胞内源性Bcl-2蛋白水平,提高ALP和四种化疗药物对HL－60杀伤率,促进它们诱导的HL－60细胞凋亡。（6）反义基因转染的HL－60细胞在化疗药物作用下负调控因子TGFβ1基因表达增加。结论 bcl-2反义基因可有效对抗bcl-2原癌基因表达,发挥明显的抗白血病作用,为体外净化白血病细胞和体内治疗白血病提供依据。     

rhTNF-α联合bcl-2反义寡核苷酸对急性髓细胞白血病细胞株HL-60增殖与凋亡的作用

目的　探讨基因重组人类肿瘤坏死因子 α(rh TNF- α)和 bcl- 2反义寡核苷酸 (ASPO)对 HL- 6 0细胞增殖与凋亡的作用 ,进一步认识肿瘤坏死因子 α(TNF- α)和 bcl- 2两者调控肿瘤细胞凋亡的作用及相互联系。　方法　单独和联合应用 rh TNF- α和 bcl- 2 ASPO处理 HL- 6 0细胞 ,通过 MTT法检测 HL- 6 0细胞生长和存活特性变化 ;原位细胞凋亡检测和流式细胞技术检测细胞凋亡 ;应用 RT- PCR、免疫组织化学检测癌基因 bcl- 2表达的改变。　结果　 rh TNF- α和 bcl- 2 ASPO的联合应用明显增强对 HL- 6 0细胞的增殖抑制 ;细胞凋亡率明显升高 ;癌基因bcl- 2在 m RNA和蛋白表达明显下降。　结论　 TNF和 bcl- 2 ASPO在诱导 HL- 6 0细胞凋亡中可能存在协同作用 ,为血液肿瘤的联合治疗提供了新的途径     

反义端粒酶RNA与1,25-（OH）2D3抑制肝癌细胞增殖的协同作用

【目的】观察1,25-(OH2)D3对转染反义端粒酶RNA的肝癌细胞增殖的作用。【方法】经脂质体介导,将反义端粒酶RNA真核表达载体pBBS212-hTR导入维生素D3受体(VDR)阳性的肝癌细胞株SMMC7721细胞中培养。细胞克隆转移扩大培养,添加1,25-(OH)2D3分别作用于各实验组细胞后,采用四唑蓝比色实验(MTT)和平板克隆形成实验,检测细胞的存活和生长;TUNEL法检测细胞凋亡。【结果】转染组细胞和对照组细胞的端粒酶活性分别为0.686和1.685,说明反义端粒酶RNA可显著降低肝癌细胞端粒酶活性。10 nmol/L浓度的1,25-(OH2)D3对肝癌细胞的增殖具有明显的抑制作用;且较之于单独的1,25-(OH2)D3或转染反义端粒酶RNA对肝癌细胞增殖的抑制作用,在转染反义端粒酶RNA,降低肝癌细胞端粒酶活性后,1,25-(OH2)D3抑制肝癌细胞增殖的作用显著得到增强。各组细胞的凋亡率分别为3.4%、12.2%、8.8%、23.6%。经统计学处理,上述实验结果证实均存在显著的差异(P<0.01)。【结论】在转染反义端粒酶RNA、降低细胞端粒酶活性的基础上,1,25-(OH2)D3抑制肝癌细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用进一步得到增强。     

反义核苷酸对宫颈癌细胞恶性增殖的逆转作用

目的　探讨反义硫代寡核苷酸对 HPV16阳性人宫颈癌细胞恶性增殖的影响 .方法　人工合成 3段 18- mer的反义硫代寡聚脱氧核苷酸 AS- ODN1 - 3.其中 ,AS- ODN1(AE6 ) ,AS- ODN2 (AE7)分别与 HPV16 E6 ,E7开放读框起始码及其侧翼序列互补 ,AS- ODN3为一随机序列 .分别用 3种反义寡核苷酸处理整合有 HPV16基因组的宫颈癌细胞 Si-Ha.通过生长曲线测定、3H- Td R参入试验及软琼脂克隆形成试验 ,观察反义寡核苷酸对 Si Ha细胞恶性增殖的影响 .结果　 AE6及 AE7均抑制了 Si Ha细胞的生长速率和 DNA合成 ,但对 HPV16阴性的人宫颈癌细胞 He L a无明显影响 ;经 AE6及 AE7处理后的 Si Ha细胞在软琼脂上克隆形成数减少 ;随机序列对 Si Ha细胞增殖无抑制作用 .结论　通过特异性抑制 E6 ,E7基因的表达 ,反义寡核苷酸对 HPV16阳性宫颈癌细胞恶性增殖有显著抑制作用 .     

Bcl-2反义RNA对人多发性骨髓瘤凋亡影响的研究

目的　探讨 bcl- 2反义 RNA对人多发性骨髓瘤内源性Bcl- 2蛋白水平及细胞调亡的影响 ,以期为转基因治疗人多发性骨髓瘤提供实验依据。　方法　利用 DNA重组技术 ,构建反义 bcl- 2逆转录病毒表达载体 ,并将其导入人多发性骨髓瘤细胞株 U2 6 6细胞。通过 RT- PCR检测 bcl- 2反义RNA是否导入了细胞 ,应用 Western Blot检测内源性 Bcl- 2蛋白表达的改变 ,应用形态学、流式细胞术、片段化 DNA电泳及定量分析和 TUNEL 法检测靶细胞的凋亡。　结果　(1)成功地构建了反义 bcl- 2逆转录病毒载体 ,获得的重组病毒上清滴度为 4.5 X10 5 CF…     

姜黄素逆转结肠癌HCT-116/5FU细胞耐药作用机制研究

目的探讨姜黄素逆转人结肠癌耐药细胞株HCT-116/5FU耐药的作用机制。方法姜黄素、5-FU诱导耐药细胞HCT-116/5FU凋亡,按对照组、5-FU组、姜黄素组及联合用药组分为四组,对照组予普通培养基;5-FU组予含5-FU 200μM培养基;姜黄素组予姜黄素20μM培养基;联合用药组予含5-FU 200μM和姜黄素20μM培养基。采用MTT法检测细胞增殖以明确最佳实验条件;AnnexinV-FITC试剂盒检测细胞凋亡率;Western blot检测亲本株及耐药细胞株内cleaved-Caspase3、IL-6、STAT3蛋白表达水平。结果姜黄素联合5-FU干预人结肠癌耐药细胞株HCT-116/5FU后细胞增殖受明显抑制;联合用药组HCT-116/5FU细胞凋亡率为(56.0±12.1)%,明显高于5-FU组(6.5±3.2)%和姜黄素组(19.9±7.2)%(P0.05);耐药细胞株IL-6、STAT3蛋白表达明显高于亲本株;姜黄素降低耐药细胞株IL-6、STAT3的蛋白表达量,诱导cleaved-Casepase 3蛋白表达。结论姜黄素能逆转人结肠癌耐药细胞株HCT-116/5FU耐药,其机制可能与下调IL-6/STAT3有关。     

Bcl-2反义核酸增强青蒿琥酯诱导K562细胞凋亡

目的:研究bcl-2反义核酸增强青蒿琥酯对人慢性粒细胞白血病K562细胞株诱导凋亡效应. 方法:合成bcl-2反义核酸(ASON)导入K562细胞,应用Western blot法检测bcl-2蛋白的表达,TUNEL技术、流式细胞仪法(FCM法)检测细胞凋亡. 结果:bcl-2反义核酸(ASON)能明显抑制bcl-2蛋白的表达. 青蒿琥酯在1～7 mg/L浓度范围内能分别明显抑制K562细胞的增殖,并具有时间和浓度依赖性, 7 mg/L青蒿琥酯作用72 h的K562细胞株A值最低. 原位细胞凋亡检测可见细胞变小,核固缩为一个或多个染色质团块,与未经ASON转染的K562细胞株相比,经bcl-2 ASON转染的K562细胞株对青蒿琥酯的诱导凋亡作用更加明显;FCM法出现低于G1期DNA含量的亚二倍体凋亡峰,细胞凋亡主要发生在G1/S期,与未经ASON转染的K562细胞株相比,经bcl-2 ASON转染的K562细胞凋亡率显著增加. 结论:青蒿琥酯在体外一定浓度范围内可诱导K562细胞株凋亡,bcl-2反义核酸可增强青蒿琥酯诱导K562细胞凋亡的作用.     

bcl-2硫代反义寡核苷酸对U937细胞药物敏感性及细胞凋亡的影响

目的　 bcl- 2是调控细胞死亡的重要基因之— ,它编码的蛋白质通过阻止细胞凋亡而延长细胞存活。多血液系统的恶性肿瘤都有 bcl- 2表达异常。肿瘤细胞 bcl- 2高表达与其化疗耐药性有关。实验采用针对 bcl- 2 m RNA阅读框起始部位的 18碱基硫代反义寡核苷酸 (ASODN)作用于较高表达bcl- 2的 U937细胞 ,探讨 bcl- 2 ASODN U937细胞药物敏感性及细胞凋亡的影响。　方法　 MTT比色法检测 bcl- 2硫代寡核苷酸及与 VP16联合应用对 U937细胞的毒性作用 ;半定量 RT- PCR检测 bcl- 2 m RNA表达情况 ;免疫细胞化学染色和流式细胞仪检测 bcl…     

舒拉明联合bcl-2基因反义寡核苷酸对前列腺癌细胞增殖的影响

[目的]探讨舒拉明联合bcl-2基因反义寡脱氧核苷酸对前列腺癌细胞(LNCaP细胞)增殖的影响.[方法]采用3H-TdR掺入法观察舒拉明和反义寡脱氧核苷酸对LNCaP细胞增殖的影响,流式细胞荧光免疫法检测bcl-2基因表达,放射免疫分析法检测PSA表达.[结果]舒拉明和反义寡脱氧核苷酸单独作用LNCaP细胞后,细胞3H-TdR掺入率、bcl-2蛋白表达以及PSA水平明显低于对照组,呈现剂量依赖效应,二者联合应用抑制作用明显增强.[结论]舒拉明和bcl-2基因反义寡脱氧核苷酸联合应用,可明显增强对前列腺癌细胞增殖的抑制,减少舒拉明用药剂量.     

5F对非小细胞肺癌NCI-H460细胞survivin、p65和bcl-2mRNA的影响

目的：研究5F对非小细肺癌NCI—H460细胞survivin、p65和bcl-2mRNA水平的影响。方法：MTT法检测5F对NCI—H460细胞的生长抑制作用;用半定量RT—PCR方法检测survivin、p65及bcl一2mRNA水平的变化。结果：5F抑制NCI—H460细胞的生长,其效果与5F的浓度和作用时间相关,24、48、72h的IC50分别为：21．40、4．52、1．02μg·mL^-1：100μg·mL^-1。5F作用NCI—H460细胞6h后能引起survivinmRNA水平显著的降低（P〈0．05）,24h后出现增加（P〈0．05）;p65和bcl-2mRNA水平在作用3h就发生明显减少（P〈0．05）。结论：5F诱导NCI—H460细胞凋亡的机制可能是通过抑制survivin、p65和bcl-2mRNA水平来发挥作用的。     

Sorcin蛋白高表达与肺癌细胞株NCI-H446多药耐药的关系

目的探讨Sorcin高表达与肺癌细胞NCI-H446多药耐药的相关性。方法研究对象为肺癌细胞NCI-H446,以顺铂为诱导药物,建立多药耐药细胞系NCI-H446/CDDP;应用反义核酸技术抑制NCI-H446/CDDP细胞Sorcin的表达建立转染细胞,为反义核酸组,同时设空白对照组。通过RT-PCR及Western-blot分别检测各组细胞中Sorcin在核酸及蛋白水平的表达;MTT法测定NCI-H446组、反义核酸组、NCI-H446/CDDP组3组细胞在不同化疗药物DDP、VCR、ADM、VP-16作用下生存率;用Pearson相关分析Sorcin高表达与肺癌细胞株NCI-H446多药耐药的相关性。结果各组细胞中Sorcin在核酸及蛋白水平的表达,NCI-H446/CDDP组与空白对照组比较,差异无显著性意义(P>0.05),NCI-H446组、反义核酸组、NCI-H446/CDDP组各组间比较均具有显著性意义(P<0.05);NCI-H446/CDDP细胞中Sorcin在核酸及蛋白水平均明显高于NCI-H446细胞,分别为NCI-H446细胞的9.81倍和7.67倍。各组细胞在不同化疗药物作用下IC50:NCI-H446/CDDP组>反义核酸组>NCI-H446组,各组间比较差异具有显著性意义(P<0.05)。Pearson相关提示:Sorcin核酸及蛋白水平的表达与在不同化疗药物作用下各组细胞的IC50值呈负相关(P<0.05)。结论 Sorcin蛋白的高表达与肺癌多药耐药相关,抑制Sorcin蛋白的表达可以逆转肺癌多药耐药性。     

慢分割外照射对体外培养的小细胞肺癌细胞系放射敏感性的影响

目的 观察外照射前后小细胞肺癌NCI-H446细胞系放射敏感性的变化以及在外照射干扰下两组细胞生长和凋亡的特点。方法 采用GWGP80型远距离60Co治疗机对进入指数生长期的NCl-H446小细胞肺癌细胞系进行分次外照射，每次2Gy，总剂量为50Gy。然后，对未进行过外照射的NCI-H446细胞(S-cell)和己完成50Gy外照射的NCI-H446细胞(R-cell)再给予不同剂量的外照射，l周后计算各自的集落形成率(PE)和存活率(S)；另外，对相同数量的S-cell和R-cell给予同一剂量的外照射，于照射后的不同时间点计算细胞总数和死亡细胞百分率。结果 S-cell和R-cell的集落形成率分别为44．67％和13．11％，两者相比具有非常显著性差异(P＜0．01)；在分别给予2Gy和4Gy的外照射后，R-cell的存活率分别为79．67％和23．73％，而S-cell分别为51．24％和19．40％，两者分别相比均具有显著性差异(P均＜0．05)。在外照射后的相同时间点，两组细胞的细胞总数和死亡细胞百分率相差不大(P＞0．05)。结论 经50Gy的外照射后，NCI-H446细胞的自然生存能力明显下降，同时，其放射敏感性也有所下降；两组细胞在外照射的干扰下，其生长和凋亡的速率较为接近。     

N-甲基化嘌呤-DNA-糖基化酶在肺癌H446多药耐药细胞中的表达

目的本研究旨在观察N-甲基化嘌呤-DNA-糖基化酶在小细胞肺癌多药耐药细胞系H446/CDDP中的表达情况。方法以本所前期诱导成功的小细胞肺癌多药耐药细胞系H446/CDDP为研究对象,H446亲代细胞为对照,采用半定量RT-PCR法检测MPG基因mRNA的转录水平,免疫细胞化学法检测其蛋白表达。结果半定量RT-PCR显示,H446细胞MPG基因mRNA的转录量为0.19±0.15,H446/CDDP细胞为0.75±0.08;免疫细胞化学显示,H446/CDDP、H446细胞MPG蛋白表达呈阳性,均表达于细胞核。结论MPG的高表达可能同人小细胞肺癌多药耐药的产生有关。     

多西环素对体外人小细胞肺癌H446细胞增殖的影响及其机制

目的 探讨多西环素对体外人小细胞肺癌H446细胞增殖的影响及其可能的作用机制.方法 不同浓度的多西环素作用于体外培养的人小细胞肺癌H446细胞24、48、72或96 h,采用CCK-8法检测多西环素对H446细胞增殖的影响;采用Bliss法计算半数抑制浓度(IC50);采用TUNEL法检测多西环素对H446细胞凋亡的影响;采用Western印迹法检测多西环素对Bcl-2、Bax等凋亡相关蛋白表达的影响;采用实时定量-PCR法检测多西环素对Bcl-2、Bax等凋亡相关基因mRNA表达的影响.结果 多西环素可浓度-时间依赖性地抑制人小细胞肺癌H446细胞的体外增殖,作用24、48、72和96 h对应的IC50值分别为24.10、10.98、8.20和8.03 mg/L;多西环素作用后H446细胞的凋亡指数显著增加(P<0.05);Bax的蛋白及mRNA表达水平上调,Bcl-2的蛋白及mRNA表达水平下调,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 多西环素可通过上调促凋亡相关蛋白Bax的表达,下调抑凋亡相关蛋白Bcl-2的表达,诱导人小细胞肺癌H446细胞凋亡,进而抑制人小细胞肺癌H446细胞的体外增殖,是一种有开发前景的小细胞肺癌治疗药物.     

bcl-2反义寡核苷酸对膀胱癌BIU87细胞株的影响

目的:探讨bcl-2反义寡核苷酸对培养的膀胱癌BIU87细胞株的影响.方法:采用bcl-2基因第1外显子的反义寡核苷酸,以硫代磷酸修饰(PS-ASON),序列为5′-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3′,与膀胱癌细胞株BIU87共同孵育作为实验组.加入正义的bcl-2寡核苷酸,序列为5′-TACCGCGTGCGACCCTCT-3′(PS-SON)作为对照组,用流式细胞仪检测细胞凋亡和坏死率,电镜观察细胞形态变化.结果:与对照组相比,实验组的细胞坏死率明显上调,电镜下细胞形态呈坏死改变.结论:bcl-2的反义寡核苷酸引起膀胱癌细胞大量坏死,可能成为膀胱癌的治疗方法之一.     

胃粘膜线粒体DNA核内整合与bcl-2和bax表达的关系

目的　探讨胃癌及其癌前病变组织线粒体DNA核内整合与bcl 2和bax基因mRNA表达的关系。方法　采用原位杂交方法检测线粒体DNA核内整合 ;RT PCR方法检测胃癌及其癌前病变组织bcl 2和bax基因mRNA的表达。结果　胃粘膜肠化 (5 3.3% )和异型增生 (70 % )组bcl 2mRNA表达阳性率显著高于浅表性胃炎组 (10 % ) (P <0 .0 5 ) ,而慢性萎缩性胃炎 (5 0 % )和胃癌 (30 % )组bcl 2mRNA表达阳性率与浅表性胃炎组相比则无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;胃粘膜异型增生组bcl 2mRNA表达阳性率显著高于胃癌组 (P <0 .0 5 )。异型增生组baxmRNA表达阳性率 (6 0 % )显著高于浅表性胃炎组 (P <0 .0 5 ) ,而萎缩性胃炎(5 0 % )、肠化 (4 6 .7% )和胃癌 (33.3% )组baxmRNA表达阳性率与浅表性胃炎组 (10 % )相比无显著差异 (P >0 .0 5 )。Hp感染组胃粘膜bcl 2和baxmRNA表达阳性显著高于非Hp感染者 (P <0 .0 5 ) ;bcl 2和baxmRNA表达与HpCagA基因表达没有明显的相关关系 (P >0 .0 5 )。mtMSI(+)组bcl 2和baxmRNA表达阳性率与mtMSI(- )组相比无显著差异 (P >0 .0 5 )。结论　线粒体DNA核内整合可能在部分胃癌的发生中起重要作用 ;线粒体DNA核内整合与bcl 2和baxmRNA的表达无显著相关