MMP-2、MMP-9在高、低转移潜能乳腺癌细胞中的表达变化

目的 筛选高、低转移潜能的乳腺癌细胞亚系,研究基质金属蛋白酶-2(matrix metalloprotainese,MMP-2)、MMP-9在高、低转移潜能乳腺癌细胞的表达差异及其意义.方法 利用人乳腺癌细胞系MDA-MB-435s细胞在Transwell小室上连续穿透人工基质膜获得高、低转移潜能乳腺癌细胞株.用细胞侵...     

皮质肌动蛋白在不同转移潜能乳腺癌细胞中的表达及意义

目的筛选不同转移潜能的乳腺癌细胞亚系,并探讨皮质肌动蛋白(cortactin)在乳腺癌细胞增殖和侵袭过程中的作用。方法经过连续人工基质膜侵袭实验后获得高、低转移潜能的乳腺癌细胞亚系,通过透射电镜观察比较两系细胞的超微结构,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测两系细胞增殖能力,流式细胞仪检测两系细胞周期,Transwell侵袭小室模型比较两系的迁移能力。应用免疫细胞化学法、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹分析法检测cortactin蛋白在两系细胞中的表达。结果利用人工基质膜侵袭实验筛选出高、低转移潜能乳腺癌细胞亚系,并且两系细胞形态上无明显差异。MTT实验显示高转移潜能细胞体外生长速度显著快于低转移潜能细胞(P0.05)。流式细胞仪检测结果显示,高转移潜能细胞亚系与低转移潜能细胞亚系相比,G0/G1期细胞前者比后者少[(52.67±3.69)%vs(64.46±2.79)%],而S期细胞前者比后者多[(30.53±6.19)%vs(24.63±2.04)%]。高转移潜能细胞亚系增殖指数(PI)高于低转移细胞亚系[(47.32±3.69)%vs(35.53±2.80)%,P0.05],侵袭能力显著强于低转移潜能细胞亚系[(61.46±7.08)vs(25.32±4.87)个/视野,P0.05]。免疫组化、RT-PCR和蛋白质印迹分析均显示在高转移潜能细胞亚系中cortactin在基因和蛋白水平的表达均高于低转移潜能细胞亚系(P0.05)。结论 Cortactin的过表达与乳腺癌的增殖和转移过程密切相关。     

CXCR4在不同转移潜能肝癌细胞中的表达及意义

  目的研究趋化因子受体CXCR4在高、低转移潜能肝癌细胞中的表达,并探讨其在肝癌细胞增殖和侵袭转移过程中的作用。方法 利用3B肝癌细胞株对人工基底膜穿透能力的差异获得不同转移潜能肝癌细胞亚系,并通过transwell小室侵袭实验比较两细胞亚系的侵袭能力从而对其进行验证, 应用RT-PCR和Western Blot检测CXCR4在两细胞亚系中的表达。CCK8法检测两细胞亚系生长曲线和倍增时间,流式细胞仪检测两细胞亚系细胞周期和凋亡率。结果成功筛选出高、低转移潜能肝癌细胞亚系,并通过transwell小室侵袭实验证实高转移潜能肝癌细胞的侵袭能力高于低转移潜能肝癌细胞;RT-PCR和Western Blot均显示高转移潜能肝癌细胞在基因水平和蛋白水平的CXCR4表达均显著高于低转移潜能肝癌细胞;且两细胞亚系体外生长速度、倍增时间、细胞周期和凋亡率均具有明显差异。结论上述结果表明CXCR4在肝癌进展中发挥了重要的作用,可能为未来肝癌的诊疗提供理论依据。     

高侵袭力及稳定高表达增强型绿色荧光蛋白的膀胱癌细胞株的建立

目的:建立具有高侵袭力及稳定高表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的膀胱癌细胞株. 方法:通过构建侵袭小室,以穿透人工基底膜、聚碳酸脂膜能力为依据,筛选从人膀胱癌细胞系EJ中筛选具有体外高侵袭能力的膀胱癌细胞亚系(EJ-m3).用pEGFP-C1转染人膀胱癌细胞系EJ及其高侵袭力亚系,经G418抗性筛选和96孔板有限稀释获得稳定高表达EGFP的单克降细胞株.并用流式细胞术检测EGFP表达率,通过细胞周期、生长曲线和体外侵袭实验,对转染和未转染EGFP的细胞生物学行为进行综合分析. 结果:筛选出了具有高侵袭力的膀胱癌细胞EJ-m3,并获得了稳定高表达EGFP的细胞株EJ- GFP和EJ-m3-GFP.该两株细胞EGFP的表达率均为99.9%,增殖指数、生长曲线和体外侵袭力与未转染前相似(P>0.05). 结论:用改良侵袭实验筛选膀胱癌细胞系的高侵袭力亚系的方法是可靠的.转染EGFP的细胞其生物学行为并未发生改变.所获得的具有高侵袭力和稳定高表达EGFP的膀胱癌细胞为膀胱癌侵袭及转移的研究提供了良好的实验平台.     

Paxillin在高、低转移潜能乳腺癌中的表达及意义

目的 研究paxillin在人高、低转移潜能乳腺癌细胞亚系中的表达以及对肿瘤转移、黏附的影响.方法 以乳腺癌细胞系MDA-MB-435S为研究对象,利用细胞穿透人工基底膜能力的差异筛选出高、低转移潜能的乳腺癌细胞系,利用免疫组化、免疫印迹(Western blot)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测paxillin在高、低转移潜能乳腺癌细胞中的表达.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞黏附率.结果 免疫组化、Western blot、RT-PCR检测显示在高转移潜能乳腺癌细胞中paxillin在基因和蛋白水平的表达均高于低转移潜能乳腺癌细胞,差异具有统计学意义(P均＜0.01).MTT法检测高转移潜能乳腺癌细胞的黏附率高于低转移潜能乳腺癌细胞,差异具有统计学意义(P＜0.01).结论 Paxillin在人乳腺癌转移和黏附过程中发挥重要作用,可能成为抑制肿瘤增殖和转移的关键性分子.     

不同转移潜能骨肉瘤细胞株的建立与生物学性质的分析

目的:获得不同转移潜能的骨肉瘤细胞株. 方法:从我室建立的人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607中通过有限稀释法获得不同的单细胞克隆,经过侵袭试验初筛后获得5株转移潜能不同的细胞株,再通过裸鼠体内连续传代法筛选出具有不同转移能力的细胞系.并利用细胞生长曲线测定,软琼脂克隆形成试验,流式细胞仪,裸鼠体内自发转移试验分析了他们的生物学性质. 结果:获得两株转移潜能不同的骨肉瘤细胞株.其中,H9为具有低转移潜能的骨肉瘤细胞株, E10为具有高转移潜能的骨肉瘤细胞株,其染色体众数分布特征与母系SOSP-9607基本相似,保持人类染色体核型;所至皮下移植瘤及肺转移瘤均符合人成骨肉瘤组织学特征,它们具有差异明显的体外生长速度,软琼脂克隆形成率H9(22±5)明显高于E10(98±12) ,裸鼠体内试验性自发肺转移率分别为10%和100%,流式细胞仪测定H9和E10的S期细胞分别为16.8%和21.0%. 结论:这两株细胞株来源于同一亲本,他们之间的差异集中在转移表型上,为今后利用分子生物学的方法筛选出转移相关基因从而为成骨肉瘤的转移机制及临床研究奠定基础.     

人卵巢癌3AO细胞不同转移潜能克隆株的建立

目的:建立不同转移潜能的卵巢癌克隆细胞株。方法:通过克隆技术和细胞电泳,从卵巢癌细胞系3AO中筛选出3个电泳率差异较大的克隆亚系(A1、A5和A11)。并通过生长曲线、软琼脂集落形成实验、移动实验、体外侵袭实验,比较它们的生物学特性及其侵袭转移能力。结果:A1的电泳速度最快, 为(15.30±0.67)μm/s,细胞群体倍增时间为20.55 h,软琼脂集落形成数及侵袭人工基底膜的细胞数多于其他两者,为高转移潜能克隆株。A11的电泳速度为(6.20±0.72)μm/s,群体倍增时间为38.48 h,软琼脂集落形成数及侵袭人工基底膜的细胞数少于其他两者,为低转移潜能克隆株。结论:此异质性克隆系统来自同一肿瘤母系,遗传背景相似,却具有不同的转移潜能,为研究肿瘤转移机制和克隆肿瘤转移相关基因提供了良好模型。     

B16M高低转移株的筛选及其生物学异质性的分析

目的 筛选B16M高低转移株,以探讨B16M的转移异质性及机制.方法 通过B16M自发肺转移模型筛选出转移性能不同的细胞株,并用实验性和自发性肿瘤转移模型验证其在体内生长、转移性. 通过细胞增殖、3H-TdR参入实验、流式细胞技术、细胞侵袭离散实验研究了高、低转移B16M细胞株体外增殖能力、侵袭能力以及对离散因子的反应的差异,Western印迹实验研究细胞c-met表达及活化水平. 结果在所筛选出的3株可疑高转移B16M细胞株中,H3 B16M细胞接种于同系C57BL/6小鼠体内所形成的原发瘤重量、实验和自发性肺转移结节数明显高于其他细胞株;该细胞株增殖能力、侵袭性及对离散因子的反应能力的也明显高于其他细胞株.c-met表达及磷酸化水平也升高.结论成功的筛选出B16M 高、低转移细胞株,两者在细胞增殖、侵袭能力、离散能力等方面有差别.这种差异可能与c-met有关.     

具有不同转移潜能的大鼠舌鳞癌细胞系分离鉴定

目的获得高转移舌鳞状细胞癌细胞,为建立高转移舌癌动物模型奠定基础。方法采用改良侵袭实验筛选出高低不同的转移潜能细胞。采用MTT实验和平板克隆实验检测两种细胞的克隆差异;采用侵袭实验和迁移实验检测两种细胞侵袭和迁移差异;采用流式细胞仪检测两种细胞生长周期的差异;采用Western Blot和Real-time PCR方法检测两种细胞Zeste基因增强子同源物2（EZH2）蛋白和mRNA表达差异。结果分离出两种不同转移潜能细胞。两种细胞的克隆形成、侵袭和迁移、细胞周期、EZH2蛋白和mRNA表达差异均有显著性（t=3．423～59．300,P〈0．05、0．01）。结论从舌鳞癌细胞系中分离得到了两种不同转移潜能的细胞亚群,且两种细胞具有不同的生物学特性。     

KiSS-1基因对卵巢癌细胞HO8910生物学行为影响的实验研究

目的探讨肿瘤转移抑制基因KiSS1对卵巢癌细胞株HO8910生物学行为的影响。方法含有人KiSS1基因全长cDNA的重组真核表达载体pcDNA3KiSS-1经酶切和测序鉴定正确后,转染卵巢上皮癌细胞株HO8910,观察其KiSS1mRNA表达、细胞生长及增殖能力和细胞侵袭力的变化。结果pcDNA3KiSS1成功转染HO8910细胞,KiSS1mRNA表达阳性,而亲本HO8910细胞为阴性。转染目的基因后细胞生长曲线、软琼脂克隆形成率等与未转染之细胞无显著性差异(P>0.05),但细胞侵袭能力明显下降(P<0.01),穿透Matrigel膜细胞数较未转染组明显减少(P<0.01)。结论KiSS1基因对卵巢上皮癌细胞HO8910的生长、增殖能力无影响,但可抑制其侵袭能力。     

JAK激酶抑制剂AG490对乳腺癌细胞侵袭转移的影响

目的研究JAK激酶抑制剂AG490对乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭转移的影响,探讨JAK-STAT3信号转导通路在乳腺癌侵袭转移调控中的作用。方法以乳腺癌细胞MDA-MB-231为研究对象,应用JAK激酶抑制剂AG490处理细胞,用MTT法检测细胞对人工基底膜的粘附能力变化;Transwell小室进行人工重组基底膜侵袭和运动实验;Western blot检测细胞中P-STAT3水平。结果JAK激酶抑制剂AG490可使人乳腺癌细胞MDA-MB-231中P-STAT3表达减弱,同时可使细胞粘附、侵袭、迁移能力下降。结论JAK-STAT3信号转导通路参与乳腺癌细胞侵袭转移调控,阻断通路活化可以抑制乳腺癌细胞的侵袭转移。     

shRNA-CXCR4对人乳腺癌细胞侵袭力的影响

目的 研究重组质粒shRNA-CXCR4对人乳腺癌细胞侵袭潜力的影响. 方法通过构建重组质粒shRNA-CXCR4沉默CXCR4基因后,运用RT-PCR,Western-blot检测3株人乳腺癌细胞的CXCR4 mRNA及其蛋白的表达;建立体外侵袭模型,测定人乳腺癌细胞株穿透Matrigel的潜力.结果 质粒shRNA-CXCR4作用于3株人乳腺癌细胞后能明显抑制其CXCR4基因的mRNA及蛋白表达水平(P<0.05);3株人乳腺癌细胞穿透Matrigel的能力明显降低(P<0.05).结论 shRNA-CXCR4后能明显降低人乳腺癌细胞的侵袭潜力.     

miR-126在人结肠癌细胞中的表达及其对结肠癌细胞生物学行为的影响

目的探讨MicroRNA-126(miR-126)在人结肠癌细胞中的表达以及对结肠癌细胞生物学行为的影响。方法应用荧光PCR定量检测60例结肠癌患者的结肠癌组织以及癌旁组织中miR-126的表达,共60对,再测定5株结肠癌细胞(SW480、HT29、HCT116、LOVO、SW620)中的表达情况;CCK-8法、划痕实验和Transwell实验检测细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并进一步通过体外实验研究miR-126对结肠癌细胞生物学行为的影响。结果与癌旁组织细胞比较,miR-126在结肠癌细胞中表达下降(95.0%vs.55.0%,P<0.05),发生转移者与未发生转移者比较,差异有统计学意义(25.0%vs.75.0%,P<0.05)。miR-126可以抑制SW480细胞的生长及其侵袭转移,有基质胶Tran—swell实验中,转染组及空白对照组细胞迁移数分别为(10.0±4.3)个和(258.0±30.6)个;无基质胶的Transwell实验中,分别为(84.0±13.2)个和(335.0±27.3)个,差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-126高表达可以增强癌细胞对奥沙利铂的敏感性。结论miR-126可明显抑制结肠癌细胞的发生发展,影响多种结肠癌细胞株生物学行为。     

胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803的细胞周期分布及侵袭能力之比较研究

目的体外培养胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803,并比较两种细胞周期分布情况及侵袭能力。方法采用流式细胞术观察两株细胞的周期分布情况;采用涂有Matrigel胶的Transwell小室对胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803进行体外侵袭实验,通过检测穿过小室的相对细胞数量比较两株细胞的侵袭能力。结果SGC-7901在G0/G1期、S期、G2/M期的分布百分比分别为(63.74±3.40)%、(30.23±2.70)%、(6.03±0.70)%;MGC-803在G0/G1期、S期、G2/M期的分布百分比分别为(62.94±6.13)%、(28.67±7.76)%、(8.39±1.69)%,两胃癌细胞株对应的周期时相分布百分比差异无统计学意义(P>0.05);检测SGC-7901和MGC-803穿过涂抹有Matrigel胶的聚碳酸酯膜的细胞数分别为65.67±6.03和94.5±3.68,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 MGC-803细胞的侵袭能力明显强于SGC-7901,而两株细胞在对应的周期时相分布情况则无明显差异。     

特异性siRNA沉默TDGF-1基因表达对乳腺癌细胞迁移侵袭的影响

目的 探讨RNA干扰（RNA interference,RNAi）沉默TDGF-1基因表达对乳腺癌细胞侵袭的影响.方法 根据TDGF-1基因序列特点设计3个小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）后,转染人乳腺癌MDA-MB-468细胞,用荧光实时定量RT-PCR筛选出效果最好的siRNA.以该siRNA转染处理乳腺癌MDA-MB-468细胞后,分别采用实时定量RT-PCR和western blot检测TDGF-1基因mRNA和蛋白水平,以划痕试验方法评测癌细胞迁移能力;用Boyden模型观察癌细胞侵袭能力.结果 根据TDGF-1基因序列特点设计的3个siRNA均能抑制TDGF-1基因mRNA水平,以S1效果最好.S1 siRNA转染组TDGF-1 mRNA和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性（P＜0.001,P＜0.001）.体外试验发现,TDGF-1 siRNA转染可有效抑制乳腺癌细胞集落生长、侵袭和迁移能力,且与浓度相关（P＜0.005,P＜0.005,P＜0.005）.结论 TDGF-1在乳腺癌细胞迁移、侵袭中起着重要的作用;采用TDGF-1 siRNA转染可抑制乳腺癌细胞侵袭.     

乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭转移中JAK抑制对ERK的作用及意义

目的:研究JAK激酶抑制剂AG490对乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)磷酸化的影响,探讨JAK激酶对ERK信号转导通路的作用以及在乳腺癌细胞侵袭转移中的调控意义.方法:以JAK激酶抑制剂AG490处理乳腺癌细胞MDA-MB-231,MTT法检测AG490对细胞的生长抑制作用;MTT法检测AG490处理后细胞对人工基底膜Matrigel的黏附能力变化;Transwell小室进行人工重组基底膜侵袭和迁移实验,检测AG490处理后细胞侵袭、迁移能力变化;Western印迹法检测AG490处理后细胞中磷酸化ERK(P-ERK)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白水平变化.结果:应用JAK酶抑制剂AG490后MDA-MB-231细胞生长受到抑制,作用呈时效-量效依赖关系;MDA-MB-231细胞黏附、侵袭、迁移能力降低,同时细胞中P-ERK、MMP-9蛋白减少.结论:JAK激酶可以通过改变ERK的磷酸化水平影响ERK信号转导通路的活化.JAK激酶抑制对ERK信号转导通路的激活有阻断作用,可以抑制MMP-9的表达及乳腺癌细胞的侵袭转移.