抗小鼠TLR2胞外段单表位抗体TSP-2对OVA诱导的小鼠过敏性哮喘气道炎症的影响

目的观察抗小鼠TLR2胞外段单表位(mTLR2ECD)抗体(TSP-2)对OVA诱导的小鼠过敏性哮喘气道炎症的影响。方法用肺泡灌洗、组织切片及特异染色、免疫组化、ELISA法检测TSP-2对小鼠哮喘模型的气道炎症和炎症细胞的浸润以及肺组织中肺泡及支气管结构的影响。结果发现静脉给予抗体TSP-2能有效抑制气道炎症和炎症细胞的浸润。主要表现在肺泡灌洗液中的白细胞浸润减少、减轻血清中OVA特异性IgE抗体的降低以及抑制OVA诱导的小鼠肺泡毛细血管充血水肿等病理变化。结论抗体TSP-2对过敏性哮喘的病理变化有一定的抑制作用。     

抗小鼠TLR2胞外段单表位抗体TSP-2对酵母多糖诱发小鼠腹膜炎的影响

目的 观察抗小鼠TLR2胞外段(mTLR2ECD)单表位抗体TSP-2对酵母多糖诱发的小鼠腹膜炎的主要作用.方法 用腹腔灌洗、细胞计数及特异染色、免疫组化、ELISA 等各种方法检测了抗体TSP-2对模型动物的扭身次数、腹腔灌洗液的伊文思兰渗出、腹腔白细胞浸润的数量变化、腹腔肥大细胞脱颗粒情况以及腹腔灌洗液离心上清中PAF和TNFa水平的影响.结果 与PBS处理组和正常兔IgG组相比,抗体TSP-2能促使小鼠因腹腔炎症引起的扭身次数减少,腹腔灌洗液中伊文思蓝OD值降低,腹腔灌洗液中白细胞渗透减少以及C48/80诱导的腹腔肥大细胞脱颗粒降低.结论 抗体TSP-2可能通过对肥大细胞脱颗粒的抑制作用减轻酵母多糖诱导的小鼠腹膜炎炎症症状.

Abstract：

Objective To observe the effect of the antibody TSP-2 against a single epitope of mouse Toll-like receptor 2 extracellular domain (mTLR2ECD) on the inflammation in mice with zymosan A-induced peritonitis. Methods In mice with peritonitis induced by intraperitoneal injection of zymosan A, pretreatments with PBS, normal rabbit IgG and TSP-2 antibody at two different doses (2.5 and 5.0 mg/kg) were administered via the tail vein. Six hours after intraperitoneal injection of zymosan A, Evans blue was injected through the tail vein, and the frequency of writhing of the mice within 20 min were recorded. The mice were then sacrificed for peritoneal lavage, and the lavage fluid was collected to assess the exudation of Evans blue in the supernatant. The peritoneal leukocyte count, mast cell degranulation and release of such inflammatory mediators as platelet activating factor (PAF) and tumor necrosis factor-a (TNFa) in the lavage fluid were observed by cell counting, specific cell staining, immunohistochemistry and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results Compared with PBS or rabbit IgG groups, TSP-2 treatment resulted in significantly reduced writhing response of the mice and lowered Evans blue exudation and leukocyte count in the peritoneal lavage, with also decreased degranulation of the mast cells induced by C48/80. Conclusion TSP-2 antibody against a single epitope of mTLR2ECD inhibits the inflammatory response in mice with zymosan A-induced peritonitis.     

抗小鼠TLR-2胞外段B细胞识别表位抗体抑制肉瘤生长的初步研究

目的 观察抗小鼠TLR-2胞外段B细胞识别表位抗体对小鼠肉瘤S180生长的影响。方法 在对小鼠Toll样受体2(mTLR-2)B细胞优势表位预测的基础上,合成B细胞识别表位20mer短肽,将其与载体蛋白偶联,制备免疫原。所得兔抗mTLR-2胞外段B细胞识别表位多克隆抗体TSP-1纯化后,采用Westernblotting、免疫组织化学和流式细胞仪进行初步鉴定。小鼠肉瘤株S180细胞注射小鼠左后肢,其中实验组混合100μg纯化抗体TSP-1,无关免疫球蛋白对照组混合100μg正常兔IgG,空白对照组仅接种S180。小鼠经麻醉分别于10、14、18d处死,称量瘤质量并计算抑瘤率。结果 Westernblotting显示在相对分子质量约95000处可见清晰的反应条带;免疫组织化学和流式细胞术检测显示抗体可与表达天然mTLR-2的J774A.1细胞反应;实验组小鼠肉瘤生长明显受到抑制,其瘤质量在10、14、18d与对照组相比差异显著(P<0.05);抑瘤率分别为77%、51%和53%。结论 局部应用抗mTLR-2胞外段B细胞识别表位抗体可抑制小鼠肉瘤S180生长,且表现在肿瘤生长的早期。     

不同强度热休克处理对小鼠肥大细胞瘤细胞P815细胞内Qa-1表达的影响

目的：研究热休克处理小鼠肥大细胞瘤细胞P815对细胞内Qa-1表达影响。方法：将体外培养的小鼠肥大细胞瘤细胞P815分为对照组及热休克组（3个温度）,共4组：对照组细胞置于37℃的水浴箱中1h,而后将细胞正常培齐4 h;热休克组细胞分别置于41℃、42℃和43℃的水浴箱中1h,然后恢复至37℃、RT-PCR及流式细咆技术检测分析细胞内Qa-I mRNA及蛋白水平。结果：热休克可引起小鼠肥大细胞瘤细盹P815胞内Qa-1的mRNA和蛋白水平明显升高,与对照组比较,差异均有统计学意义（均P〈0．05）,其中43℃热休克处理对Qa-1表达的诱导作用最强。结论：热休克可引起小鼠肥大细胞瘤细胞P815 Qa-1表达上调。     

3种细胞用于建立体外肥大细胞脱颗粒模型的比较研究及应用

【目的】比较3种肥大细胞(Ku812、RBL-2H3和P8l5细胞)激活后脱颗粒反应的差异,寻找适宜的肥大细胞脱颗粒体外检测模型,并利用该模型检测几种常见的中药注射剂(TCMI)以探讨肥大细胞体外研究过敏及类过敏反应的可行性。【方法】以10μg/mL C48/80激活细胞0～60 min,采用液质联用法(LC-MS)检测组胺释放量,比色法检测氨基糖苷酶释放率,中性红染色法进行形态学观察。【结果】C48/80刺激P815、RBL-2H3、Ku812细胞0～60 min后组胺释放率、氨基糖苷酶释放率和细胞脱颗粒率均有明显增加,且在相同刺激条件下,P815细胞活化后脱颗粒现象出现更早、程度更高(P<0.05)。故选择P815细胞对数种TCMI的致敏性进行体外检测,正常P815细胞出现较少脱颗粒现象,而清开灵、血塞通、双黄连、肿节风、香丹等注射液能显著引起细胞脱颗粒释放组胺。【结论】相对于RBL-2H3和Ku812细胞,P815细胞更适合作为一种早期、稳定、敏感的肥大细胞脱颗粒体外检测模型,其对几种常用TCMI的检测结果与临床报道有一定的相关性,P815细胞具有评价TCMI致过敏及类过敏反应的潜在应用价值。     

重组人TLR4胞外段对诱导分化成熟的U937细胞TNF-α分泌的影响

目的 观察重组人TLR4胞外段对诱导分化成熟的U937细胞TNF-α分泌的影响.方法 通过G418筛选稳定表达TLR4胞外段的HEK293细胞,用培养液上清作用于诱导分化成熟的U937细胞,通过ELISA观察该细胞TNF-α的分泌变化.结果 稳定表达TLR4胞外段的HEK293细胞培养液上清能减少诱导分化成熟的U937细胞TNF-α的分泌量(P＜0.01),并随剂量增加而降低.结论 表达的重组人TLR4胞外段能与诱导分化成熟的U937细胞表面的TLR4胞外段竞争性结合LPS,干扰LPS所引起的炎症信号转导,引起TNF-α分泌量降低.     

红树林淡紫拟青霉胞外多糖对小鼠DCs吞噬功能的影响

目的 探讨红树林来源的淡紫拟青霉胞外多糖对小鼠骨髓源性树突细胞(DCs)功能成熟的影响.方法 从小鼠骨髓腔中分离获得骨髓细胞,加入重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)诱导分化为未成熟DCs,用不同浓度淡紫拟青霉胞外多糖干预,流式细胞术检测DCs的表面标志CD11c、主要组合相容性复合体(MHCⅡ)类分子、CD80、CD86的表达情况及吞噬葡聚糖(FITC-dextran)的能力,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测该多糖对DCs Toll样受体(TLR)2 mRNA和TLR4 mRNA表达的影响.结果 经300、400 μg/mL多糖作用48 h后DCs表面分子CD11c、MHCⅡ类分子、CD80、CD86的表达较空白对照组显著上调(P＜0.01);经多糖作用的DCs吞噬FITC-dextran能力下降,尤其是300、400μg/mL的多糖与空白对照组相比作用效果明显(P＜0.05);另外,该多糖还可下调DCs TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表达,尤其经100～400μg/mL多糖处理的DCs下调作用显著,与空白对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 淡紫拟青霉胞外多糖可上调小鼠骨髓源性未成熟DCs表面CD11c、MHCⅡ类分子、CD80和CD86的表达,降低其吞噬能力,下调TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表达,初步表明该多糖可刺激DCs分化成熟.     

BALB/c小鼠肥大细胞瘤/白血病模型的建立

目的研究建立BALB/c小鼠肥大细胞瘤/白血病模型。方法 BALB/c小鼠尾静脉注入小鼠肥大细胞瘤P815细胞,实验按每只小鼠接种细胞数量分为1×107/只组、5×106/只组、2.5×106/只组、1×106/只组、5×105/只组、1×105/只组和溶剂(RPMI1640培养液)对照组。观察小鼠的生存状态、体重及肝肺脾(重量、形态、病理)、染色体、血涂片、骨髓涂片、白细胞及血小板计数。结果注入P815细胞≥1×106/只的所有组小鼠均死亡,<1×106/只的所有组生存良好,且死亡小鼠的生存时间与注入细胞数量呈负向依赖关系(P<0.05)。死亡组小鼠体重较注射前相当或减轻、肝肺脾重较对照组及未死亡组显著增加(P<0.05);肝质地变硬,表面可见大量大小不一的白色结节突起,部分脾肺可见出血梗死灶,病理示肝脾有大量异形肥大细胞瘤细胞浸润;脾细胞染色体分析可见肥大细胞瘤细胞的非正常染色体核型;白细胞和血小板计数较对照组降低(P<0.01),血涂片可见少量肥大细胞瘤细胞,骨髓涂片示骨髓原始细胞比例增高。结论 P815细胞通过静脉注射能使BALB/c小鼠形成肥大细胞瘤/白血病,可作为肿瘤实验研究的一种模型构建方法。     

抗小鼠TLR2胞外段单表位抗体TSP-2对小鼠溃疡性结肠炎肠黏膜细胞因子表达的影响

目的观察抗小鼠Toll样受体2(Toll-like receptor 2)胞外段单表位抗体TSP-2对溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜细胞因子表达的影响。方法采用硫酸葡聚糖钠(C6H7Na3O14S3,DSS)制备溃疡性结肠炎小鼠模型,将实验小鼠随机分成4组:正常对照(NC)组、模型(MD)组、TSP-2治疗组和正常兔IgG治疗组;除NC组外,其他组均给予5%DSS造模7 d后停用造模药,TSP-2治疗组和正常兔IgG治疗组给予相应药物后续干预治疗7 d。记录分析疾病活动指数(DAI),14 d后处死小鼠,取结肠行HE染色;实时荧光定量RT-PCR法检测白细胞介素(IL)-10、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6和IL-1βmRNA的表达,ELISA法测小鼠肠黏膜IL-10、IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白水平,并进行统计学分析。结果 TSP-2治疗组小鼠第10～14天DAI明显低于MD组(P<0.05);TSP-2治疗组肠黏膜IL-10 mRNA和蛋白的表达量均明显高于MD组(P<0.05);同时TSP-2治疗组肠黏膜TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA和蛋白的表达量均明显低于MD组(P<0.05);正常兔IgG治疗组与MD组比较,细胞因子检测数据差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 TSP-2可以提高抗炎细胞因子IL-10的水平并降低致炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平,通过抗炎和降低肠道过度的免疫反应,对溃疡性结肠炎发挥治疗作用。     

基于蛋白酶激活受体2表达研究药对防风-乌梅抗过敏的配伍机制

目的观察防风和乌梅配伍前后对肥大细胞脱颗粒以及蛋白酶激活受体2(PAR-2)表达的影响,为药对防风-乌梅抗过敏的研究提供实验依据。方法体外采用胰蛋白酶刺激小鼠肥大细胞株P815方法建立肥大细胞脱颗粒模型,运用RT-PCR、Western blotting、ELISA等技术,观察防风-乌梅配伍前后对肥大细胞分泌组胺、PAR-2 mRNA和蛋白表达的影响。结果防风-乌梅配伍后在体外抑制肥大细胞分泌组胺、PAR-2表达的作用明显增强,与细胞模型组比较有统计学差异(P0.05或P0.01)。结论防风-乌梅配伍后抑制脱颗粒作用明显增强,下调肥大细胞PAR-2表达可能是药对防风-乌梅抗过敏的配伍机制之一。     

草药复方Bresol？抵抗化合物48/80诱导的肥大细胞脱颗粒及组胺释放：促使肥大细胞稳定的一种非免疫机制

目的：研究一种草药复方制剂Bresol？对于肥大细胞脱颗粒以及组胺释放的保护作用。 方法：使用大鼠腹膜内肥大细胞,在体外经化合物48/80诱导肥大细胞脱颗粒及组胺释放,评估Bresol？稳定肥大细胞的作用。 结果：显微镜下正常对照组涂片显示较多完整的肥大细胞,有极少量的脱颗粒肥大细胞和微量的组胺释放。阳性对照组中用化合物48/80培养的肥大细胞出现了显著的肥大细胞脱颗粒现象以及高浓度的组胺释放。而100 mg/L浓度的Bresol？明显抑制了化合物48/80诱导的肥大细胞脱颗粒。此外,Bresol？可有效抑制化合物48/80诱导的组胺释放,且抑制效果与剂量有关。 结论：Bresol？能够在体外抑制化合物48/80诱导的肥大细胞脱颗粒和组胺释放。本研究的发现可解释Bresol？对多种过敏疾病有效可能是通过一种非免疫机制。     

中药注射剂致RBL-2H3细胞脱颗粒的研究

目的:探讨中药注射剂引起RBL-2H3细胞脱颗粒情况及其机制。方法:RBL-2H3细胞分别与阳性药物C48/80及15种中药注射剂作用,从形态学和超微结构观察、β-氨基己糖苷酶释放检测等方面研究RBL-2H3细胞脱颗粒情况。用WST-8法检测中药注射剂对RBL-2H3细胞和BRL细胞的细胞毒作用。结果:甲苯胺蓝染色和电镜观察细胞超微结构变化从形态学上证明中药注射剂引起RBL-2H3细胞脱颗粒。上清中β-氨基己糖苷酶释放率检测表明脉络宁、清开灵、参麦和痰热清注射液明显促进酶的释放,酶释放率在20%以上,与阴性对照组比较差异有显著性意义(P<0.05)。进一步的研究发现,痰热清注射液成分中的黄芩和生脉注射液成分中的红参、五味子与RBL-2H3细胞的脱颗粒有关。大部分中药注射剂致RBL-2H3细胞脱颗粒的作用与细胞毒作用相关,但有的中药注射剂致脱颗粒无细胞毒作用。结论:一些中药注射剂可致RBL-2H3细胞脱颗粒,中药注射剂中有的成分与RBL-2H3细胞脱颗粒相关;有的中药注射剂致RBL-2H3细胞脱颗粒与细胞毒作用有关,而pH和渗透压可影响细胞的脱颗粒。     

血塞通致RBL-2H3细胞与原代肥大细胞脱颗粒特性的比较

【目的】通过比较血塞通注射液等在类过敏试验中致RBL-2H3细胞与大鼠腹腔原代肥大细胞脱颗粒特性的异同,以评价2种细胞在中药注射液类过敏试验中的意义。【方法】选用已经明确能引起类过敏反应的3种供试品即血塞通注射液、Compound 48/80和吐温80,分别与RBL-2H3细胞和大鼠腹腔肥大细胞共同孵育1 h,通过β-氨基己糖苷酶释放率和组胺释放率、释放量等的检测,分析比较脱颗粒特性的异同,同时观察了不同浓度血塞通注射液对脱颗粒程度的影响。【结果】2种细胞在血塞通注射液、Compound 48/80和吐温80的直接刺激下均出现脱颗粒现象,脱颗粒程度与血塞通注射液呈剂量依赖性;原代肥大细胞β-氨基己糖苷酶释放率、组胺释放量和释放率均显著高于RBL-2H3细胞,2种细胞比较差异有统计学意义(P<0.01)。【结论】在类过敏反应脱颗粒试验中,RBL-2H3细胞和原代大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒具有相同趋势,均可用于中药注射液类过敏评价,RBL-2H3细胞应用方便,而肥大细胞更加敏感。     

HER2/neu动物模型的建立和免疫学鉴定

目的 建立表达人HER2／neu原癌基因的动物肿瘤模型并用免疫学方法加以鉴定。方法 将重组HER2／neu原癌基因真核表达载体转染P815细胞，有限稀释法筛选出稳定表达HER2／neu基因的P815肿瘤细胞株：用Western blot方法鉴定HER2／neu基因在P815细胞中的表达。在DBA／2小鼠体内建立表达HER2抗原的肿瘤动物模型，再通过表达HER2／neu基因的重组质粒免疫小鼠，诱导小鼠产生特异性HER2／neu基因特异的CTL应答，从免疫学方面鉴定HER2／neu动物肿瘤模型建立成功。结果 在体外获得了稳定表达HER2／neu基因的P815细胞株；免疫小鼠脾细胞中诱导出特异性CTL。结论 本研究成功建立了HER2／neu动物肿瘤模型，HER2／neu原癌基因DNA疫苗免疫可在体诱导特异性细胞免疫应答。     

HER2/neu诱导DBA/2小鼠特异性CTL应答及其抑瘤效应研究

目的：探讨HER2/neu原癌基因DNA疫苗免疫诱导特异性细胞免疫应答及其在体内的抑瘤效应。方法：将重组HER2/neu原癌基因真核表达载全转染P815细胞，用细胞组织化学及Western-blot方法鉴定质粒在细胞中的表达。在DBA/2小鼠体内构建表达HER2抗原的肿瘤动物模型，通过重组质粒免疫小鼠，诱导小鼠产生细胞免疫应答，观察免疫动物体内的抗瘤效应。结果：在体外获得了稳定表达HER2/neu基因的P815细胞；免疫小鼠脾细胞中诱导出特异性CTL，并杀伤HER2/neu阳性的P815细胞；荷瘤小鼠的肿瘤生长受抑，存活期延长。结论：HER2/neu原癌基因DNA疫苗免疫可诱导特异性细胞免疫应答，并具有一定抗瘤效应。     

TNF-α对肥大细胞IL-10、IL-12分泌和组胺释放的影响

目的:检测TNF-α对P815肥大细胞IL-10,IL-12分泌和组胺释放的影响。方法:P815肥大细胞培养后,用不同浓度的TNF-α单独或联合用TNF-α单克隆抗体激发肥大细胞,不同时间点收集上清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清中IL-10,IL-12和组胺水平。结果:单独作用时,TNF-α促进P815肥大细胞IL-12分泌,而对IL-10分泌和组胺释放无明显影响,TNF-α单克隆抗体的应用可以阻断TNF-α引起的肥大细胞IL-12分泌。结论:TNF-α可以通过促进肥大细胞分泌IL-12参与肥大细胞相关的炎症过程。