干细胞向胰岛细胞的诱导分化及其在实验性糖尿病治疗中的应用

胰岛移植是治疗糖尿病的一种有效方法，然而，供体的缺乏极大地限制了胰岛移植的临床应用。如何解决胰岛移植所需的细胞来源是当今医学研究的一个重要问题。虽然异种胰岛移植是一种可能的解决途径，但它所伴随的免疫排斥和病毒感染等问题至今还没有得到解决。干细胞具有自我增生的能力和分化成为各种组织细胞的潜能。通过体外培养干细胞并将其诱导分化成为胰岛的内分泌细胞，将有可能解决糖尿病治疗所需要的细胞来源。干细胞由于组织起源的不同在增生和分化能力上存在很大差别。将干细胞诱导分化成为胰岛的内分泌细胞并形成适合于细胞移植的胰岛样结构涉及到许多关键技术。虽然，国际上已经在此研究领域取得了一些令人鼓舞的研究结果，但将干细胞技术应用于糖尿病的治疗还有许多问题有待解决。本文就这方面的研究进展及有待解决的问题作一扼要的综述。     

胰岛干细胞研究的回顾与进展

胰岛细胞移植治疗糖尿病已受到供体不足的严重制约。科研人员多年来致力于胰岛干细胞的研究,希望通过胰岛干细胞的体外培养扩增及体内移植来解决胰岛细胞供应不足的问题,开辟了一条治疗糖尿病的新途径。要想进行胰岛干细胞的体外培养扩增及体内移植就必须首先明确胰岛干细胞的特异性标志物。其次要掌握将相关干细胞诱导分化为胰岛干细胞或胰岛素分泌细胞的方法和技术。     

胰岛移植及胰岛干细胞研究进展

本文综述了近年来胰岛移植相关研究的进展,包括胰岛的分离、纯化、培养、冷冻保存和免疫隔离;同时还介绍了胰岛组织干细胞以及诱导胚胎干细胞分化为胰岛的最新进展,在对胰岛移植治疗糖尿病的现状及研究发展趋势进行全面分析的基础上,笔者认为异体胰岛移植是当前I型糖尿病治疗的重要手段之一,而胰岛干细胞移植则是未来糖尿病治疗的趋势。     

干细胞向胰岛细胞的诱导分化及其在实验性糖尿病治疗中的应用

胰岛移植是治疗糖尿病的一种有效方法,然而,供体的缺乏极大地限制了胰岛移植的临床应用。如何解决胰岛移植所需的细胞来源是当今医学研究的一个重要问题。虽然异种胰岛移植是一种可能的解决途径,但它所伴随的免疫排斥和病毒感染等问题至今还没有得到解决。干细胞具有自我增生的能力和分化成为各种组织细胞的潜能。通过体外培养干细胞并将其诱导分化成为胰岛的内分泌细胞,将有可能解决糖尿病治疗所需要的细胞来源。干细胞由于组织起源的不同在增生和分化能力上存在很大差别。将干细胞诱导分化成为胰岛的内分泌细胞并形成适合于细胞移植的胰岛样结构涉及到许多关键技术。虽然,国际上已经在此研究领域取得了一些令人鼓舞的研究结果,但将干细胞技术应用于糖尿病的治疗还有许多问题有待解决。本文就这方面的研究进展及有待解决的问题作一扼要的综述。     

胰岛干细胞移植研究进展

随着细胞移植、免疫学、组织工程、分子生物学等相关学科的日益发展,胰岛干细胞研究为胰岛提供了来源,文中将就研究的现状、面临的问题及其可能解决途径等进行综述,认为胰岛干细胞移植是未来糖尿病治疗的趋势。     

胰岛干细胞分离及诱导分化的实验研究

目的①比较两种不同的分离方法在胰岛干细胞分离过程中的效果差异。②探讨维甲酸(Retinoic Acid)联合活化素A(Activin A)在胰岛干细胞诱导分化过程中的价值。方法随机分组比较麻醉状态下消化酶原位灌注法和离体机械消化法在胰岛干细胞分离过程中的效果差异;将分离出的胰岛干细胞进行贴壁培养,培养过程中加入维甲酸及活化素A做为实验组,取不加维甲酸﹑活化素A及加入高糖的培养液作为实验对照组,通过观察细胞生长状态及绘制细胞生长曲线来分析该处理因素对胰岛干细胞的影响,从而了解其在胰岛干细胞分离及分化过程中的价值。结果①麻醉状态下原位灌注消化法消化酶用量小,消化彻底,巢蛋白(Nestin)阳性细胞率高。②维甲酸联合活化素A明显地促进Nestin阳性细胞呈簇状生长,并形成类胰岛样细胞团;通过免疫组织化学染色鉴定发现胰岛样细胞团中心部位胰岛素抗体阳性细胞及周围区域胰高血糖素抗体阳性细胞数明显增多,通过记录类胰岛细胞团形成时间,维甲酸及活化素A组明显短于高糖组及空白组,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论胰岛干细胞分离过程中尽量减少对细胞的机械破坏,分化过程中联合应用维甲酸及活化素A明显地促进Nestin阳性细胞呈簇状生长,形成类胰岛样细胞团,为体外获得大量的胰岛细胞从而解决移植细胞来源的难题提供了可能。     

骨髓间充质干细胞诱导分化为胰岛细胞的研究进展

最近研究表明，无论同种异体还是自体胰岛细胞移植，均是治疗糖尿病（包括1型和部分2型）的一种有效方法。通过干细胞定向诱导分化，产生大量有功能的胰岛细胞，然后进行自体移植，这种方法已经成为临床研究治疗糖尿病的焦点。     

从胰岛移植到胰岛干细胞移植

糖尿病是由多种原因引起的胰岛β细胞功能减退或衰竭，导致胰岛素绝对或相对不足，机体出现糖代谢紊乱，进而造成全身多器官损害的一种疾病。其中，I型糖尿病患者终生需要依赖胰岛素治疗，给患者的生活带来极大的不便。借助于分子生物学技术，利用基因工程的方法，人们现在已经可以为糖尿病患者提供十分优质的胰岛素及其类似物，并在胰岛素输注技术上也有了全新的改观，     

胰岛干细胞治疗糖尿病新进展

糖尿病已成为继心血管疾病和肿瘤之后的第三大疾病 ,预计 2 0 0 5年全球将有 3亿患者。按病因学 ,糖尿病可主要分为 1型和 2型。治疗方案主要是药物和注射胰岛素 ,这给患者和社会带来沉重的负担 ,因此重建内源性胰岛分泌系统是多年来人们关注的热点 ,但无论是胰腺还是胰岛细胞的移植 ,均有两大难题 :供体的匮乏 ;免疫的排斥。干细胞的深入性研究 ,为胰岛移植提出新的材料来源。本文就胰岛干细胞在糖尿病治疗方面的优点、现状及发展趋势作一综述。1干细胞和胰岛干细胞1.1干细胞 (stemcell)　干细胞是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的…     

新鲜与短期培养胰岛细胞移植对移植胰岛存活的影响

目的 观察新鲜和短期培养后的小鼠胰岛细胞对移植后胰岛的再血管化及功能的影响.方法 C57小鼠作为胰腺供体,胆总管灌注胶原酶P溶液消化胰腺,Ficoll 400不连续梯度纯化获得胰岛细胞.接受不同胰岛细胞肾被膜下移植的受体糖尿病C57小鼠随机分成三组(n=10):A组接受新鲜胰岛细胞移植,B、C组分别接受培养1、3d的胰岛细胞移植.术后观察血糖变化并于移植后第14天取移植胰岛,分别进行HE染色和胰岛素、CD31免疫组织化学染色,并计算微血管密度.结果 胰岛细胞移植后3d内,三组小鼠的随机血糖浓度均＜11.0 mmol/L.A组小鼠在移植后第14天时的血糖浓度仍＜11.0 mmol/L,而B、C组小鼠血糖浓度在移植3d后呈现持续上升,此后各时间点的血糖浓度均显著高于A组,差异有统计学意义(P＜0.05).免疫组织化学胰岛素染色结果显示:A组小鼠肾被膜下成团的细胞被染成棕褐色,B、C组类似细胞团仅有少量着色.免疫组织化学CD31染色发现,A组小鼠肾被膜下移植细胞团内部有大量细胞胞质被染成棕黄色,而B组和C组仅有少量细胞着色;A组肾被膜下胰岛内微血管密度显著高于B、C组(P＜0.05).结论 小鼠新鲜胰岛细胞移植较短期培养后胰岛细胞移植更有利于移植胰岛的再血管化及存活.     

供体凋亡细胞输注对大鼠胰岛移植物功能的影响

目的 研究供体凋亡细胞预输注对大鼠胰岛移植后胰岛移植物功能的影响.方法 应用STZ制备SD大鼠糖尿病模型,以直线加速器照射诱导供体Wistar大鼠脾细胞凋亡.经阴茎背静脉输注供体凋亡脾细胞,7d后于糖尿病SD大鼠双侧肾包囊进行同种异体胰岛移植,通过测定血糖变化、血清胰岛素水平以及胰岛移植物存活时间来观察胰岛移植物的功能状态.结果 预输注供体凋亡脾细胞能显著延长同种异体胰岛移植物存活时间(中位生存时间达31 d),并较长时间地维持受体鼠血清胰岛素处于较高水平.结论供体凋亡细胞预输注能够显著延长同种异体胰岛移植物的存活时间,能够较长时间维持胰岛移植物的正常功能状态.     

ES细胞-D3诱生的胰岛素分泌细胞及其分泌的胰岛素降糖活性的研究

目的：探讨ES细胞-D3来源的胰岛素分泌细胞（IPCs）分泌的胰岛素的降糖活性及IPCs移植对糖尿病（DM）鼠的降糖作用。方法：ES细胞-D3培养于经处理的鼠胚成纤维细胞滋养层上保持未分化状态扩增,对数生长期时转入无血清含bFGF的DMEM诱导液进行诱导分化,使其分化为IPCs。于诱导的第21天,用ELISA法检测IPCs受高糖刺激2h后所分泌的胰岛素,同时将分泌的胰岛素静脉注射给小鼠,观察受鼠血糖的变化;将诱生的IPCs移植给链脲菌素（STZ）诱导的DM小鼠．观察受鼠血糖水平的改变。结果：ES细胞-D3体外诱导生成的IPCs所分泌的胰岛素具有降糖活性．且IPCs经两次移植给DM小鼠后第5天,血糖水平较移植前显著降低（P〈0．05）．第2次移植后第15天,受鼠血糖水平反弹到与移植前没有差别。结论：小鼠ES细胞-D3诱导生成的IPCs能够分泌有活性的胰岛素,且在一段时间内可显著降低DM受鼠的血糖。     

神经上皮干细胞粘附壳聚糖纤维生长分化的实验研究

目的 检测神经上皮干细胞与壳聚糖纤维的生物相容性,并探讨其在壳聚糖纤维材料上的生长、分化情况.方法 从胚胎神经管取材神经上皮干细胞,并与壳聚糖纤维进行体外共培养.采用MTT法检测细胞在壳聚糖纤维上的活性,采用光镜和扫描电镜技术观察细胞在壳聚糖纤维上的存活、生长状况,采用免疫细胞化学染色鉴定神经上皮干细胞的分化情况.结果 神经上皮干细胞可以贴附在壳聚糖纤维表面生长,并可分化为神经元和神经胶质细胞,细胞活性与单纯神经上皮干细胞培养组没有明显差别.结论 壳聚糖纤维与神经上皮干细胞有良好的生物相容性,二者在外周神经损伤的治疗中具有良好的应用前景.     

人胰岛的分离纯化和功能评价

目的 应用Ricordi人胰岛分离技术分离和纯化人的胰岛,并进行功能和安全性的评价.方法 获得6例成人尸体胰腺组织供体,采用胶原酶消化法及密度梯度离心法分离和纯化胰岛,并分析胰岛的数量、纯度和活力.采用免疫荧光法分析胰岛内分泌细胞的组成和分布;检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌和胰岛移植后的动物血糖水平.并对分离胰岛的安全性指标进行评价.结果 分离纯化后的胰岛数量为(22.9±3.1)万IEQ,纯度为(59.0 ±8.9)%,活力为(89.0±3.0)%.免疫荧光显示,胰岛由4种内分泌细胞组成并呈正常分布.葡萄糖刺激胰岛素释放的刺激指数为8.1 ±4.0.胰岛移植于糖尿病裸鼠后,血糖在3 d后降至正常水平并维持超过30 d.分离胰岛样本的各项安全性指标在规定范围之内.结论 采用Ricordi人胰岛分离技术分离和纯化的胰岛在形态、结构、数量、纯度、活力、体内外功能以及安全性方面都达到临床胰岛移植的标准,为开展临床胰岛移植奠定了基础.     

胰腺干细胞和胰岛细胞在糖尿病 大鼠治疗中的疗效观察

目的 探讨大鼠胰腺干细胞与胰岛细胞移植在大鼠糖尿病治疗中的疗效。方法 通过链脲菌 素复制1 型糖尿病大鼠模型并随机分为胰岛细胞组和胰腺干细胞组。用胶原酶V 分别消化新生和成年大鼠 胰腺,Percoll 梯度离心分离胰岛细胞和胰腺干细胞。采用Bonner-Weir 法诱导胰腺干细胞分化,DTZ 染色 检测移植物纯度,AO/PI 检测移植物活性。分别记录手术前后大鼠血糖水平、胰岛素水平及移植物存活时 间;高糖刺激实验和腹腔糖耐量评价移植物功能;取各组大鼠移植部位标本行HE 染色和免疫组织化学染 色,观察组织形态学变化。结果 胰岛细胞组和胰腺干细胞组血糖分别在术后3 和5 d 恢复正常（P <0.05）, 两组大鼠术后不同时间点的血糖有差异（P <0.05）,胰腺干细胞组的降糖能力强于胰岛细胞组（P <0.05）。 两组大鼠移植后7 d 血清胰岛素水平均较术前升高（P <0.05）。高糖刺激实验表明,各组移植后15 和65 d 高糖刺激后的C 肽水平较刺激前升高（P <0.05）,胰岛细胞组移植后65 d 高糖刺激后C 肽水平低于胰腺 干细胞组（P <0.05）,胰岛素和C 肽水平监测结果表明胰腺干细胞组移植物胰岛素分泌维持时间长于胰岛 细胞组。移植后腹腔糖耐量实验结果表明移植物均功能良好。胰岛细胞组和胰腺干细胞组移植物的中位 存活时间分别为73 和88 d,Kaplan-Meier 曲线分析提示胰腺干细胞组移植物生存时间较胰岛细胞组延长 （P <0.05）。HE 染色提示肝脏门静脉移植区域可见新生血管包绕的胰岛细胞团,免疫组织化学染色证实细 胞团胰岛素阳性。结论 胰腺干细胞分化后经门静脉移植能安全有效地发挥降糖作用,疗效优于胰岛细胞 移植。     

大鼠表皮干细胞的定位、分离和体外培养

目的：定位大鼠的表皮干细胞,探讨表皮干细胞分离和体外培养的方法。方法：用免疫组化法定位表皮干细胞。用胶原酶冷、温消化和胰蛋白酶联合消化新生鼠皮肤,获得单细胞悬液。选取在鼠尾胶原上快速贴壁的细胞为目的细胞,未快速贴壁的细胞为对照组,二者在相同条件下培养,适时传代,测定细胞克隆形成率．免疫学方法鉴定表皮干细胞。结果：毛囊隆突区细胞胞浆表达角蛋白15（K15）随年龄的增长,K15阳性细胞出现在毛母质细胞区和表皮基底层。体外培养的细胞能形成大克隆,克隆形成率为14．06％,传至第4代,细胞形态无明显改变,细胞浆内表达K15。结论：表皮干细胞位于毛囊隆突区,此研究所用的方法可以分离、纯化和培养表皮干细胞。     

GFP转基因鼠胚胎神经上皮 干细胞的体外培养

目的观察绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）转基因鼠来源的胚胎神经上皮干细胞体外增殖和分化的情况。方法将来源于孕11dGFP转基因鼠的胚胎神经上皮干细胞与普通大鼠神经上皮干细胞进行体外培养,比较二者克隆增殖、分化的状况。结果GFP转基因鼠胚胎神经上皮干细胞可在体外进行克隆增殖,并能分化为神经元和神经胶质细胞,与普通鼠神经上皮干细胞比较没有差异。结论GFP转基因鼠的胚胎神经上皮干细胞可在体外克隆及分化,并能稳定地表达绿色荧光蛋白。     

大鼠骨髓间充质干细胞与大鼠胰腺岛管上皮细胞间接共培养向胰岛细胞分化的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)在适当条件下体外分化胰岛素分泌细胞的可能性。方法分离大鼠BMSCs及大鼠胰腺导管上皮细胞分别培养,在大鼠BMSCs培养过程中加入大鼠胰腺导管上皮细胞培养基中的上清部分,双硫腙(DTZ)染色观察诱导后的细胞着色情况,培养7d后进行了反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测目的基因的表达情况。结果将BMSCs进行分离和纯化,培养至第4代第6天时细胞形态一致,呈"水草"样排列,大鼠胰腺导管上皮细胞表达CK-19;混合培养基诱导的BMSCsDTZ染色阳性,RT-PCR检测有胰腺-十二指肠同源盒基因(PDX-1)及胰岛素(Ins)表达。结论适当的培养环境下,大鼠BMSCs具有向胰岛素分泌细胞分化的能力。     

当归诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的：研究当归体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化的作用。方法：通过贴壁法分离大鼠MSCs，体外扩增培养。MSC用20μl当归注射液／ml含10％胎牛血清的L—DMEM为预诱导条件，预诱导24h后用当归注射液100μl/ml不含胎牛血清的L—DMEM进行诱导。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。当归诱导3h后大部分MSCs转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE及nestin呈阳性、GFAP性。结论:大鼠骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

小鼠胰岛α细胞的缺失对移植胰岛功能的影响

目的　探讨胰岛α细胞的丢失对胰岛素分泌功能的影响。方法　在人胰岛分离过程中 ,经胶原酶的过度消化造成胰岛周边α细胞缺失 ,用免疫组化及胰岛素 /胰高糖素含量分析予以证实。在体外 ,检测葡萄糖刺激引起的实验性糖尿病小鼠胰岛素的分泌 ;在体内 ,评价胰岛移植后对糖尿病小鼠血糖的调节 ,并研究胰高糖素对α细胞缺失胰岛功能的影响。结果　胶原酶的过度消化引起胰岛周边的α细胞丢失 ,使分离胰岛内胰岛素 /胰高糖素比值明显升高。与正常胰岛相比 ,α细胞缺失胰岛对葡萄糖刺激产生的胰岛素明显降低 ,胰岛素释放在正常胰岛和α细胞缺失胰岛分别为2 2 2 7uU/ml± 32 1uU/ml和 12 4 6uU/ml± 12 6uU/ml(P <0 0 1)。在体内 ,移植α细胞缺失的胰岛到糖尿病的C5 7/BL小鼠后不能有效地纠正动物的高血糖 ,胰岛移植后的平均血糖浓度在正常胰岛组和α细胞缺失胰岛组分别为 :8 9mmol/L± 1 98mmol/L和 2 1 3mmol/L± 2 2mmol/L(P <0 0 1) ,而给予外源性的胰高糖素可以在体外及体内明显改善α细胞缺失胰岛的胰岛素分泌功能。结论　胰岛α细胞的缺失明显降低胰岛的胰岛素分泌功能 ,用外源性的胰高糖素可以改善α细胞缺失胰岛的胰岛素分泌功能。