甲基硝基亚硝基胍对日本血吸虫成虫培养细胞磷酸酶影响的研究

目的 研究甲基硝基亚硝基胍（MNNG）对日本血吸虫成虫培养细胞碱性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）活性的影响。方法 将虫龄26d的日本血吸虫成虫细胞接种于小盖玻片上，在RPMI－1640含20％小牛血清附加常量抗生素的常规培养基中培养第7天时，随机分为实验组和对照组，实验组用含浓度为3μg/mlMNNG的常规培养基处理48h，对照组用不含MNNG的常规培养基处理同样时间，随后换用常规培养基培养3周，当再换用含5％小牛血清的培养基培养1周时，分别用Gomori钙钴法和Gomori硫化铅法对两组培养细胞进行AKP和ACP细胞化学染色，用实验组培养细胞的AKP、ACP活性明显高于对照组培养细胞的活性（P＜0．01）。结论 MNNG能增强日本血吸虫成虫培养细胞AKP、APC的活力，对培养细胞有促生长或／或诱导其转化的作用。     

日本血吸虫成虫培养细胞骨架系统的研究

目的：研究日本血吸虫成虫培养细胞的骨架系统。方法：将日本血吸虫成虫细胞接种于小盖玻片上,以RPMI－1640含20％小牛血清附加常量抗菌素的培养基培养,用考马斯亮蓝染色法和魁笔环肽荧光染色法显示培养细胞骨架。结果：考马斯亮蓝染色显示日本血吸虫成虫细胞骨架呈网络状结构,均钭分布于胞质中;用（NH4）2SO4抽提后考马斯亮蓝色显示细胞骨架无明显改变;鬼笔环肽荧光染色后可见细胞内有均匀荧光亮点。结论：日本血吸虫成虫培养细胞骨架呈致密网络状结构,以中间纤维为主,缺乏粗大的微丝束。     

MNNG诱导日本血吸虫成虫培养细胞的扫描电镜观察

目的 观察甲基硝基亚硝基胍(MNNG)对不同培养时间日本血吸虫成虫培养细胞作用的变化，确定培养细胞发生转化进而增殖的最佳诱导时间。方法 将23～28d虫龄的日本血吸虫成虫制成细胞悬液，接种于小盖玻片上，培养于含20％小牛血清及常量抗生素的RPMI-1640常规培养基中。将接种培养第4、5、6、7、8d的细胞分别设为5个实验组及其相应的对照组。实验组用含终浓度为3μg／ml MNNG的常规培养基处理48h，对照组用不含MNNG的常规培养基处理相同时间，嗣后换用常规培养基培养4周，再改用含5％小牛血清的培养基继续培养。MNNG诱导后每周取各组培养细胞固定、制样，每组随机取3张小盖玻片进行电镜扫描观察，连续取样11周。结果 经MNNG诱导的日本血吸虫成虫培养细胞表面出现形态各异的结构，既有与对照组类似的表面较光滑和有乳突的培养细胞，也有表面光滑如玻璃珠状的细胞，还有具长纤突、微嵴、皱褶、微绒毛、蜂窝和仙人球状等形态的细胞；实验1组培养至第5周即出现大量分裂细胞。结论 MNNG诱导培养第4d的日本血吸虫成虫细胞培养至第5周可发生转化而出现分裂、增殖。     

MNNG诱导对日本血吸虫成虫培养细胞核仁组织区相关嗜银蛋白的影响

目的观察甲基硝基亚硝基胍（MNNG）诱导后日本血吸虫成虫培养细胞核仁组织区相关嗜银蛋白（Ag—NORs）含量的动态变化,探讨MNNG诱导后培养细胞的增殖能力。方法将日本血吸虫成虫细胞接种于小盖玻片上,置于含20％小牛血清附加常量抗生素的RPMI-1640常规培养基中培养;培养第4天,细胞随机分为实验组和对照组两组,实验组细胞以含3g／ml MNNG的常规培养基处理48h,对照组细胞则用不含MNNG的常规培养基作相同处理。细胞经彻底清洗后继续以常规培养基培养3周,然后换用含5％小牛血清的低血清培养基培养。MNNG处理后第1—9周,每周取实验组和对照组细胞采用略作修改的胶银法进行Ag—NORs染色,光镜下观察与拍照,HPIAS-2000图像分析仪测定代表培养细胞内Ag—NORs含量的吸光度（A）值,并进行统计学分析。结果培养过程中,对照组细胞着色逐渐变浅,MNNG组细胞除在第2周时着色变浅外,其余均逐渐加深,尤其在第6周（MNNG诱导后第5周）,细胞核呈深棕色,可见粗大的银染颗粒,核仁呈黑色,并观察到分裂细胞。第7—9周,两组细胞着色均逐渐变浅。定量分析发现,对照组细胞在培养初期Ag—NORs含量最高,随后逐渐降低;MNNG组的Ag—NORs含量在培养第2周时稍有降低,随后逐渐升高;在培养第6周即MNNG诱导后第5周时达到高峰,然后又逐渐下降。结论MNNG诱导可显著增强培养细胞的rDNA转录活性,提高细胞的分裂增殖能力,在MNNG诱导后第5周细胞增殖能力最强。     

MNNG诱导日本血吸虫成虫培养细胞的扫描电镜观察

目的　观察甲基硝基亚硝基胍 (MNNG)对不同培养时间日本血吸虫成虫培养细胞作用的变化 ,确定培养细胞发生转化进而增殖的最佳诱导时间。　方法　将 2 3～ 2 8d虫龄的日本血吸虫成虫制成细胞悬液 ,接种于小盖玻片上 ,培养于含 2 0 %小牛血清及常量抗生素的RPMI 164 0常规培养基中。将接种培养第 4、5、6、7、8d的细胞分别设为 5个实验组及其相应的对照组。实验组用含终浓度为 3 μg/mlMNNG的常规培养基处理 48h ,对照组用不含MNNG的常规培养基处理相同时间 ,嗣后换用常规培养基培养 4周 ,再改用含 5 %小牛血清的培养基继续培养。MNNG诱导后每周取各组培养细胞固定、制样 ,每组随机取 3张小盖玻片进行电镜扫描观察 ,连续取样 11周。　结果　经MNNG诱导的日本血吸虫成虫培养细胞表面出现形态各异的结构 ,既有与对照组类似的表面较光滑和有乳突的培养细胞 ,也有表面光滑如玻璃珠状的细胞 ,还有具长纤突、微嵴、皱褶、微绒毛、蜂窝和仙人球状等形态的细胞 ;实验 1组培养至第 5周即出现大量分裂细胞。　结论　MNNG诱导培养第 4d的日本血吸虫成虫细胞培养至第 5周可发生转化而出现分裂、增殖。     

大戟对血吸虫细胞鸟氨酸脱羧酶活性的作用

目的：通过观察大戟水提取液对日本血吸虫成虫细胞鸟氨酸脱羧酶活性的影响，研究其对该种细胞转化、增殖的作用。方法：在细胞接种1周后分别用浓度为10、20、30、40g/L的大戟水提取液处理24h ,然后用RPMI－1640加10％小牛血清的培养基培养。用分光光度法测定细胞鸟氨酸脱羧酶活性。结果：浓度为30g/L的大戟水提取液处理后第2、3周时细胞鸟氨酸脱羧酶活性显著增高。结论：大戟水提取液有一定促进日本血吸虫成虫细胞增殖的作用。     

EGF对用或未用MNNG诱导的日本血吸虫成虫培养细胞生长的影响

目的研究表皮生长因子(E GF)对用或未用甲基硝基亚硝基胍(MNNG)诱导的日本血吸虫成虫培养细胞的促生长、增殖作用.方法将联合法接种培养至第3天的日本血吸虫成虫培养细胞,一部分在含EGF终浓度分别为0、0.5、1、2、4、8、12、16、20、 24、28 ng/ml的附加20%小牛血清及常量抗菌素的RPMI-1640培养基中培养 ;另一部分,先用含MNNG终浓度为3 μg/ml附加20%小牛血清和常量抗生素的RP MI-1640培养基处理48h,再换用含终浓度分别为0、1、8、12、16、20 ng /ml的EGF培养基继续培养.每日用Olympus IM倒置显微镜观察细胞生长和增殖情况.结果两实验组中,用不同浓度EGF处理后的日本血吸虫成虫培养细胞均在2周以后出现不同程度的脱落、退化;并且,随着EGF浓度的升高, 培养细胞脱落、退化的现象更加严重;两实验组相比,未用MNNG诱导的培养细胞出现脱落和退化现象的时间比用MNNG诱导的相对更早.结论外加EGF对用或未用MNNG诱导的日本血吸虫成虫培养细胞的生长增殖均无促进作用,相反,加速了培养细胞的老化,尤其是对未用MN NG诱导的日本血吸虫成虫培养细胞,这种作用更加明显.     

EGF对用或未用MNNG诱导的日本血吸虫成虫培养细胞生长？…

目的 研究表皮生长因子（ＥＧＦ）对用或未用甲基硝基亚硝基胍（ＭＮＮＧ）诱导的日本血吸虫成虫培养细胞的促生长、增殖作用。方法 将联合法接种培养至第３天的日本血吸虫成虫培养细胞，一部分在含ＥＧＦ终浓度分别为０、０．５、１、２、４、８、１２、１６、２０、２４、２８ｎｇ／ｍｌ的附加２０％小牛血清及常量抗菌素的ＲＰＭＩ－１６４０培养基中培养；另一部分，先用含ＭＮＮＧ终浓度为３μｇ／ｍｌ附加２０％小牛血清和常     

MNNG对日本血吸虫成虫细胞鸟氨酸脱羧酶活性作用的初步研究

目的　观察 N-甲基 - N-硝基 - N-亚硝基胍 MNNG)诱导后日本血吸虫成虫细胞鸟氨酸脱羧酶 ODC)活性的变化。　方法　将日本血吸虫成虫剪碎后 ,收集成虫细胞 ,培养 1wk后依次用 3μg/ ml的 MNNG处理 4 8h,用 RP-MI- 16 4 0加 10 %小牛血清及常量抗生素的培养基清洗数次并继续培养。对照组不用 MNNG处理。分光光度法测定ODC活性。　结果　 MNNG诱导后第 2、3周 ODC活性显著增高。　结论　日本血吸虫成虫细胞内存在 ODC活性 ,MNNG具有增强 ODC活性的作用     

肝基质与MNNG对日本血吸虫成虫培养细胞糖细胞化学作用的研究

目的研究肝基质与甲基硝基亚硝基胍(MNNG)对日本血吸虫成虫培养细胞糖类物质的影响。方法日本血吸虫成虫细胞分别接种于普通小盖玻片(实验1组)和铺敷有肝基质的小盖玻片上(随机分为实验2组和3组),培养于含20%小牛血清及常量抗生素的RPMI-1640常规培养基中。培养第4d,实验1组和3组细胞分别在含3μg/ml MNNG的常规培养基中培养48h,彻底清洗后继续用常规培养基培养;实验2组细胞用不含MNNG的常规培养基处理相同时间。培养第4w,均换用含5%小牛血清的低血清培养基培养。培养第5~7w,每周取各组细胞进行高碘酸雪夫(PAS)染色和唾液淀粉酶处理后的PAS染色,观察培养细胞内糖类物质的含量及分布变化。取培养第6w(MNNG作用后第5w)的各组染色细胞,用HPIAS-2000图像分析仪测定细胞内代表糖含量的光密度,并作统计学分析。结果实验3组细胞与实验1、2组比较,PAS染色显示的四种类型细胞其着色均显著增强,淀粉酶处理后的PAS染色显示细胞内糖原含量增多,差异均具显著性(P<0.01)。培养过程中,第二类细胞数目逐渐增多,体积增大;分裂细胞增多。这种状况在MNNG处理后第5w最为明显。结论肝基质和MNNG联合可显著增强日本血吸虫培养细胞的糖代谢和分裂增殖能力,二者具协同作用能力。     

几种药物对体外培养日本血吸虫成虫毒性作用的研究

目的观察金诺芬、顺铂、阿霉素及化合物4N、H、B、O对体外培养日本血吸虫的毒性作用,以及对硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（TGR）活性的抑制作用。方法取日本血吸虫成虫置于RPMI 1640培养基中,培养30～60 min后,加入不同浓度药物,分别于6、24、48、72 h观察虫体活力、形态改变及死亡情况。随后换无药物的新鲜培养基,观察虫体活力的恢复情况,并计算药物半数致死剂量（LD50）。测定药物处理后的成虫匀浆上清液中日本血吸虫TGR的硫氧还蛋白原酶（TrxR）和谷胱苷肽还原酶（GR）的活性。结果 5μg/ml金诺芬作用24 h、20μg/ml 4N作用72 h、60μg/ml H作用72 h、80μg/ml顺铂作用72 h对日本血吸虫成虫致死率分别为100%、60%、66.7%、100%,LD50值分别为2.56、17.59、54.14μg/ml和52.87μg/ml,其他药物对日本血吸虫无作用。金诺芬、4N、顺铂、H对成虫的毒性作用具有不可逆性;金诺芬、顺铂对日本血吸虫的TGR酶活性有抑制作用,其他药物对TGR无作用。5～30μg/ml金诺芬、20～30μg/ml 4N、70～150μg/ml顺铂及60～150μg/ml H作用24 h均可使虫体形态发生改变。结论金诺芬、顺铂、化合物4N和H对体外培养的日本血吸虫成虫具有杀伤作用,其中金诺芬、顺铂杀伤日本血吸虫成虫的作用可能与其抑制TGR活性有关。     

日本血吸虫成虫培养细胞SDH和LDH细胞化学研究

目的　研究日本血吸虫成虫培养细胞琥珀酸脱氢酶 (SDH)和乳酸脱氢酶 (LDH)含量、分布及变化规律 ,了解日本血吸虫成虫培养细胞的能量代谢类型。方法　将虫龄 2 6d的日本血吸虫成虫细胞接种于小盖玻片上 ,培养于RPMI- 16 4 0含2 0 %小牛血清附加常量抗生素的培养基中 ,定时运用Pearson法进行SDH和LDH染色 ,用Olympus-BH2 显微镜观察并拍照 ,用HPIAS - 2 0 0 0图像分析仪测量其含量 ,并作统计分析。结果　日本血吸虫成虫培养细胞均具有SDH和LDH活性 ,两者均分布在细胞质内。培养 1d细胞的SDH和LDH活性最强 ,随着培养时间延长 ,其活性逐渐减弱 ,其中SDH活性下降较快 ,培养 5d大部分细胞SDH活性已极弱 ;而LDH活性下降则较缓 ,培养 5 6d细胞仍具LDH活性。结论　体外培养的日本血吸虫成虫细胞的能量代谢类型与成虫相似 ,既存在三羧酸循环需氧型呼吸链 ,也具有无氧糖酵解 ,但以无氧糖酵解为主。     

5-羟色胺体外对日本血吸虫母胞蚴

目的 研究5-羟色胺（5-HT）体外对日本血吸虫母胞蚴运动性和体长的影响,并筛选5-HT作用的最适浓度与时间。 方法 取感染6~8周日本血吸虫的小鼠肝脏,碾磨后沉淀,孵化收集毛蚴,于1/2 RPMI 1640培养基（含10%小牛血清和常量抗生素）中培养48 h。待毛蚴转化为母胞蚴后,将一部分母胞蚴分别培养于浓度为0、0.1、1、10、100和1 000 μmol/L的5-HT培养基中48 h,另一部分母胞蚴用10 μmol/L 5-HT分别培养0.16、6、24和48 h,测定母胞蚴的活动率、体长与琥珀酸脱氢酶活力。 结果 用不同浓度5-HT培养母胞蚴48 h,随着5-HT浓度的增加,母胞蚴的活动率及体长均逐渐增加,浓度为10 μmol/L时两者均达到最大,分别为（65.6±1.5）%和（131.4±9.2） μm。用10 μmol/L 5-HT培养时,随着培养时间的延长,母胞蚴的活动率、体长、琥珀酸脱氢酶活力均逐渐增加,24 h时活动率达最大,48 h时体长最长和琥珀酸脱氢酶活力最强。 结论 5-HT能显著影响体外培养的日本血吸虫母胞蚴的运动性和体长,其作用的适合浓度为10 μmol/L。     

肝基质对日本血吸虫培养细胞生长的影响

目的研究肝基质对日本血吸虫培养细胞形态、增殖的影响.方法联合法将虫龄为21 d的日本血吸虫童虫细胞接种于预先铺敷有肝基质(实验组)和未铺敷肝基质(对照组)的小盖玻片上,培养于常规培养基中,用高碘酸雪夫(PAS)法染色培养细胞,Olympus-BH2显微镜下观察并拍照;并将接种第3天的实验组和对照组培养细胞用胶银法进行核仁组织区相关嗜银蛋白(AgNORs)染色,HPIAS 2000图像分析仪测定AgNORs平均光密度值进行图像分析.结果实验组中的培养细胞其细胞质突起和分裂细胞增多,AgNORs的平均光密度值显著高于对照组细胞(P＜0.01).实验组的细胞分裂方式除常见的一分为二方式外,还观察到一分为三的多极分裂方式;而对照组未观察到分裂细胞.结论肝基质可明显影响日本血吸虫培养细胞的形态,显著促进培养细胞的增殖.     

日本血吸虫尾蚴细胞的传代培养及抗原性检测

目的 探索体外培养日本血吸虫尾蚴细胞的增殖与传代技术。 方法 无菌收集日本血吸虫活尾蚴5 000～10 000条,置于含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中,用组织刀快速割切尾蚴使成组织碎裂物,加入250 U蟹胶原酶在26℃下孵育30 min,然后离心去酶,加入含有青霉素(100 U/ml)、链霉素(O.1 mg/ml)、两性霉素B(0.25μg/ml)和适量促细胞生长物的RPMI 1640改良培养基中作原代培养,当贴壁细胞增殖长满瓶底时,以1:2的接种率进行传代培养;获取第5代培养细胞作ELISA检测血吸虫病患者血清中抗体。 结果 在原代培养的第3天可见尾蚴组织的周围有呈单个存在或索状排列的发亮细胞,第10天可见单层细胞形成,第14天贴壁细胞长满瓶底并作传代培养;在传代培养中可见细胞呈均匀生长,每7～14 d传代一次;用第5代培养细胞作抗原,检测31例患者的阳性率为90.3％,检测30名正常人血清的假阳性率为6.7％。 结论 日本血吸虫尾蚴细胞体外传代培养至第5代,可用于免疫学研究。     

正交试验法筛选日本血吸虫细胞的培养条件

目的　筛选日本血吸虫成虫细胞的培养条件及评价细胞培养条件优劣的指标。方法　以琥珀酸脱氢酶(SDH)、乳酸脱氢酶(L DH)和葡萄糖- 6 -磷酸脱氢酶(G- 6 - PDH )为指标,运用正交试验法进一步研究合成培养基、细胞外基质和血清浓度3个因素在3个不同水平对虫龄为2 1d的日本血吸虫细胞的影响。培养第5天对日本血吸虫培养细胞进行SDH染色;培养第14天分别进行L DH、G- 6 - PDH染色,Olympus- BH2 显微镜观察并拍照,HPIAS- 2 0 0 0图像分析仪测量其含量,用SPSS10 .0作统计分析。结果　不论以SDH或L DH,还是G- 6 - PDH为指标,均显示RPMI- 16 4 0含2 0 %小牛血清组成的培养基培养接种于肝基质上的日本血吸虫细胞,培养细胞的SDH、L DH、G- 6 -PDH活性最强。血清浓度对培养细胞酶活性的影响最大,其次是细胞外基质(ECM) ,影响最小的是合成培养基。其中,血清浓度对3种酶活性的影响差异均显著;基质对SDH、L DH活性的影响差异显著,而对G- 6 - PDH活性的影响差异不显著;合成培养基的影响均无差异。结论　RPMI- 16 4 0含2 0 %小牛血清组成的培养基培养接种于肝基质上的日本血吸虫细胞,培养细胞的SDH、L DH、G- 6 -PDH活性最强。选择3种酶中任一,均可用来评价日本血吸虫细胞培养条件的优劣。