重组酶介导扩增技术快速检测沙门菌方法的建立

目的采用重组酶介导核酸扩增方法(Recombinase aided amplification,RAA),建立沙门菌快速检测方法。方法根据沙门菌的inv A基因设计引物和探针,通过构建含目的基因片段的质粒分析RAA方法的灵敏度,通过检测大肠杆菌、志贺菌验证方法的特异性,并检测沙门菌阳性样本进行验证。结果建立的方法在39℃下进行,检测时间在20min以内,检测下限为102拷贝/μl,与大肠杆菌、志贺菌无交叉反应,特异性良好。结论建立的RAA检测方法具有快速、灵敏、特异以及操作简便等特点,适用于沙门菌的快速检测。     

重组酶介导扩增方法快速检测A族乙型溶血性链球菌

目的利用重组酶介导核酸扩增技术(RAA)建立快速检测A族乙型溶血性链球菌的方法。方法根据A族乙型溶血性链球菌细胞包膜蛋白酶A(Cep A)基因的保守序列设计引物和探针,通过构建含有目的基因片段的质粒分析方法的灵敏度,通过检测沙门菌、大肠杆菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌标准菌株分析方法的特异性。结果建立的RAA方法在39℃,短时间内(<20 min)完成检测,灵敏度为10拷贝/μl,与沙门菌、大肠杆菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌标准菌株无交叉反应,具有良好的特异性。结论建立的RAA方法速度快、特异性强、灵敏度高,适用于A族乙型溶血性链球菌的快速检测。     

甲型流感病毒的逆转录重组酶介导核酸扩增快速检测方法研究

目的利用逆转录重组酶介导核酸扩增技术(RT-RAA)建立检测甲型流感病毒的快速方法。方法通过使用逆转录酶,将甲流病毒RNA逆转录为cDNA,根据NCBI基因库中甲型流感病毒保守序列设计引物及探针,用cDNA作模板,进行RT-RAA检测甲型流感病毒;构建携带甲型流感病毒的质粒,检测已知样本,分析该方法的灵敏度和特异性。结果采用甲型流感病毒通用型引物和探针,能有效扩增出相应病毒的核酸,而对其他非甲流病毒无交叉反应;RT-RAA反应过程均在39℃恒温条件下完成,用时30min即可得到扩增结果,反应体系中最低扩增拷贝数为100copies。结论建立的RT-RAA检测甲型流感病毒方法灵敏度和特异性高,反应快速、操作简单,适用于甲型流感病毒通用型的快速检测。     

梅毒螺旋体重组酶介导扩增检测方法的建立

目的 建立梅毒螺旋体重组酶介导核酸扩增（RAA）快速检测方法。方法 根据梅毒螺旋体poly A基因序列设计引物和探针,通过引物组合优化,筛选建立梅毒螺旋体RAA检测方法,利用质粒标准品评估方法的灵敏度和重复性,检测HIV、HBV、HCV等血液传播疾病病原体,评价方法的特异性。结果 建立的梅毒螺旋体RAA方法的灵敏度可达10拷贝/反应,在最低检测限仍有较好的重复性,检测时间少于20 min,最快2～3 min即可观察到扩增信号,与HIV、HBV和HCV及正常血液样本无交叉反应。结论 建立的梅毒螺旋体RAA方法灵敏、快速、特异性好,适用于基层实验室和口岸现场快速检测梅毒螺旋体。     

乙脑病毒重组酶介导逆转录扩增检测方法的建立

目的 建立乙脑病毒重组酶介导逆转录核酸扩增（RT-RAA）快速检测方法。方法 根据乙脑病毒NS1基因片段设计引物和探针,通过优化筛选确定最佳引物组合,建立乙脑病毒RT-RAA检测方法,并对其检测灵敏度和特异性进行测试。结果 建立的乙脑病毒RT-RAA检测方法灵敏度可达10拷贝,方法检测时间少于20 min,最快2-3 min即可观察到明确荧光扩增信号,与登革病毒、黄热病毒、寨卡病毒、基孔肯雅病毒及正常血液样本无交叉反应。结论 建立的乙脑病毒RTRAA检测方法灵敏、快速、特异性好,适用于口岸现场乙脑病毒的快速检测。     

实时荧光重组酶介导核酸扩增在疟原虫快速检测中的应用研究

正疟疾是严重危害人类健康的全球性虫媒传染病之一,遍及全球90多个国家和地区,主要分布在热带和亚热带,世界上超过一半的人口生活在疟疾流行区[1]。据统计,疟疾每年感染数千万人,仅在非洲,每年有50万5岁以下儿童死于疟疾,已成为全球最重要的公共卫生问题之一[2]。疟疾的早期诊断和治疗是其防治的关键[3]。     

重组酶介导的扩增技术及活菌检测方法的应用研究进展

重组酶介导的扩增（recombinase-aid amplification,RAA）是一种新型等温体外核酸扩增方法,操作简单、反应效率高、灵敏度高。由于细菌死亡后其DNA在环境中可存在较长时间,利用RAA检测目标DNA片段极易产生假阳性结果,造成不必要的损失。因此,建立基于DNA扩增策略的活菌检测方法对食品加工、环境监测等多个领域具有重要意义。本文综述了RAA技术的原理及在病原微生物检测方面的应用,以及活菌检测技术的研究进展,以期为开发基于RAA技术的活菌检测方法提供理论指导。     

CRISPR - Cas13a结合重组酶介导的扩增快速检测副溶血性弧菌方法的建立

目的 将重组酶介导的扩增（RAA）技术与成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白13a（CRISPR - Cas13a）检测系统相结合,建立一种快速、灵敏、特异的副溶血性弧菌检测方法（RAA - Cas13a）。方法 样本DNA经RAA扩增后,产物采用CRISPR - Cas13a检测系统进行检测,比较CRISPR - Cas13a与琼脂糖凝胶电泳对RAA产物的检测敏感性。对方法进行灵敏度与特异度测试,通过临床样本检测比较建立的方法与real - time PCR法的一致性。结果 CRISPR - Cas13a对RAA产物的检测敏感性高于琼脂糖凝胶电泳法;建立的RAA - Cas13a方法检测副溶血性弧菌的灵敏度为10拷贝DNA分子/反应,与其他病原体之间无交叉反应,与real - time PCR对临床样本的检测阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）,二者的检测一致性较高（kappa = 0.934）。结论 建立的RAA - Cas13a方法具有快速简单、灵敏特异等优点,为副溶血性弧菌的快速检测提供了新的工具。     

应用直接重组酶聚合酶扩增技术快速检测烟曲霉菌

目的通过建立重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)直接检测标准烟曲霉菌株的方法,探讨其无需样本前处理的可行性。方法针对标准烟曲霉核酸序列保守区域设计RPA扩增引物,使用100、10~(-1)、10~(-2)、10~(-3)、10~(-4)、10~(-5)麦氏浊度的标准烟曲霉菌液作为无样本前处理组进行直接RPA扩增;同时,分别采用柱式法、磁珠法、氯化苄法提取烟曲霉菌DNA作为样本前处理对照组并进行RPA扩增,最后,应用2%琼脂糖凝胶电泳对产物进行分析。结果标准烟曲霉菌的100、10~(-1)、10~(-2)及10~(-3)麦氏浊度均可于39℃30min内扩增出目的条带;三种提取方法结果分别为:柱氏法(13.8±0.83)ng/μl,磁珠法(11.5±2.25)ng/μl,氯化苄法(64.9±1.31)ng/μl,三种方法均能扩增出目的条带,其中氯化苄法产出率较高(64.9±1.31)ng/μl。结论 RPA可以扩增出未经前处理(核酸提取)的样本,具有快速简便的优点,为检测烟曲霉菌提供了一个有效的工具。     

重组酶聚合酶扩增技术在病原体快速检测中的应用

重组酶聚合酶扩增(RPA)技术是一种新型核酸等温扩增技术,适用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等多个领域.传染病是人类健康的主要威胁,本文综述了RPA技术在寄生虫、细菌、病毒等传染病病原体快速检测中的应用,并对RPA技术应用提出建议.     

基于重组酶聚合酶扩增技术快速检测霍乱弧菌中SXT元件

目的 利用重组酶聚合酶扩增技术与测流层析相结合方法建立霍乱弧菌中SXT元件的快速检测方法。方法 基于SXT元件的保守区设计重组酶聚合酶扩增方法的引物及探针,评价该方法的特异度及灵敏度。结果 该方法可检测核酸浓度最低为20拷贝/μl,与实时荧光定量PCR方法的检测下限相近,且特异性较好。结论 该检测方法操作简单,特异性良好,敏感度高且无需大型精密实验设备,适合现场使用。     

重组酶介导的等温扩增法检测H7N9禽流感病毒

目的建立H7N9禽流感病毒一步法逆转录重组酶介导的等温扩增的检测方法(RT-RAA)。方法根据H7N9禽流感病毒HA片段和NA片段的保守区序列分别设计引物、探针,建立RT-RAA方法,研究其特异性、敏感性,并与Realtime RT-PCR方法进行比较。结果成功建立了H7N9禽流感病毒RT-RAA检测方法,H7反应体系和N9反应体系的最低检出限分别为10copy/μL和100copy/μL,且与其他呼吸道病原无交叉反应。H7N9RT-RAA体系检测结果与Real-time RT-PCR一致性较高,Kappa检验u系数为0.933。结论建立的RT-RAA检测方法具有快速、特异及灵敏的特点,为H7N9禽流感病毒的快速检测提供了新的分子工具。     

甲型流感病毒逆转录环介导等温扩增快速检测方法的建立

目的采用逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术建立了一种针对甲型流感病毒的特异、灵敏、快速、可视、简便的检测方法。方法根据甲型流感病毒M基因的保守序列,利用PrimerExplorer V4软件,设计了一套针对M基因的8个区域的5条特异性引物,优化了反应体系与扩增条件,并验证其特异性与灵敏性。结果该方法能检测出H1、H3、H5、H6、H7、H9亚型流感病毒,而对乙型流感病毒、人副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人冠状病毒、人偏肺病毒、人腺病毒、人博卡病毒均无扩增反应,其最低检测限度为50拷贝/μl。另外,扩增反应只需要40min就能判读结果,并可通过反应液是否有沉淀或向反应液中加入荧光染料来对结果进行可视化诊断。结论本研究建立的RT-LAMP检测方法具有高特异性、灵敏度、快速简便、可视化判读结果等优势,适合在基层进行甲型流感病毒的快速检测,并可以应用于大流感疫情的准确筛查。     

环境水体中沙门菌环介导等温扩增快速检测方法

目的 建立环境水体中沙门菌的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测方法.方法 以沙门菌的特异性基因(phoP)序列为靶序列,于63℃恒温条件下扩增1h,80℃灭活10 min,扩增产物通过肉眼观察即可判断检测结果.结果 该方法对超纯水加标水样中沙门菌的检测限可达3.07 fg/μl,对环境加标水样的检出限为2.39×10 cfu/ml.结论 该方法灵敏度高、耗时短、方法简便,适用于现场或者基层实验室进行环境水体中病原微生物的快速检测.     

环介导等温扩增法快速检测手足口病病原体

目的：建立逆转录（RT）-环介导等温扩增方法（LAMP）,以快速检测手足口病最重要的两种病原体：肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CA16）。方法：收集手足口病患儿咽拭子标本93份,针对EV71和CA16病毒的VP1基因特异性序列8个区域各设计6条LAMP引物,分别于63℃（EV71）、65℃（CA16A）扩增1 h,日光下观察结果,与实时荧光定量PCR比较检测特异性和敏感性。结果：EV71、CA16的LAMP最低检测限均为500拷贝/管,与对照病毒无交叉反应。93份标本中,RT-PCR方法检测显示EV71阳性44例,CA16阳性36例;RT-LAMP方法检测显示EV71阳性46例,CA16阳性36例,两种方法间比较差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论：应用RT-LAMP检测手足口病病原体EV71、CA16快速、灵敏、经济、特异性高,适合在基层医疗机构推广应用。