二氧化硒对卵巢癌细胞系COC1、COC1/DDP的影响

目的探讨二氧化硒对体外培养的人卵巢癌细胞株COC1及其顺铂耐药细胞株COC1/DDP细胞增殖的影响。方法用MTT法检测体外培养的COC1、COC1/DDP细胞在单独SeO2作用下的增殖抑制及与DDP(顺铂)不同顺序联合作用下的增殖抑制,并以VRP(异搏定)为对照剂,对比SeO2与DDP不同顺序联合作用对COC1/DDP细胞的增殖抑制作用。结果①SeO2单独作用时对COC1、COC1/DDP细胞的增殖抑制作用随SeO2浓度升高而明显增强;②与逆转剂对照组VRP 间隔24h DDP组相比,SeO2 DDP组及DDP 间隔24h SeO2组抑制率明显高于逆转剂对照组(P<0.05),SeO2 间隔24h DDP组抑制率与逆转剂对照组无明显差异(P>0.05)。结论在体外单独二氧化硒具有抑制人卵巢癌细胞株COC1、COC1/DDP细胞增殖的作用,二氧化硒与顺铂联合给药能明显增强人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP细胞对顺铂的敏感性。     

干扰DNA-PK和CHK1表达对卵巢癌细胞辐射凋亡影响的研究

卵巢癌是威胁女性健康最常见的恶性肿瘤之一[1],由于发病隐匿,早期症状不明显而致诊断困难,发现时多已有广泛的盆腹腔转移.其病死率最高,且发病率呈逐年上升的趋势.本研究以shRNA干扰DNA-PK和CHK1在卵巢癌Skov3细胞中的表达,观察给予辐射后细胞凋亡变化情况,探讨相关辐射损伤机制.     

榄香烯诱导人卵巢癌细胞COC1细胞凋亡的研究

目的：探讨榄香烯对人卵巢癌COC1细胞凋亡的诱导作用。方法：采用Hoechst33258和PI荧光染色法、DNA电泳及流式细胞术分析法，检测榄香烯对COC1细胞的作用。结果：经榄香烯处理的COC1细胞出现核固缩，胞浆凋亡小体形成，琼脂糖凝胶电泳呈现出细胞凋亡特征性的DNA状带。凋亡细胞发生率与药物浓度和作用时间呈正相关。结论：榄香烯对肿瘤细胞的杀伤作用主要是通过诱导细胞凋亡。     

RNA 干扰 HDAC1对人宫颈癌SiHa细胞迁移及侵袭影响

目的 观察应用RNA干扰技术沉默组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）对人宫颈癌SiHa细胞迁移和侵袭的影响,并探讨其可能机制。方法 体外合成针对HDAC1的小干扰RNA（siRNA）,采用脂质体法转染人宫颈癌SiHa细胞。采用Western blot法检测细胞HDAC1蛋白和乙酰化组蛋白H4的表达,荧光定量PCR方法检测HDAC1、核因子-κB （NF-κB）和尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）基因mRNA表达,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力。结果 经转染HDAC1基因siRNA后,宫颈癌SiHa细胞HDAC1 mRNA和蛋白表达降低,NF-κB和uPA基因mRNA表达也降低,细胞内组蛋白H4乙酰化水平增加。SiHa细胞迁移速度降低,穿过Transwell滤膜的细胞数量减少。结论 HDAC1基因siRNA能够通过抑制宫颈癌SiHa细胞HDAC1基因表达,抑制人宫颈癌SiHa细胞迁移和侵袭能力。提高组蛋白乙酰化水平,下调NF-κB和uPA基因表达可能是其作用机制。     

TRAIL逆转人卵巢癌COC1／DDP细胞对DDP耐药性的研究

目的：研究TRAIL对卵巢癌COC1／DDP细胞生长的影响,以及化疗药物DDP等对TRAIL受体（DR4、DR5）表达的影响,揭示TRAIL与COC1／DDP细胞顺铂耐药性的关系。方法：用MTT法检测不同浓度TRAIL蛋白和TRAIL与DDP联合用药对COC1／DDP细胞生长的影响,用RT—PCR方法检测DDP对TRAIL受体（DR4、DR5）表达的影响。结果：①TRAIL蛋白对COC1／DDP细胞生长有抑制作用,且随着TRAIL蛋白浓度升高,细胞抑制率逐渐上升。②DDP（2．5μg／mL）对COC1／DDP细胞生长抑制作用较弱（抑制率为3．31％）,DDP在加入TRAIL蛋白后对细胞生长抑制率显著升高（P〈0．05）。③DDP使COC1／DDP细胞的DR5表达水平显著增强为正常对照组的3．54倍（P〈0．001）。结论：TRAIL蛋白对COC1／DDP细胞生长有抑制作用,DDP与TRAIL联合使用COC1／DDP细胞生长抑制更明显,TRAIL可逆转COC1／DDP细胞对DDP的耐药性,耐药性的逆转可能与DDP导致TRAIL受体DR5水平增高促进了肿瘤细胞的凋亡有关。     

RNA干扰质粒对胰腺癌细胞系Panc-1原癌基因AKT2表达的影响

  目的  探讨RNA干扰质粒抑制胰腺癌细胞系Panc-1原癌基因AKT2的表达对胰腺癌细胞生长和凋亡的影响, 并初步探讨其作用机制。  方法  选择胰腺癌细胞系Panc-1, 构建特异性抑制AKT2表达的RNA干扰质粒, 瞬时和稳定转染胰腺癌细胞, 采用MTT法及软琼脂克隆形成实验检测胰腺癌细胞生长能力, Heochst染色及Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡情况, 通过Western blot方法检测凋亡蛋白caspase-3表达; 并进行裸鼠移植瘤体内转染实验。  结果  采用RNA干扰质粒沉默胰腺癌细胞系Panc-1原癌基因AKT2, 能够有效抑制胰腺癌细胞Panc-1体外生长能力、促进细胞凋亡, 诱导凋亡激酶caspase-3的表达; 动物体内实验结果显示, 干扰质粒能够有效抑制胰腺癌细胞系Panc-1在动物体内的成瘤能力。  结论  RNA干扰质粒抑制原癌基因AKT2表达, 可有效抑制胰腺癌细胞生长, 促进凋亡, 针对原癌基因AKT2的基因治疗对胰腺癌具有重要的潜在应用价值。     

BMI-1干扰基因重组腺病毒质粒的构建及鉴定

背景：BMI—1的表达对于维持干细胞特别是造血干细胞、神经干细胞、肿瘤干细胞的自我更新能力是不可缺少的。目的：以细菌内同源重组法构建携带BMI-1干扰基因的重组腺病毒载体，制备重组腺病毒pShuttle—H1—AdEasy—1—P1P2／P3P4。设计、时间及地点：开放性实验，于2006-02，2007-08在江苏大学医学技术研究所完成。材料：限制性内切酶由NewEnglandBioLabs提供，腺病毒骨架质粒pAdEasy—1、大肠杆菌BJ5183、Ad293细胞由南京师范大学生科院分子医学生物技术江苏省重点实验室惠赠。方法：采用细菌内同源重组法构建RNA干扰腺病毒载体pShuttle—H1，PmeI线性化质粒，通过同源重组腺病毒骨架蛋白pAdeasy—1，得到重组的腺病毒干扰质粒；经PacI线性化后用脂质体转染方法转染293A细胞，收获腺病毒重组病毒子，以未转入小干扰RNA片段的重组质粒为对照，包装后收集细胞，反复裂解细胞获得腺病毒。主要观察指标：腺病毒质粒重组构建及鉴定情况。结果：经酶切鉴定，已成功构建siRNA的重组腺病毒表达载体pShuttle—H1—AdEasy—1—P1P2/P3P4，获得了重组病毒子。结论：利用新型腺病毒载体pAdeasy—1系统可在短期内制备BMI—1干扰基因的腺病毒表达载体，并制备出重组腺病毒P1P2/P3P4。     

DNMT1和HDAC1在上皮性卵巢癌组织中的表达及临床意义

目的：研究DNA甲基转移酶（DNMT）1和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）1在正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤组织及上皮性卵巢癌组织中的表达,分析二者与卵巢癌组织多种临床病理参数关系及相关性。方法运用免疫组织化学方法检测15例正常卵巢组织、20例良性卵巢肿瘤组织及30例上皮性卵巢癌组织中DNMT1和HDAC1的表达情况。分析二者的表达与卵巢癌临床病理参数的关系,以及2种蛋白在卵巢癌组织中表达的相关性。结果上皮性卵巢癌组织中DNMT1和 HDAC1的表达高于正常卵巢组织和良性卵巢肿瘤组织,差异有统计学意义（P＜0．05）;卵巢癌组织中DNMT1和 HDAC1的表达与是否绝经和病理类型无关,而与组织学分级、临床分期有关;DNMT1和 HDAC1二者在卵巢癌组织中的表达呈正相关。结论 DNMT1和HDAC1的高表达在卵巢癌发生、发展中有重要作用。二者具有协同作用是卵巢癌发生发展的主要原因,可以为卵巢癌的早期筛查提供理论依据。     

LMP-1重组质粒对过敏性鼻炎动物模型RAGE,HMGB1及TSLP表达的影响

正(1.长春市中心医院眼科,吉林长春130062;2.吉林大学中日联谊医院;3.内蒙古医科大学基础医学院)     

RNA干扰HDAC1提高人宫颈癌HeLa细胞化疗敏感性研究

目的探讨体外应用RNA干扰技术抑制组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)表达,提高人宫颈癌HeLa细胞对顺铂敏感性的作用及机制。方法体外合成针对HDAC1的小干扰RNA(siRNA),脂质体法转染HeLa细胞,将其分为正常对照组(无干预措施)、阴性对照组(转染阴性对照siRNA)及siRNA干扰组(转染HDAC1基因siRNA)。采用Western blot法检测各组细胞HDAC1蛋白和乙酰化组蛋白H4(Ac-H4)的表达,采用聚合酶链反应(PCR)法检测HDAC1基因和NF-κB基因mRNA表达。HeLa细胞经不同浓度顺铂作用后,采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测对顺铂的敏感性,以及采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果与正常对照组及阴性对照组比较,siRNA干扰组HeLa细胞HDAC1基因mRNA和蛋白表达均降低(P0.05或P0.01),细胞内Ac-H4表达增加(P0.05),同时NF-κB基因mRNA表达降低(P0.05)。经不同浓度顺铂作用后,与正常对照组及阴性对照组比较,siRNA干扰组HeLa细胞对顺铂的50%抑制浓度降低(P0.05或P=0.01),细胞凋亡率增加(P0.01)。结论 HDAC1基因siRNA能够提高宫颈癌HeLa细胞对顺铂的敏感性,增加组蛋白乙酰化水平、抑制HDAC1基因及NF-κB基因表达可能是其作用机制。     

全反式维甲酸对人卵巢癌细胞株COC2中β-连环蛋白表达的影响

目的检测全反式维甲酸(ATRA)干预前后人卵巢上皮性癌细胞株COC2中β-连环蛋白(β-catenin)的表达情况,探讨ATRA对卵巢上皮性癌细胞β-catenin的作用。方法利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白免疫印迹(Westernblot)检测经1、5、10μmol/LATRA干预前后COC2细胞株中β-cateninmRNA及蛋白的表达水平。结果 (1)ATRA干预COC2细胞后影响细胞增殖,10μmol/LATRA组未见细胞增殖,并见少量细胞碎片。(2)β-catenin mRNA及蛋白的表达水平均有降低,并呈现ATRA浓度依赖性。结论 ATRA作用于卵巢上皮性癌细胞株COC2后可降低细胞中β-catenin的表达,进而抑制细胞增殖,达到抗卵巢上皮性癌的作用。     

HCV结构区重组质粒构建,蛋白表达及小鼠对重组质粒抗体 …

为进行ＨＣＶ－ＤＮＡ疫苗实验研究，通过分子克隆技术构建了ＨＣＶ－ＤＮＡ重组质粒（含有ＨＣＶ结构区基因片段１６９３ｂｐ，ＯｋａｍｏｔｏＩＩ型）将其转染到Ｈｅｌａ细胞中，蛋白抽提物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明，重组质粒能表达约１１０ＫＤ的融合蛋白，经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实该融合蛋白为特异性的ＨＣＶ结构区蛋白。用核酸免疫方法，将构建的重组质粒注射ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，经ＥＬＩＳＡ检测到免疫鼠能产生特异性抗体。     

HDAC抑制剂西达本胺对外周T细胞淋巴瘤PD-L1表达的影响

目的：探讨西达本胺对外周T细胞淋巴瘤PD-1/PD-L1免疫逃逸信号通路调控机制的作用。方法：使用不同浓度梯度的西达本胺处理Jurkat细胞系,通过荧光定量PCR与流式细胞术检测西达本胺处理后Jurkat细胞系PD-L1和JAK/STAT通路基因mRNA表达及细胞表面PD-L1蛋白表达的变化。结果：西达本胺上调Jurkat细胞系PD-L1的mRNA表达,上调水平呈剂量依赖（r+=0.989）,5.0μmol/L组PD-L1的mRNA表达是无处理组的15.4倍。Jurkat细胞系PD-L1细胞比例不足0.5%。西达本胺上调Jurkat细胞表面PD-L1蛋白表达。西达本胺上调TAT3 Jurkat细胞系JAK2、STAT1、S的mRNA表达,高浓度组（5.0μmol/L组）上调水平明显。同时JAK/STAT通路上游负调控基因SOCS1、SOCS3的mRNA表达上调。结论：外周T细胞淋巴瘤中,西达本胺可能通过上调STAT1上调细胞表面PDL1,并诱导T细胞趋化因子,提高PD-1单抗的反应率及T细胞毒性作用。     

RNAi干扰对K562细胞表达谱的影响

目的 联合运用RNAi技术和cDNA表达谱芯片研究干扰c-mye对K562细胞表达谱的影响。方法 经过RT-PCR和流武细胞仪检测。筛选出干扰效果最好的siRNAs,经Lipofectamine^TM 2000脂质体法转染K562细胞,提取总RNA,逆转录为cDNA,荧光标记后与K562表达谱芯片杂交。结果 经扫描、分析杂交结果,有455个基因表达下调,有12个基因表达上调。结论 基因芯片和RNAi是分析基因功能的有力工具,也是发现新的肿瘤治疗靶标的有效方法。     

干扰PD-L1表达对小鼠B细胞淋巴瘤的抑制作用

目的:探讨干扰PD-L1(programmed death 1-ligad)的表达对抑制小鼠B细胞淋巴瘤的作用。方法:针对C D274(PD-L1)靶基因序列,设计3个RNA干扰靶点序列,连接到pGMVL-SC5干扰载体,瞬时转染293T细胞。RT-q PCR检验各靶点对PD-L1的干扰效率,将干扰效率最佳的shRNA载体进行慢病毒包装,转染A20细胞,获得稳定低表达PD-L1的A20淋巴瘤细胞株(CD274-sh A20),将A20细胞株和CD274-sh A20细胞株以等数体外培养48 h,MTT法比较体外增殖的差异;同时使用2株细胞分别对免疫功能正常的BALB/c小鼠进行荷瘤,对照组皮下注射等体积PBS缓冲液;通过活体荧光成像评估成瘤情况,记录各组小鼠生存期。结果:CD274-sh A20细胞体外增殖速率显著低于PD-L1高表达的A20细胞(P<0.05)。与普通A20细胞荷瘤组相比,PD-L1干扰荷瘤组小鼠外观及活体荧光成像均可见其瘤体显著缩小。小鼠解剖后称取瘤重,测量瘤体积,结果显示,瘤重及瘤体积明显缩小(P<0.05)。小鼠生存期也较PD-L1高表达组有一定延长...     

YB-1对卵巢癌细胞EMT标志蛋白表达及黏附能力的影响研究

目的研究Y-box结合蛋白(YB-1)对卵巢癌细胞上皮间质转化(EMT)标志蛋白表达及细胞黏附能力的影响。方法在卵巢癌细胞中转染p Genesil-1.1/YB-1 shRNA和p Genesil-1.1/shRNA control,筛选稳定转染的细胞记为YB-1 shRNA组和shRNA-NC组,把没有转染的细胞作为对照组。以Realtime PCR和Western blot方法检测细胞中YB-1表达水平。用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)方法分别检测细胞增殖和黏附能力,用Western blot检测EMT标志蛋白上皮钙黏附素(E-cadherin)、神经型钙粘素(N-cadherin)和迁移侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)水平,Transwell小室测定细胞侵袭和迁移情况。结果 YB-1 shRNA组细胞中的YB-1表达水平明显低于对照组和shRNA-NC组(P0.05)。YB-1 shRNA组细胞增殖率和黏附率低于对照组和shRNA-NC组(P0.05)。YB-1 shRNA组细胞中E-cadherin蛋白水平高于对照组和shRNA-NC组,N-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白水平低于对照组和shRNA-NC组,差异具有统计学意义(P0.05)。YB-1 shRNA组细胞侵袭和迁移数目低于对照组和shRNA-NC组(P0.05)。结论下调YB-1促进卵巢癌细胞E-cadherin表达,抑制N-cadherin表达,抑制细胞EMT,降低细胞黏附、侵袭、迁移能力。     

WT1基因干扰质粒的构建

目的构建WT1(Wilms’tumor susceptibility gene,WT1)基因siRNA(small interference RNA,siRNA)载体, 为进一步探讨WT1的生物学功能奠定基础。方法根据针对WT1 mRNA的有效的siRNA序列,设计合成两条shRNA(small hair RNA,shRNA)的DNA模板单链,同时模板链两端分别设计不同的两个限制酶切位点。退火形成siRNA载体插入片断。用限制性内切酶将siRNA空载体线性化,T4连接酶将插入片断插入siRNA空质粒中。结果经酶切、PCR及测序鉴定确定构建成功。结论成功构建了WT1的干扰质粒,可对其生物学行为作进一步研究。     

HDAC1蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

目的:观察HDAC1蛋白在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达,确定HDAC1蛋白表达与临床病理特征的关系.方法:采用免疫组织化学染色方法检测169例肺癌组织中HDAC1蛋白表达情况,用Spearman等级相关分析检验HDAC1蛋白染色强度与临床病理特征的相关性.用Kaplan-Meier计算生存曲线,用log-rank检验分析生存曲线.结果:在169例NSCLC组织中,HDAC1阳性表达率为97.0%,HDAC1蛋白高表达与临床分期(P=0.027,r=-0.170)、远处转移(P=0.023,r=-0.175)均呈负相关.HDAC1蛋白不同表达水平肺癌患者无进展中位生存期差异无显著性.结论:HDAC1蛋白高表达与NSCLC患者更好的临床病理学特征相关.用免疫组化方法检测HDAC1在NSCLC中的表达,有可能成为预测NSCLC患者对HDAC抑制剂治疗反应的新手段.