KLD-12多肽/重组人BMP-2凝胶诱导兔BMSCs成骨活性的实验研究

目的探讨KLD-12多肽复合重组人BMP-2(recombinant human BMP-2,rhBMP-2)诱导兔BMSCs成骨活性的影响。方法取3月龄新西兰大白兔骨髓,采用密度梯度法分离培养BMSCs。取第3代BMSCs分别采用KLD-12多肽/rhBMP-2凝胶三维培养(实验组)和KLD-12多肽凝胶培养(对照组)。培养7 d倒置相差显微镜下观察实验组细胞在凝胶内的形态;3、7、10、14、21 d检测两组细胞培养基中ALP及骨钙蛋白含量;培养14 d两组行Ⅰ型胶原免疫荧光染色观察,实时荧光定量PCR检测Ⅰ型胶原和骨钙蛋白基因相对表达量。结果倒置相差显微镜下观察,培养7 d实验组及对照组凝胶内BMSCs呈圆形,分布均匀。两组培养3、7 d时ALP表达量及骨钙蛋白含量比较差异无统计学意义(P0.05),10~21 d实验组以上指标均明显高于对照组(P0.05)。培养14 d,激光共聚焦显微镜观察示,实验组Ⅰ型胶原免疫荧光染色阳性,且荧光强度较对照组高;实时荧光定量PCR检测实验组Ⅰ型胶原、骨钙蛋白基因相对表达量均显著高于对照组,比较差异有统计学意义(t=15.902,P=0.000;t=12.998,P=0.000)。结论 BMSCs在KLD-12多肽内正常生长并增殖,KLD-12多肽/rhBMP-2凝胶诱导BMSCs向成骨细胞分化的生物活性良好。     

瑞香素联合IGF-1对大鼠脂肪间充质干细胞成软骨分化的影响

目的初步研究瑞香素(dephnetin,DAP)联合IGF-1基因转染对大鼠脂肪间充质干细胞(adiposederived mesenchymal stem cells,ADSCs)成软骨分化的影响。方法采用酶消化法分离培养大鼠ADSCs。取第3代ADSCs以IGF-1基因转染作为实验组,未转染的ADSCs作为对照组。两组细胞分别用不同浓度DAP(0、30、60、90μg/mL)处理,培养72 h后采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测细胞增殖活性;培养14 d分别采用实时荧光定量PCR和Western blot检测Ⅱ型胶原和蛋白聚糖(Aggrecan)mRNA和蛋白表达,并行甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察。结果 CCK-8法检测示,随DAP作用浓度增加,对照组和实验组细胞吸光度(A)值均逐渐增加(P0.05);相同DAP浓度下,实验组细胞A值显著高于对照组(P0.05)。实时荧光定量PCR和Western blot检测示,随DAP作用浓度增加,对照组细胞Ⅱ型胶原和Aggrecan的mRNA和蛋白相对表达量无明显变化,各浓度组间差异无统计学意义(P0.05);实验组细胞Ⅱ型胶原和Aggrecan的mRNA和蛋白相对表达量逐渐增加,其中60、90μg/mL DAP浓度组显著高于0μg/mL DAP浓度组(P0.05)。相同DAP浓度下,实验组细胞Ⅱ型胶原和Aggrecan的mRNA和蛋白相对表达量显著高于对照组(P0.05)。甲苯胺蓝染色示,随DAP作用浓度增加,对照组内和实验组内细胞着色无明显差异;相同DAP浓度下,实验组比对照组细胞着色略深。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示,随DAP作用浓度增加,对照组细胞的细胞质内着色无明显差异;实验组细胞的细胞质内着色逐渐加深,其中60、90μg/mL DAP浓度组明显深于0μg/mL DAP浓度组。相同DAP浓度下,实验组比对照组细胞着色明显加深。结论 DAP对大鼠ADSCs增殖有一定促进作用;单独使用DAP诱导大鼠ADSCs向软骨细胞分化作用极微弱,但DAP联合IGF-1基因转染有明显协同作用,促进ADSCs成软骨分化。     

人肋软骨细胞体外培养中生长代谢及功能的变化

目的　通过检测体外培养的人肋软骨细胞老化过程中Ⅰ、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖(aggrecan)的表达变化 ,为组织工程软骨构建的种子细胞选择适宜的回植时机。方法　取体外培养的P1 ～P5人肋软骨细胞 ,通过观察细胞形态 ,细胞增殖率 ,Alcianblue法定量检测每代Aggrecan中GAG含量 ,免疫组化蛋白水平观察Ⅰ、Ⅱ型胶原表达及RT PCR从mRNA水平分析Ⅰ、Ⅱ型胶原及Aggrecan基因表达量。结果　人肋软骨细胞从第 3代起逐渐向成纤维样细胞形态转换 ;每代软骨细胞Aggrecan中GAG含量随传代次数逐渐降低 ,第 3代后处于较低水平 ;Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达在蛋白水平及mRNA水平基本一致 ,第 2代以前Ⅱ型胶原表达较强 ,Ⅰ型胶原表达较弱 ,之后随传代Ⅱ型胶原表达减弱 ,Ⅰ型胶原表达逐渐增强 ;而Aggrecan在第 3代以前表达较高 ,从第 4代后明显下降。结论　人软骨细胞体外培养老化过程中综合细胞扩增及细胞功能因素 ,第 2代的软骨细胞 (体外扩增约 18 32 6倍 )可作为构建人组织工程软骨的种子细胞。     

脱矿脱细胞骨基质环支架体外构建组织工程化椎间盘纤维环

目的:探计以脱矿脱细胞骨基质环为支架、纤维环细胞为种子细胞体外培养构建组织工程化椎间盘纤维环的可行性.方法:取兔椎间盘纤维环细胞培养,应用甲苯胺蓝染色和Ⅰ型、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色进行鉴定.用纤维蛋白凝胶接种技术将兔椎间盘纤维环细胞接种到经脱矿脱细胞制备的骨基质环支架材料上,体外培养3个月.每月取培养的细胞支架复合体进行大体形态、HE染色光镜检查和扫描电镜观察,并用生化方法榆测羟脯氨酸、氨基葡聚糖(GAG)、脱氧核糖核酸(DNA)含量;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Ⅰ、Ⅱ型胶原信使核糖核酸(mRNA)表达;免疫组化和蛋白质印迹方法检测Ⅰ、Ⅱ犁胶原蛋白表达.结果:培养的第1代细胞甲苯胺蓝染色呈异染性,Ⅰ型、Ⅱ型胶原免疫组化染色均可见阳性表达,表明培养的第1代细胞具有椎间盘纤维环细胞的表型特点.构建的复合体体外培养1、2、3个月时大体呈白色半透明样环状,有光泽,质韧,具有一定弹性,可扭曲;HE染色光镜下见支架孔洞被红染的组织填充,且空洞内的细胞密度逐渐增加;扫描电镜观察材料表面逐渐被组织填充;Ⅰ型、Ⅱ型胶原免疫组化染色均为阳性;培养2个月时复合体羟脯氨酸、GAG、DNA含量明显高于1个月时(P<0.01),3个月时与2个月时比较无显著性差异(P>0.05).各时间点复合体羟脯氨酸、GAG、DNA含量均低于正常纤维环(P<0.05或<0.01);培养1个月时复合体可检测到Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达.2个月时与1个月时比较有显著性差异(P<0.01),3个月时与2个月时比较无显著性差异(P>0.05).结论:以脱矿脱细胞骨基质环为支架、纤维环细胞为种子细胞构建的复合体在体外培养时,细胞能够保持表型特点、逐渐增殖和行使功能,此复合体可被鉴定为类纤维环组织,用其构建组织工程化椎间盘纤维环可行.     

转化生长因子-β1诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞转化的研究

目的 探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)向髓核样细胞分化的可能性.方法 密度梯度法分离培养兔BMSCs,取BMSCs(P3).实验组:含TGF-β1的诱导培养基,对照组:不含TGF-β1诱导培养基,体外培养两周.阿尔新蓝法(Alcian blue)检测培养基内葡糖胺聚糖(GAG)含量.培养第14天,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测髓核样细胞Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)及聚集蛋白多糖(Aggrecan) mRNA基因表达.免疫组织化学法测定CollagenⅡ的含量变化.结果 GAG检测结果显示,第7、10、13天实验组GAG含量均显著高于对照组(P＜0.01).实验组CollagenⅡ免疫组织化学染色阳性,表达量较对照组高.Real-time PCR结果证实:实验组CollagenⅡ和Aggrecan mRNA表达水平较对照组显著增高(P＜0.01).结论 TGF-β1能明显增加BMSCs向髓核样细胞分化的诱导生物活性,促进BMSCs向髓核样细胞定向分化.     

自组装多肽纳米凝胶支架三维培养前软骨干细胞的实验研究

目的构建新型自组装多肽纳米凝胶支架RGDmx,探讨支架的细胞相容性及其对前软骨干细胞(precartilaginous stem cells,PSCs)增殖和向软骨细胞方向分化的影响。方法取新生SD大鼠四肢长骨干骺端组织分离培养PSCs,采用免疫磁珠分选系统分选纯化原代细胞,并进行鉴定。取KLD-12、KLD-12-PRG多肽冻干粉,以体积比1∶1复合构建RGDmx。将纯化后的第3代PSCs接种至KLD-12(对照组)和RGDmx(实验组)培养,1、3、7、14 d用细胞计数(cell counting kit,CCK)-8法检测支架细胞增殖-毒性;制备不同混合比(0、20%、40%、60%、80%、100%)RGDmx,观察其对PSCs增殖的影响;采用无血清软骨形成培养液(complete chondrogenic medium,CCM)诱导两组支架内PSCs向软骨细胞方向分化,培养14 d时行甲苯胺蓝染色法鉴定,并用RT-PCR法检测两组软骨分化特异性基因Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达情况。结果成功分离纯化获得成纤维细胞生长因子受体3表达阳性细胞,免疫组织化学染色及免疫荧光染色鉴定为PSCs。CCK-8检测结果显示,复合培养后实验组细胞吸光度(A)值随培养时间延长逐步提高,7 d达峰值;其中7、14 d时细胞A值高于对照组(P<0.05);复合培养7 d时,混合比为40%组细胞A值较其他混合比组高,差异有统计学意义(P<0.05)。CCM诱导培养14 d时,两组支架内细胞甲苯胺蓝染色均呈阳性;RT-PCR检测示实验组细胞Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论自组装多肽纳米凝胶支架RGDmx具有良好的细胞相容性,可有效促进PSCs增殖及向软骨细胞方向分化,是组织工程较理想的细胞载体系统。     

胶原水凝胶支架用于软骨组织工程的实验研究

目的探讨Ⅰ型胶原浓度对胶原水凝胶理化性能的影响,以及在体外组织工程模型中不同浓度的Ⅰ型胶原水凝胶对软骨细胞表型和基因表达的影响。方法制备Ⅰ型胶原浓度为12、8、6 mg/mL的3种胶原水凝胶,记为C12、C8、C6。扫描电镜观察形貌,并通过溶胀性能和抗压性能测试表征其理化性能。取2只新生7日龄新西兰大白兔的关节软骨,酶消化法分离、培养软骨细胞。取第2代软骨细胞与3种胶原水凝胶复合体外培养(C12组、C8组及C6组),1 d后采用二乙酸荧光素(fluorescein diacetate,FDA)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色,激光共聚焦显微镜观察细胞活性,体外培养14 d后行HE和甲苯胺蓝染色观察组织学形态,实时荧光定量PCR测定软骨细胞相关基因,即Ⅱ型胶原、蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅰ型胶原、Ⅹ型胶原、Sox9 mRNA表达。结果随着Ⅰ型胶原浓度从6 mg/mL提高到12 mg/mL,胶原水凝胶的理化性质出现明显变化,扫描电镜下纤维网络变得致密;192 h时C6、C8、C12溶胀率依次增大,分别为0.260±0.055、0.358±0.072、0.539±0.033,比较差异均有统计学意义(P<0.05);压缩模量逐渐增加,分别为(4.86±0.96)、(7.09±2.33)、(11.08±3.18)kPa,比较差异均有统计学意义(P<0.05)。体外培养1 d,3组凝胶中软骨细胞经FDA/PI染色后,绝大部分被染成绿色,仅有少数被染成红色。14 d后组织学观察示:C12组软骨细胞在组织中聚集明显,并出现明显的甲苯胺蓝异染为紫红色的现象;C8组中也有部分增殖聚集的区域,细胞周围有较明显的甲苯胺蓝异染现象;C6组细胞分布较为均匀,也有较明显的甲苯胺蓝异染现象。实时荧光定量PCR检测显示,3组Ⅱ型胶原mRNA和Aggrecan mRNA表达水平相近;Ⅰ型胶原、Sox9和X型胶原mRNA表达水平C12组最高,C6组最低,C8组介于二者之间,组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论提高Ⅰ型胶原浓度至12 mg/mL后,胶原水凝胶具有更好的理化性质,但软骨细胞纤维化和肥大相关基因表达也有所上调。     

椎间盘灌注培养条件下压应力频率对纤维环细胞基质合成的影响

目的:观察压应力频率对椎间盘纤维环(AF)细胞基质合成的影响。方法:获取4~6月龄巴马香猪胸腰段椎间盘72个后,随机分为无应力对照组和应力组(分别为0.1Hz组、0.5Hz组、1Hz组、3Hz组、5Hz组),每组12个样本,将各组椎间盘置于生物反应器中进行灌注培养。无应力对照组不施加应力刺激,各应力组每天施加对应频率的应力刺激2h。灌注培养5d后分离全层纤维环组织行HE染色、阿利新蓝染色、胞外基质基因Aggrecan、CollagenⅠ、CollagenⅡ定量PCR、糖胺多糖(GAG)含量和羟脯氨酸(HYP)含量的检测。结果:培养5d后,各组纤维环组织仍保持天然的层状叠加结构。与对照组比较时,除5Hz组外其他应力组(0.1Hz、0.5Hz、1Hz、3Hz)纤维环组织阿利新蓝染色强度增强、各胞外基质基因的表达得到维持(0.1Hz)或上调(0.5Hz、1Hz、3Hz)、GAG和HYP的含量也维持在同等水平(0.1Hz)或显著升高(0.5Hz、1Hz、3Hz)。然而各应力组组间比较时,5Hz组纤维环组织阿利新蓝染色强度、胞外基质基因的表达水平及GAG和HYP的含量比其他应力组(0.1Hz、0.5Hz、1Hz、3Hz)都下调(P0.05)。结论:椎间盘体外灌注培养条件下,压应力刺激频率影响纤维环细胞的基质合成,低频率(0.1~3Hz)的应力刺激增加基质合成,高频率(5Hz)的应力刺激减少基质合成。     

残耳软骨细胞诱导脂肪来源干细胞体外软骨形成实验研究

目的探讨残耳软骨细胞能否在体外模拟软骨诱导微环境,促进脂肪来源干细胞(adipose derived stemcells,ADSCs)向软骨分化并形成软骨样组织。方法取外耳再造术中废弃的先天性小耳畸形患者残耳软骨组织与皮下脂肪组织分离培养,分别收集第2代残耳软骨细胞与第3代ADSCs,以3∶7比例混合培养作为实验组(A组),单纯残耳软骨细胞和单纯ADSCs作为对照(分别为B组和C组)。取各组细胞1.0×106个离心培养获得细胞球后,体外培养28 d,大体观察各组细胞球取材时的外观变化,测量湿重;阿利辛蓝比色法检测糖胺多糖(glycosaminoglycan,GAG)含量;RT-PCR检测各组标本的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖(Aggrecan)mRNA表达;并行HE、甲苯胺蓝、番红O组织学观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测。结果体外培养28 d后,A、B组标本形成白色半透明圆盘状组织块,表面光滑,弹性可;C组标本组织块有明显收缩,呈黄色球状,无弹性。A、B组标本湿重及GAG含量显著高于C组(P<0.05);A、B组间差异无统计学意义(t=1.820 3,P=0.068 7;t=1.861 4,P=0.062 7)。RT-PCR检测示A、B组标本均可见Ⅱ型胶原与Aggrecan mRNA条带清晰表达,C组未见明显表达;A、B组Ⅱ型胶原与Aggrecan mRNA表达均显著高于C组(P<0.05),A、B组间差异无统计学意义(t=1.457 6,P=0.144 9;t=1.519 5,P=0.128 6)。组织学观察示:A组与B组细胞球标本形成了大量软骨陷窝样结构,细胞外基质均有不同程度染色;C组细胞球标本组织内主要为纤维性成分,未见软骨陷窝,细胞外基质染色阴性。A、B组可见在软骨陷窝周围有不同程度棕黄色沉淀即Ⅱ型胶原表达,C组未见明显表达;A、B组灰度值显著低于C组(P<0.01),A、B组间差异无统计学意义(t=1.661 5,P=0.097 0)。结论残耳软骨细胞可在体外独立模拟软骨诱导微环境,促进ADSCs软骨定向分化并形成软骨组织。     

富含血小板血浆凝胶复合脂肪间充质干细胞构建可注射组织工程髓核

目的:探讨以自体富含血小板血浆(PRP)凝胶复合脂肪间充质干细胞(ADSCs)构建可注射组织工程髓核的可行性。方法:将体外扩增的第3代兔ADSCs经流式细胞仪鉴定后接种至自体PRP凝胶中,体外立体培养2周、4周、8周时分别行大体观察、组织学检查、5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)免疫荧光法观察细胞在PRP凝胶中的分布及存活情况;分光光度法检测PRP凝胶-细胞复合体中糖胺聚糖(GAG)含量,实时荧光定量PCR法检测低氧诱导因子(HIF-1α)、蛋白多糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)基因表达情况。结果:流式细胞仪检测显示体外扩增的第3代细胞CD90阳性率为95.2%,CD45阳性率为0.9%。培养2、4、8周时PRP凝胶细胞复合体均为表面光滑的凝胶状,弹性较好;番红O染色2周时细胞外基质几乎不着色,4周时可见细胞周围呈粉色的弱阳性染色,8周时多数细胞周围呈红色阳性染色。HE染色和扫描电镜各时间点均可见细胞均匀分布于网络状支架内;BrdU免疫荧光法显示细胞在支架中生存状态良好,培养4周时阳性细胞数较培养2周时明显增多(P<0.05),8周时较4周时明显增多(P<0.05)。培养4周时GAG含量较培养2周时明显增高(P<0.05),8周时较4周时明显增高(P<0.05);培养4周时与培养2周时比较3个目的基因mRNA表达量均增高,差异有显著性(P<0.05),8周时与4周时比较亦明显增高(P<0.05)。结论:以兔自体PRP凝胶与ADSCs构建的复合体在体外培养时细胞可以向类髓核样细胞分化,用此方法构建可注射组织工程髓核具有可行性。     

转化生长因子β1诱导永生化人前软骨干细胞向髓核样细胞分化的实验研究

  目的 研究转化生长因子β1 (TGF-β1) 诱导永生化人前软骨干细胞 (IPSCs) 向髓核样细胞分化的可行性。方法 将体外培养的IPSCs 接种于温敏型壳聚糖水凝胶 (C/GP) 三维支架上,加入含TGF-β1的诱导培养基,低氧条件下进行诱导培养,观察三维支架上IPSCs的生长及分化情况。7 d后行Alcian Blue染色,分析细胞外基质糖胺聚糖（GAG）合成情况,并收集细胞,提取RNA。RT-PCR检测诱导前后髓核样细胞标志基因Ⅱ型胶原（Collagen Ⅱ）和蛋白聚糖（Aggrecan）的表达情况,Western Blot 检测诱导前后细胞内β-catenin蛋白表达水平的变化。结果 IPSCs在三维支架上生长状态良好,诱导7 d 后,Alcian Blue染色表明,细胞外基质GAG的合成明显增多,实验组（诱导培养基）明显多于对照组（普通培养基）。RT-PCR证实Ⅱ型胶原和Aggrecan的基因表达水平明显增高,实验组明显高于对照组;Western Blot证实细胞内β-catenin蛋白表达水平明显上调,实验组明显高于对照组。结论 IPSCs经TGF-β1诱导可在体外定向分化为髓核样细胞,诱导分化后的细胞具有良好的分泌功能,能够有效地分泌细胞外基质成分。TGF-β1可能通过上调细胞内β-catenin的表达诱导IPSCs向髓核样细胞分化。     

胶原凝胶构建神经组织工程支架的实验研究

目的研究胶原凝胶支架对大鼠BMSCs增殖和分化的影响,探讨其作为神经组织工程支架的可行性。方法利用Ⅰ型胶原制备胶原凝胶支架。采用密度梯度离心法分离培养大鼠BMSCs,取第5代细胞制备胶原凝胶-BMSCs复合体。采用扫描电镜、HE染色观察胶原凝胶支架的形态结构及复合培养后细胞形态;MTT检测该支架对BMSCs增殖的影响。取绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性(GFP~+)BMSCs于胶原凝胶支架中培养24 h,通过激光共聚焦显微镜及活细胞工作站观察细胞生长及与材料的黏附情况。结果激光共聚焦显微镜及活细胞工作站观察示,GFP~+BMSCs均匀分布于胶原凝胶支架内,大部分GFP~+BMSCs呈梭形,部分细胞伸出突起,部分细胞间形成连接,提示BMSCs在三维空间中生长良好。扫描电镜示胶原凝胶支架为多孔纤维网状结构,BMSCs可黏附于该支架材料上,细胞形态良好。MTT检测示,BMSCs于胶原凝胶支架中培养后3、5、7 d的吸光度(A)值均高于单纯BMSCs培养,其中5、7 d时组间差异有统计学意义(t=4.472,P=0.011;t=4.819,P=0.009)。HE染色示,胶原凝胶支架呈均质淡粉染细丝样物质。BMSCs在胶原凝胶内培养24 h后均匀分布其中;7 d时BMSCs形态多样,部分细胞伸出细长突起,具有体外培养的神经元样形态。结论胶原凝胶支架制备简便,具有良好的生物相容性,可作为神经组织工程支架材料。     

兔半月板纤维软骨细胞的培养及生物学特性研究

目的 :通过半月板纤维软骨细胞的分离、培养、鉴定 ,观察其生长特点 ,研究半月板生物学特性及其损伤修复的细胞学基础。方法 :机械分离兔半月板软骨 ,胰蛋白酶、胶原酶联合消化 ,10 ?S的DMEM中原代和传代培养 ,倒置显微镜动态观察细胞形态及生长情况 ,GAG、Ⅱ型胶原免疫组化染色 ,电镜观察细胞超微结构。结果 :培养细胞呈多角形 ,有突起 ,富含分泌颗粒 ,GAG、Ⅱ型胶原染色阳性 ,细胞线粒体和内质网发达。结论 :培养的细胞保持了体内纤维软骨细胞的基本特性。     

TGF-β_1联合VEGF对人羊膜间充质干细胞向韧带成纤维细胞体外分化作用的研究

目的探讨人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,h AMSCs)是否具有MSCs特性,以及经TGF-β_1和VEGF联合诱导后是否具有向韧带成纤维细胞分化的能力。方法取自愿捐赠的足月产妇胎盘,采用胰蛋白酶胶原酶联合消化法分离培养h AMSCs,流式细胞术检测h AMSCs表型分子,免疫荧光染色检测h AMSCs其角蛋白-19(cytokeratin-19,CK-19)和波形蛋白表达情况。取第3代h AMSCs,分别使用含TGF-β_1和VEGF的L-DMEM/F12成韧带或纤维细胞诱导培养基(实验组)和普通L-DMEM/F12培养基(对照组)培养,细胞增殖-毒性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测两组细胞增殖能力;培养5、10、15 d分别采用免疫荧光染色及实时荧光定量PCR检测韧带及血管生成相关特异性蛋白和基因表达。结果倒置相差显微镜观察示h AMSCs呈单层贴壁生长;流式细胞术结果示h AMSCs表达MSCs表型分子;免疫荧光染色示h AMSCs高表达波形蛋白、低表达CK-19;h AMSCs具有向成骨、成软骨及成脂细胞分化的能力。CCK-8法检测示,7 d时两组细胞均达增殖高峰,实验组细胞增殖能力于7 d后显著高于对照组(P0.05)。免疫荧光染色示,培养5、10、15 d时实验组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白(Fibronectin)、细胞连接素(Tenascin-C)表达染色均较对照组增强。实时荧光定量PCR结果示,随时间延长实验组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Fibronectin、α-肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、VEGF m RNA相对表达量均逐渐上调(P0.05)。除培养5 d两组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、VEGF m RNA相对表达量比较差异无统计学意义(P0.05)外,其余各时间点实验组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Fibronectin、α-SMA和VEGF m RNA相对表达量均显著高于对照组(P0.05)。结论 h AMSCs具有MSCs特征,且体外增殖能力良好,可作为组织工程种子细胞来源;体外诱导后韧带成纤维细胞及血管生成相关特异性基因表达上调,韧带成纤维细胞特异性蛋白分泌增加,TGF-β_1联合VEGF可作为构建组织工程韧带的生长因子选择。     

兔骨髓间充质干细胞在壳聚糖支架上的诱导培养

目的观察存壳聚糖(Chitosan)三维支架上诱导兔骨髓间充质干细胞(rMSCs)向髓核样细胞分化的情况,探讨应用其制作组织工程髓核的可能性.方法将体外培养的第3代rMSCs接种于经冷冻干燥法构建的壳聚糖三维支架上,在主要含有转化生长因子β1(TGF-β1)、胰岛素 转铁蛋白 亚硒酸钠(ITS)、地塞米松、丙酮酸钠的培养液中培养(实验组),同时设立对照组(非诱导组).在培养7d、14d、21d时取标本行组织学检测,观察三维支架上rMSCs的生长及分化情况,对支架细胞复合物行Ⅱ型胶原免疫组化检测,测定培养液中糖胺聚糖(GAG)含量及Ⅱ型胶原的表达量,计算细胞外基质GAG含量.结果rMSCs在壳聚糖三维支架上生长状态良好,体外培养7d、14d、21d时,实验组培养液中细胞外基质GAG含量分别为55.8±4.6、86.7±5.8、83.2±3.41μg/cm2,对照组培养液中细胞外基质GAG含量分别为34.2±5.6、42.6±4.8、40.8±4.4μg/cm2,两组间相同时间点比较有显著性差异(P＜0.05);Ⅱ型胶原蚩白电泳及Western-blot检测实验组在培养14d与21d时可见到Ⅱ型胶原电泳条带,21d时Ⅱ型胶原蛋白含量多于14d时;对照组未见Ⅱ型胶原表达.结论rMSCs在壳聚糖三维支架上培养生长良好,在特定的诱导培养液诱导下可以向髓核样细胞分化.     

白藜芦醇通过Wnt/β-catenin信号通路调控髓核细胞细胞外基质表达

目的探讨白藜芦醇(resveratrol,RES)对退变髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPC)细胞外基质(extracellular matrix,ECM)表达的调控作用及其相关分子机制。方法选取临床上接受椎间盘摘除术的10例患者,其中5例为年轻脊柱爆裂骨折患者,作为对照组;余5例为老年腰椎间盘突出症患者,作为退变组。取两组患者髓核组织,免疫组织化学染色比较β-catenin的原位表达,Western blot检测β-catenin、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)蛋白表达。取退变组髓核组织分离、培养NPC,分别用IL-1β单独(B组)或联合RES(C组)刺激第3代NPC,并设未刺激细胞作为空白对照组(A组),Western blot检测Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白表达。进一步采用小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)靶向沉默SIRT1和β-catenin后,采用Western blot、实时荧光定量PCR检测β-catenin、SIRT1蛋白和基因表达。用完全培养基(1组)、IL-1β(2组)、RES+IL-1β(3组)、SIRT1-si RNA+RES+IL-1β(4组)刺激第3代NPC培养24 h后,细胞免疫荧光染色检测β-catenin核转位情况;用完全培养基(Ⅰ组)、IL-1β(Ⅱ组)、IL-1β+β-catenin-si RNA(Ⅲ组)、IL-1β+RES(Ⅳ组)、IL-1β+RES+SIRT1-si RNA(Ⅴ组)刺激第3代NPC培养24 h后,采用Western blot检测Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白表达。结果免疫组织化学染色及Western blot检测示,与对照组比较,退变组髓核组织中β-catenin阳性表达的细胞比例显著升高(t=4.616,P=0.010);β-catenin蛋白相对表达量显著升高,Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白相对表达量显著下降(P0.05)。细胞学实验发现,B组β-catenin蛋白相对表达量显著高于A、C组,Ⅱ型胶原和Aggrecan相对表达量显著低于A、C组(P0.05)。si RNA转染后,Western blot检测显示SIRT1、β-catenin蛋白表达显著降低(P0.05)。细胞免疫荧光染色结果进一步提示与3组相比,4组SIRT1被si RNA沉默后,RES减弱的β-catenin核转位现象加剧。Western blot检测示,Ⅱ组Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白表达较Ⅰ组明显降低(P0.05);Ⅲ组NPC转染β-catenin-si RNA后,IL-1β对ECM的降解作用被明显抑制,Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白表达较Ⅱ组明显升高(P0.05);Ⅴ组NPC转染SIRT1-si RNA后,抑制了RES对ECM降解的保护作用,Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白表达较Ⅳ组明显降低(P0.05)。结论 RES可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路维持NPC ECM的表达,为椎间盘退行性疾病的治疗提供了新思路。     

猪滑膜源性MSCs体外多向分化潜能的研究

目的 体外分离培养猪滑膜源性MSCs(synovium-derived MSCs,SMSCs),探讨其在体外多向分化潜能.方法 2月龄长枫杂交猪3头,雌雄不限,体重8～10kg.取猪膝关节滑膜组织分离SMSCs并行原代及传代培养,待第3代SMSCs长满培养皿后,吸去基础培养液,分别加入特定培养液进行成软骨、成骨、成脂诱导分化,作为实验组;以基础培养液培养作为对照组.成软骨诱导21 d后行甲苯胺蓝染色、免疫组织化学染色和实时荧光定量PCR检测;成骨诱导10 d后行ALP染色检测,21 d后行茜素红染色检测;成脂诱导21 d后行油红O染色检测.结果 SMSCs培养24 h后细胞形态细长或呈多角形;48 h后细胞数量增多;72 h后可见大量纺锤形细胞,其间散在分布少许小圆形细胞.实验组成软骨诱导21 d后甲苯胺蓝染色早阳性,细胞外有蛋白多糖(Aggrecan)形成;免疫组织化学染色示特异软骨基质ColⅡ表达;实时荧光定量PCR检测示Col Ⅱ A1、Aggrecan、SOX9 mRNA表达量与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).成骨诱导10 d后ALP染色阳性,21d后茜素红染色阳性,有钙结节形成.成脂诱导21 d后油红O染色示细胞内有脂滴形成.对照组除ALP染色观察呈弱阳性外,余染色均呈阴性.结论 猪膝关节滑膜组织可分离获取SMSCs,其在体外具有向成软骨、成骨、成脂多向分化潜能,有望成为组织工程种子细胞来源.     

BMP-7/聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球对兔BMSCs增殖和成软骨分化的影响

目的通过体外实验探讨载负BMP-7的聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactide-co-glycolide),PLGA]缓释微球对兔BMSCs增殖和成软骨分化的影响。方法采用复乳化-液中干燥法制备BMP-7/PLGA缓释微球,并将BMP-7/PLGA缓释微球与软骨分化培养基混合后,在第1、3、7、14、21天收集其上清液作为体外释放液。取3～5日龄新西兰乳兔双侧股骨及胫骨分离培养BMSCs,取第3代BMSCs分为微球组和对照组,微球组在每2～3天换液过程中更换为200μL不同时间点的BMP-7/PLGA缓释微球体外释放液,对照组使用等体积软骨诱导培养液。采用MTT法测定两组培养1、3、7、14、21 d的吸光度(A)值,检测细胞增殖情况;培养21 d行番红O染色、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,并于1、3、7、14、21 d采用阿利新蓝染色法测定糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)含量,检测成软骨细胞分化能力。结果 MTT检测示,培养1、3、7 d两组细胞均迅速增殖;7 d后对照组增殖速度变缓,微球组仍呈持续快速增殖。培养1、3、7 d两组A值比较差异无统计学意义(P0.05),14、21 d微球组A值显著高于对照组(P0.05)。培养21 d与对照组比较,微球组番红O染色可见几乎所有细胞核被染成鲜红色,甲苯胺蓝染色可见几乎所有细胞核出现异染性紫红色,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色可见多数细胞核呈黄色或棕黄色,Ⅱ型胶原表达为强阳性。阿利新蓝染色法测定示,培养各时间点两组细胞GAG含量呈持续增高趋势,7 d后对照组增高趋势减缓,微球组仍呈持续高分泌状态。培养1、3、7 d两组GAG含量比较差异无统计学意义(P0.05),14、21 d微球组GAG含量显著高于对照组(P0.05)。结论复乳化-液中干燥法制备的BMP-7/PLGA缓释微球在体外具有促进兔BMSCs增殖和向软骨细胞分化的能力。     

PKH26标记结合活体荧光成像技术在椎间盘组织工程研究中的应用

目的体外评估PKH26标记对山羊髓核细胞生物学功能的影响,并结合活体荧光成像系统评价种子细胞在裸鼠体内的生物学行为。方法取1岁龄山羊椎间盘分离髓核组织,通过酶消化法获取原代细胞,倒置相差显微镜下观察,传代获取第1代髓核细胞,行PKH26荧光标记,荧光显微镜下观察标记后的细胞荧光强度,并行甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色观察,锥虫蓝染色比较标记前后细胞活性,MTT法检测标记前后细胞增殖特性,实时荧光定量PCR检测细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖基因表达。将标记后的髓核细胞接种至一体化纤维化-髓核支架的髓核部分,纤维环部分作为阴性对照,体外培养3 d后植入5只6周龄雄性裸鼠体内,培养6周后活体成像技术检测髓核细胞-支架复合物在体内的荧光强度及范围。结果倒置相差显微镜观察示原代髓核细胞簇状生长,呈卵圆形,第1代髓核细胞呈类软骨样细胞形态;标记后的第1代髓核细胞甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色均呈阳性;标记后荧光强度均匀,标记前后细胞活性均在95%以上;标记前后细胞生长曲线比较差异无统计学意义(P>0.05);实时荧光定量PCR检测示标记前后细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因相对表达量差异均无统计学意义(P>0.05)。活体成像技术显示体内髓核支架有强烈荧光,纤维环支架未见荧光。结论 PKH26标记对髓核细胞的活性、增殖及细胞表型的表达无明显影响,结合体内活体荧光成像系统可以追踪细胞在体内的生物学行为。