人尿液干细胞联合硫酸软骨素酶ABC对脊髓损伤后神经生长因子和脑源性神经营养因子表达的影响

目的探讨大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后,行人尿液干细胞(human urine-derived stem cells,h USCs)移植以及联合硫酸软骨素酶ABC(chondroitinase ABC,ch ABC)鞘内注射,对脊髓组织神经生长因子(nerve growth factor,NGF)及脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的影响,以及其相关分子机制。方法取人尿液分离培养h USCs并鉴定。利用Allen法建立大鼠SCI模型;将60只大鼠随机分为5组(n=12),分别为假手术组(A组)、SCI组(B组)、SCI+h USCs组(C组)、SCI+ch ABC组(D组)、SCI+h USCs+ch ABC组(E组)。模型制备后10、20、30 d,利用BBB评分法评价大鼠下肢运动功能;30 d时取脊髓组织,采用实时荧光定量PCR检测及免疫组织化学染色观察NGF、BDNF表达情况,Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达。结果经鉴定,培养的细胞具有多向分化特性,为h USCs。SCI模型制备后10、20、30 d,B组下肢运动功能BBB评分均显著低于A、C、D、E组,C、D、E组显著低于A组,C、D组低于E组,比较差异均有统计学意义(P0.05)。实时荧光定量PCR及免疫组织化学染色检测示,模型制备后30 d,B组NGF、BDNF表达显著低于A、C、D、E组,C、D、E组显著低于A组,C、D组低于E组,比较差异均有统计学意义(P0.05);C、D组间比较差异无统计学意义(P0.05)。Western blot检测显示,B组Bax蛋白相对表达量明显高于A、C、D、E组,C、D、E组显著高于A组,C、D组高于E组,比较差异均有统计学意义(P0.05);B组Bcl-2蛋白相对表达量显著低于A、C、D、E组,C、D、E组显著低于A组,C、D组低于E组,比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论 h USCs对大鼠SCI具有修复作用,通过联合ch ABC可促进SCI修复,其机制可能是通过促进NGF和BDNF表达,抑制神经细胞凋亡,发挥保护作用。     

联合应用PARP-1与Caspase-3抑制剂对脊髓损伤大鼠神经细胞凋亡的影响

目的:探讨联合应用多聚腺嘌呤二核苷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-aminobenzamide,3-AB)和Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK对脊髓损伤大鼠神经细胞凋亡的影响。方法:120只成年健康SD大鼠随机分为假手术组(A组)、模型组(B组)、PARP-1抑制剂组(C组)和联合用药组(D组),每组30只。以Allen′s打击法制备大鼠脊髓损伤模型,每组分别于造模后1d、3d、7d取5只大鼠行BBB评分,处死后利用免疫组化方法检测损伤部位脊髓内PARP-1、凋亡诱导因子(AIF)、Caspase-3及Bcl-2的表达;各时间点各组剩余大鼠处死后利用Western blotting检测PARP-1、Caspase-3蛋白表达水平,实时荧光定量PCR检测PARP-1、AIF、Caspase-3及Bcl-2的m RNA水平,采用原位末端标记(TUNEL)法检测神经细胞凋亡情况。结果:造模后1d时B、C、D组大鼠BBB评分均为0分;3d时三组间的评分无统计学差异;7d时D组及C组明显高于B组,且D组最高(P0.05)。免疫组化及Western blotting结果显示,脊髓损伤后1~7d,B组脊髓组织中PARP-1、AIF及Caspase-3表达逐渐增强,Bcl-2表达逐渐减弱(P0.05);与B组比较,D组及C组的PARP-1、AIF、Caspase-3表达均显著降低,且D组最低(P0.05);而D组及C组的Bcl-2表达显著高于B组,且D组最高(P0.05)。实时荧光定量PCR检测各目的基因表达水平与其蛋白水平一致。TUNEL结果显示,B组脊髓损伤后3d凋亡细胞最多,7d时数量减少,但仍保持在较高水平(P0.05);D组及C组凋亡细胞指数均显著低于B组,且D组最低(P0.05)。结论:联合应用PARP-1抑制剂3-AB和Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK可有效抑制大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡,其机制可能与PARP-1、AIF、Caspase-3的表达抑制及Bcl-2的表达上调有关。     

三七皂苷R1对大鼠脊髓损伤后线粒体功能和神经炎症的作用及相关机制研究

【摘要】 目的：探究三七皂苷R1（notoginsenoside R1,NGR1）对大鼠脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）后线粒体功能和神经炎症的作用及相关机制。方法：SPF级2月龄SD雄性大鼠80只,体质量为250～280g,按随机数字表法分为A1组、B1组、C1组和D1组,每组各20只。A1组仅暴露脊髓,B1组、C1组和D1组大鼠采用改良的Allen′s打击法建立急性SCI模型。A1组和B1组腹腔注射生理盐水,C1组、D1组腹腔注射对应剂量的NGR1和ML385[核因子E2 相关因子2（nuclear factor E2 related factor2,Nrf2）抑制剂]。给药1d、2d、3d采用BBB评分法评估大鼠后肢运动功能恢复情况;给药结束后,各取3只大鼠脊髓样本,铬化青染色与TUNEL染色观察大鼠脱髓鞘及细胞凋亡;利用试剂盒评估脊髓组织线粒体功能;ELISA检测脊髓组织炎症因子的表达;免疫荧光双染色检测脊髓组织离子钙结合衔接分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba1）+诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）+细胞数;RT-qPCR检测脊髓组织Nrf2、血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）mRNA的表达;Western-blot检测脊髓组织Nrf2、HO-1、Bcl2 相关X（BCL2-associated X,Bax）蛋白、细胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2,Bcl-2）蛋白表达。将购买的PC12细胞分为A2组、B2组、C2组和D2组。A2组正常培养,B2组、C2组和D2组细胞在含H2O2的培养基中培养,C2组和D2组分别加入的NGR1和ML385。各组细胞培养24h后采用CCK8法检测PC12细胞活性;Annexin V-FITC/PI染色检测PC12细胞凋亡;ELISA检测PC12细胞中炎症因子的表达;RT-qPCR检测PC12细胞Nrf2、HO-1 mRNA的表达;Western-blot检测PC12细胞Nrf2、HO-1、Bax蛋白、Bcl-2蛋白表达。结果：与A1组相比,B1组大鼠BBB评分降低,脱髓鞘加重,细胞凋亡增加,超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性下降,丙二醛（malondialdehyde,MDA）浓度、磷脂酶A2（phospholipase A2,PLA2）活性升高,肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素-8 （interleukin-8,IL-8）、白介素-6（interleukin-6,IL-6）水平升高,Iba1+iNOS+细胞数增加,Bax蛋白、Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达减少（P＜0.05）;与B1组和D1组相比,C1组大鼠BBB评分升高（P＜0.05）,脱髓鞘减轻,细胞凋亡减少,SOD活性、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性升高,MDA浓度、PLA2活性降低,TNF-α、IL-8和IL-6水平降低,Iba1+iNOS+细胞数减少,Bax蛋白表达减少,Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白、Bcl-2蛋白表达增加（P＜0.05）。与A2组相比,B2组细胞活性降低,细胞凋亡增加,TNF-α、IL-8和IL-6水平升高,Bax蛋白、Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达减少（P＜0.05）;与B2组和D2组相比,C2组细胞活性升高,细胞凋亡减少,TNF-α、IL-8和IL-6水平降低,Bax蛋白表达减少,Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白、Bcl-2蛋白表达增加（P＜0.05）。结论：NGR1能够减轻SCI大鼠脊髓细胞凋亡及氧化应激,促进大鼠运动功能恢复,改善大鼠SCI后线粒体功能和神经炎症;NGR1能够提高PC12细胞活性,抑制其凋亡和炎症水平,其通过激活Nrf2/HO-1信号通路发挥作用。     

丙泊酚对心肌细胞Bcl-2蛋白表达的影响

目的观察丙泊酚对Bcl-2、Bax蛋白表达的影响,从而从另外一个角度说明丙泊酚对心肌的保护作用。方法培养的心肌细胞随机分为五组:阿霉素(ADR)损伤组(A组),25μmol/L丙泊酚(PR) ADR组(B组),50μmol/L PR ADR组(C组),100μmol/L PR ADR组(D组)和正常对照组(E组),每组10个样本。通过电镜观察以及免疫组化方法检测Bcl-2、Bax蛋白表达变化。结果Bcl-2蛋白表达水平A、B、C、D组高于E组(P<0.05或P<0.01);B、C、D组亦明显高于A组(P<0.05或P<0.01),Bax蛋白的表达A、B、C、D组明显高于E组(P<0.05或P<0.01),B、C、D组亦明显低于A组(P<0.05)。结论从Bcl-2蛋白表达的变化可以看到丙泊酚的心肌保护作用。     

银杏叶提取物对大鼠急性脊髓损伤后神经功能恢复的作用及其机制

目的:观察银杏叶提取物(EGb)对大鼠实验性脊髓损伤后组织结构及运动功能恢复的作用,探讨其对急性脊髓损伤的作用机制。方法:120只SD雄性大鼠,随机分为假手术组(A组)、损伤对照组(B组)、甲基强的松龙(MP)治疗组(C组)和EGb治疗组(D组),每组30只。B、C、D组用Allen′s法以50g·cm致伤大鼠T9脊髓制作损伤模型,B组为单纯脊髓损伤,不给药;C组为脊髓损伤后30min内,由腹腔注入MP30mg/kg;D组为术后至处死前每天腹腔给予EGb17.5mg/kg;A组只打开T9椎板,不打击脊髓,不给药。术后24h、3d、5d、7d、14d对大鼠进行脊髓运动功能(BBB)评分。于术后24h、3d、5d、7d、14d处死动物(n=6),取T9节段脊髓,切片苏木素-伊红(HE)染色观察脊髓大体组织结构变化,用免疫组织化学方法检测B细胞淋巴瘤/白血病基因-2(Bcl-2)和B细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白x(Bax)在脊髓前角运动神经元中的表达变化情况。结果:各时间点B、C、D组大鼠脊髓运动功能(BBB)评分均显著低于A组(P<0.01),伤后7d、14d时C、D组评分显著高于B组(P<0.05),各时间点C组与D组评分比较无统计学意义(P>0.05)。HE染色C组和D组大鼠脊髓损伤区较B组坏死程度轻、形成囊腔少,A组正常;1周后D组较C组片状出血灶少,神经细胞肿胀不明显。各时间点B、C、D组大鼠损伤脊髓前角运动神经元中Bcl-2阳性细胞数均显著高于A组(P<0.01),C、D组显著高于B组(P<0.01),7d、14d时D组显著高于C组(P<0.05);各时间点B、C、D组大鼠损伤脊髓前角运动神经元中Bax阳性细胞数均显著高于A组(P<0.01),C、D组显著低于B组(P<0.01),7d、14d时D组显著低于C组(P<0.01)。结论:EGb可能通过抑制Bax表达、提高Bcl-2表达,抑制脊髓损伤后神经元凋亡,在运动功能恢复、损伤脊髓组织保护上发挥其有益作用,1周后EGb仍能抑制脊髓损害后的继发性损伤。     

抑制TNFR/RIPK信号通路对大鼠急性脊髓损伤后神经功能的影响

目的 :探讨应用坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)抑制TNFR/RIPK介导的坏死性凋亡信号通路对大鼠急性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的作用。方法:72只雄性SPF级SD大鼠,体重0.25~0.30kg,随机分为4组:假手术组(Sham组,A组)、假手术+Necrostatin-1组(Sham+Nec-1组,B组)、SCI+二甲基亚砜(DMSO)(DMSO组,C组)、SCI+Nec-1组(Nec-1组,D组)。C、D组采用钳夹法制作大鼠急性SCI模型。所有大鼠硬膜下置管,A组不给药,B组和D组造模后30min经导管注射1μl Nec-1(25μg/μl),C组注射等量DMSO,1次/d,至取材时间点。各组分别于造模后12h、24h和3d三个时间点每组取6只大鼠,先行Basso/Beattie/Bresnahan(BBB)评分,再处死动物取脊髓组织。12h时间点动物处死前1h腹腔注射碘化丙啶(propidine iodide,PI)1mg/kg,取材检测脊髓组织PI红染细胞数;24h时取材采用苏木素-伊红(HE)染色观察脊髓损伤情况、尼氏(Nissl)染色观察神经元存活数目、Western Blot(WB)检测Bcl-2、坏死性凋亡蛋白RIPK1及RIPK3的表达水平;3d时取材行Tunel染色观察细胞凋亡情况。结果:造模后A组和B组各时间点的BBB评分均正常,C、D组各时间点均显著性低于A、B组,D组各时间点的BBB评分均显著高于同时间点C组(P0.05)。造模后12h,D组PI红染细胞较C组明显减少,神经元崩解减轻(P0.05)。造模后24h,A组和B组脊髓组织HE和Nissl染色正常,D组脊髓组织损伤程度和存活神经元数量均优于C组,差异有统计学意义(P0.05);A组和B组Bcl-2、RIPK1及RIPK3均低水平表达,C组RIPK1及RIPK3表达显著性升高,D组Bcl-2表达较C组上调,RIPK1及RIPK3表达显著性下降,C、D两组比较差异均有统计学意义(P0.05)。造模后3d,A组和B组可见少量凋亡小体,C组和D组明显增多,但D组凋亡小体数量较C组明显减少(P0.05)。结论:抑制TNFR/RIPK信号通路可以减轻大鼠急性SCI后的病理变化,改善行为学评分,促进脊髓神经功能恢复。     

丙泊酚对新生大鼠海马神经元形态结构及生长相关蛋白表达的影响

目的观察丙泊酚麻醉对新生大鼠海马神经元形态结构及生长相关蛋白表达的影响。方法雄性SD大鼠175只,日龄7d,体重8~15g,随机分为对照组(A组)、丙泊酚25mg/kg组(B组)、丙泊酚50mg/kg组(C组)、丙泊酚100mg/kg组(D组)和丙泊酚200mg/kg组(E组),每组35只。A组不注射任何药物,B、C、D和E组分别腹腔注射丙泊酚25、50、100和200mg/kg。每组取5只大鼠,于苏醒后即刻抽取动脉血样进行血气分析。各组其余大鼠又随机分成等份的两个亚组:A1和A2组、B1和B2组、C1和C2组、D1和D2组、E1和E2组。A1、B1、C1、D1和E1组大鼠于苏醒后2h用透射电镜观察海马神经元的形态学变化,采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹法(Western blot)检测海马脑源性神经营养因子(BDNF)、Bcl-2mRNA和蛋白的表达;A2、B2、C2、D2和E2组大鼠苏醒后放回笼中继续饲养至9w时,再行上述相同实验。结果五组大鼠动脉血pH值、PaO2、PaCO2、碳酸氢根离子浓度(HCO-3)、剩余碱(BE)、SaO2差异无统计学意义。A1、A2、B1和B2组大鼠海马神经元基本正常,C1、C2、D1和D2组大鼠海马神经元细胞核肿胀、染色质减少,E1和E2组大鼠海马神经元核碎裂、染色质边集甚至出现凋亡小体。与A1组比较,B1、C1、D1和E1组大鼠海马组织BDNF mRNA、Bcl-2mRNA、BDNF蛋白和Bcl-2蛋白表达均下调(P0.05);与A2组比较,B2、C2、D2和E2组大鼠海马组织BDNF mRNA、Bcl-2mRNA、BDNF蛋白和Bcl-2蛋白表达也均下调(P0.05)。结论丙泊酚麻醉破坏海马神经元的形态结构,其机制可能与其抑制海马BDNF、Bcl-2的表达有关。     

神经营养素-3对大鼠急性脊髓损伤后Bcl-2和Bax表达的影响

目的:观察神经营养素-3(NT-3)对大鼠急性脊髓损伤后B细胞淋巴瘤/白血病基因-2(Bcl-2)和B细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白x(Bax)表达的影响,探讨NT-3对脊髓损伤的作用及其可能的分子机制。方法:105只SD大鼠随机分为假手术组(A组)、损伤对照组(B组)和NT-3治疗组(C组),每组35只。B、C组用改良Allen′s法以30g·cm致伤大鼠T8脊髓制作损伤模型,C组经蛛网膜下腔导管于术后即刻、4h、8h、12h、24h、3d、7d注入NT-320μl(含NT-3200ng),B组在相同时间点给予等量生理盐水;A组打开椎板后蛛网膜下腔置管,不损伤脊髓,不给药。术后24h、3d、7d、14d对大鼠进行脊髓运动功能(BBB)评分。于术后4h、8h、12h、24h、3d、7d、14d处死动物(n=5),取T8节段脊髓,甲苯胺蓝(Nissl)染色观察脊髓前角运动神经元变化情况,用免疫组织化学方法检测Bcl-2和Bax在脊髓前角运动神经元中的表达变化情况。结果:各时间点C组和B组大鼠BBB评分均显著低于A组(P<0.01),但C组显著高于B组(P<0.05或0.01)。Nissl染色C组大鼠脊髓损伤区较B组出血少、残存神经元多,A组正常。各时间点C组和B组大鼠损伤脊髓前角运动神经元中Bax阳性细胞平均光密度(AOD)值均显著高于A组(P<0.01),但C组显著低于B组(P<0.05或0.01);各时间点C组和B组大鼠损伤脊髓前角运动神经元中Bcl-2阳性细胞AOD值均显著低于A组(P<0.01),但C组显著高于B组(P<0.05或0.01)。结论:NT-3可能通过抑制Bax表达,提高Bcl-2表达,抑制脊髓损伤后神经元凋亡,从而保护损伤的脊髓组织,这可能是NT-3对脊髓损伤具有保护作用的机制之一。     

B淋巴细胞瘤-2蛋白多位点磷酸化在大鼠脊髓损伤后细胞自噬中的表达研究

目的探讨大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后细胞自噬的变化及其与B淋巴细胞瘤-2(Bcell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白多位点磷酸化的关系。方法取40只8周龄雄性SD大鼠,采用改良Allen法制备SCI模型;将造模成功的36只大鼠随机分为SCI组、自噬抑制剂组、自噬促进剂组,每组12只。另取12只大鼠仅切除椎板、不损伤脊髓,作为假手术组。造模结束后,自噬抑制剂组及自噬促进剂组分别于脊髓鞘内注射20μL600 nmol/L 3-甲基腺嘌呤、25 nmol/L雷帕霉素,假手术组及SCI组仅注射20μL生理盐水;每天1次,连续4周。造模后1 d及1、2、4周,采用BBB评分法评价各组大鼠后肢运动功能。末次注射后24 h处死各组大鼠并取脊髓组织,ELISA法检测脊髓组织中过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性及TNF-α、IL-1β水平;HE染色观察脊髓组织形态学变化;透射电镜观察脊髓组织中线粒体超微结构变化;免疫荧光染色检测自噬相关蛋白(Beclin1)、微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)蛋白表达;TUNEL染色观察脊髓组织神经细胞凋亡;免疫荧光双染检测LC3/TUNEL阳性细胞表达;Western blot检测细胞Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、Bcl-2及p-Bcl-2(Ser87)、p-Bcl-2(Ser70)蛋白表达。结果与假手术组相比,SCI组各时间点BBB评分降低,MPO活性、TNF-α、IL-1β水平升高;神经细胞周围间隙增大,细胞肿胀、出现空泡,线粒体中出现自噬小体;Beclin1及LC3蛋白阳性率、神经细胞凋亡率显著升高;LC3、TUNEL阳性细胞增多;Bax、p-Bcl-2(Ser87)、p-Bcl-2(Ser70)蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低;以上指标比较差异均有统计学意义(P0.05)。与SCI组相比,自噬抑制剂组各时间点BBB评分降低,MPO活性、TNF-α、IL-1β水平升高;线粒体中出现少量自噬囊泡;Beclin1及LC3蛋白阳性率降低,神经细胞凋亡率显著升高;LC3阳性细胞减少、TUNEL阳性细胞增多;Bax、p-Bcl-2(Ser87)、p-Bcl-2(Ser70)蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低。而自噬促进剂组结果与自噬抑制剂组相反;以上指标组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论大鼠SCI后通过诱导细胞自噬可降低神经细胞凋亡,保护脊髓功能,其机制可能与抑制Bcl-2蛋白多位点磷酸化有关。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对大鼠脊髓损伤后神经功能恢复的影响

【摘要】 目的：研究经蛛网膜下腔给予表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate,EGCG）对大鼠脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）后神经功能恢复的影响及其作用机制。方法：成年雌性SD大鼠40只,随机分为4组,每组10只,假手术组（A组）仅切除椎板;对照组（B组）SCI后,蛛网膜下腔注射同体积载体溶液;10mg/kg EGCG治疗组（C组）SCI后经蛛网膜下腔注射EGCG 10mg/kg;20mg/kg EGCG治疗组（D组）SCI后经蛛网膜下腔注射EGCG 20mg/kg。改良Allen法（40g·cm）制作T10节段SCI模型,L4水平蛛网膜下腔注射EGCG或载体溶液。术前、术后1d、术后3d及术后1、2、3、4周进行盲法BBB评分、斜板试验;术后4周时处死大鼠,病理学检查（Luxol fast blue染色）观察脊髓损伤部位残余髓鞘情况;免疫组化及Western blot法检测胶质细胞源性营养因子（GDNF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、Bcl-2和Bax的表达水平。结果：A组术前及术后各时间点BBB评分均为21分,斜板试验角度无明显变化;术后各时间点B、C组和D组BBB评分及斜板试验角度均小于A组（P＜0.05）;术后1d、3d时,B、C组和D组BBB评分以及斜板试验角度无统计学差异（P＞0.05）;术后1、2、3、4周时,C、D组的BBB评分及斜板试验角度均大于B组（P＜0.05）,C组的BBB评分及斜板试验角度与D组比较均无统计学差异（P＞0.05）。术后4周时,B、C、D组大鼠脊髓损伤部位的髓鞘残余面积均小于A组（P＜0.05）,C、D组明显大于B组（P＜0.05）,在损伤脊髓中心D组明显大于C组（P＜0.05）。术后4周时免疫组化检查,B、C、D组的BDNF、GDNF、Bcl-2和Bax的阳性表达强于A组,C、D组的BDNF、GDNF和Bcl-2的阳性表达强于B组,Bax的阳性表达弱于B组。术后4周时Western blot法检测,B、C、D组的BDNF、GDNF、Bcl-2和Bax的表达高于A组（P＜0.05）;C、D组的BDNF和GDNF表达明显高于B组（P＜0.05）,C组与D组无统计学差异（P＞0.05）;C、D组的Bcl-2表达明显高于B组（P＜0.05）,C组与D组比较无统计学差异（P＞0.05）;C组和D组的Bax表达明显低于B组（P＜0.05）,D组明显低于C组（P＜0.05）。结论：EGCG可有效促进大鼠SCI后的神经功能恢复,其机理可能与髓鞘的丢失减少、神经营养因子BDNF和GDNF的表达上调及细胞凋亡被抑制等有关。     

槲皮素抑制TLR4/NF-κB通路介导的炎症反应减轻脊髓损伤

[目的] 探讨槲皮素(Quecetin,Que)对大鼠脊髓损伤保护作用及可能机制。[方法] SD大鼠60只,随机分为3组:假手术组(sham组),脊髓损伤组(SCI组),槲皮素治疗组(Que+SCI组)。采用改良的Allen's方法制备大鼠脊髓损伤模型。Que+SCI组大鼠术后每天给予20 mg/kg的槲皮素治疗,持续14 d。脊髓损伤后1、3、7和14 d采用BBB评分法评估各组大鼠后肢的运动功能。术后14 d,收集大鼠脊髓组织,HE染色法观察组织病理变化,蛋白印迹法评价槲皮素对TLR4/NF-KB信号通路的作用。炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)的产生采用酶联免疫法检测。此外,通过蛋白印迹法测定凋亡相关蛋白cleaved-caspase 3、Bax和Bcl-2的表达水平。[结果] 术后1、3、7和14 d,Que+SCI组BBB评分显著高于SCI组(P0.05)。HE染色结果发现SCI组可见明显的空洞形成,空洞周围有胶质瘢痕增生,而在Que+SCI组上述病理改变显著减轻。Que+SCI组的TLR4/NF-κB信号通路蛋白、TNF-α和IL-1β,以及cleaved-caspase 3和Bax蛋白表达水平显著低于SCI组(P0.05),而Que+SCI组的Bcl-2蛋白表达水平显著高于SCI组(P0.05)。[结论] 槲皮素抑制TLR4/NF-KB信号通路介导的炎症反应和细胞凋亡从而减轻脊髓损伤。     

脊髓减压联合电针对急性上颈段重度脊髓压迫损伤影响的实验研究

目的:探究脊髓减压联合电针对急性上颈段重度脊髓压迫损伤大鼠的治疗效果和可能的作用机制。方法:SPF级Wistar大鼠30只随机分为5组(对照组A、B,实验组C、D、E),每组6只,采用经寰枕间隙置入球囊导管加压造成脊髓压迫损伤的方法构建脊髓损伤模型。A组无任何干预,空白对照,B组置入球囊导管后不加压,做假手术对照,C、D、E组加压48 h后松球囊脊髓减压,C组取百会、大椎穴进行电针干预,连续波,频率2 Hz,治疗时间15 min,持续治疗14 d,D组于大鼠尾静脉注射甲强龙进行甲强龙冲击治疗,E组不再行任何治疗干预。14 d后5组大鼠全部行腹主动脉取血和脊髓损伤组织取材,采用BBB评分法对5组大鼠的运动功能进行评价,ELISA法检测损伤组织及血清中血小板活化因子(platele-activating factor,PAF)的含量,Western blot法检测损伤组织中Caspase-9的表达。结果:BBB评分:对照组A、B在实验组压迫后1、48 h,实验组治疗后24 h,3、7、14 d等6个时间点上均为(21.000±0.000)分,实验组评分始终低于对照组,C、D组评分显著高于E组(P0.05),C、D组评分相近(P0.05)。ELISA法测PAF结果显示:A、B、D、E组血清中PAF浓度相近(P0.05),C组血清中PAF浓度较其余4组低(P0.05),A、B组组织中PAF浓度结果相近(P0.05),C组组织中PAF浓度较A、B组高(P0.05),D组组织中PAF浓度较A、B、C组高(P0.05),E组组织中PAF浓度较其余4组高(P0.05);Western blot法检测结果显示:A、B组Caspase-9的表达量相近(P0.05),C组表达较A、B组高(P0.05),D组表达量较A、B、C组高(P0.05),E组表达较A、B、C、D组高(P0.05)。结论:脊髓减压联合电针治疗急性上颈段重度脊髓压迫损伤较脊髓减压联合甲强龙和单纯脊髓减压效果更佳,其作用机制可能与降低脊髓损伤组织中PAF的含量与下调其Caspase-9蛋白的表达有关。     

BMSCs移植联合督脉电针对大鼠脊髓损伤后神经功能恢复的影响

目的 探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植联合督脉电针对大鼠脊髓损伤(SCI)后神经功能恢复的影响. 方法 从2011年3月至7月,采用全骨髓差速贴壁培养法进行SD大鼠BMSCs的体外分离与培养;利用多中心急性脊髓损伤打击器(MASCIS Impactor)建立大鼠T11脊髓损伤模型,建模成功后将大鼠随机分为4组:对照组(A组)、电针组(B组)、BMSCs移植组(C组)、联合组(D组).SCI后1周,C组与D组大鼠自尾静脉注射移植BMSCs悬液0.1 ml,A组与B组自大鼠尾静脉注射无血清的DMEM/F12培养液0.1 ml,B组与D组接受督脉电针治疗,1次/天.于SCI后1、2、4、8周采用BBB评分法进行后肢运动功能评分;于SCI后8周采用SEP检测脊髓传导功能,采用HE染色观察脊髓空洞大小,采用免疫组化染色检测神经丝蛋白(NF200)的表达.实验中获得的数据采用单因素方差分析. 结果 SCI后2、4、8周,与A组比较,B、C、D组BBB评分均显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05);与B、C组比较,D组BBB评分升高更明显,差异有统计学意义(P＜0.05).SCI后8周,与A组比较,B、C、D组SEP潜伏期缩短、波幅增高,差异有统计学意义(p＜0.05);与R、C组比较,D组SEP潜伏期更短,波幅更高,差异有统计学意义(P＜0.05).SCI后8周,4组大鼠脊髓组织损伤区均可见组织结构紊乱,细胞肿胀,空泡变性,且损伤区均可见瘢痕组织及空洞形成,其中A组脊髓空洞最大,B组和C组次之,D组最小.SCI后8周,4组大鼠脊髓组织均有NF200阳性表达,与A组比较,B、C、D组NF200阳性表达增强,差异有统计学意义(P＜0.05);与B、C组比较,D组NF200阳性表达更强,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 BMSCs移植联合督脉电针对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的促进作用更为显著,优于单纯BMSCs移植和督脉电针治疗.     

氨基胍对大鼠急性脊髓损伤后脊髓水肿的作用机制研究

目的氨基胍(aminoguanidine,AG)能显著减轻脑外伤及中风动物模型脑水肿,提高神经功能恢复程度。探讨AG对大鼠急性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后脊髓水肿的作用及相关机制。方法取成年雄性SD大鼠150只(体重230～255 g),分为对照组(A组,25只)、假损伤组(B组,25只)、SCI后未治疗组(C组,25只)和SCI后AG治疗组(75只);AG治疗组按给药剂量分为AG 75 mg/kg组(D组,25只)、AG 150 mg/kg组(E组,25只)和AG300 mg/kg组(F组,25只)。A组未行任何处理,B组仅行椎板切除术但不治疗;C、D、E、F组制备静压型大鼠SCI模型后,C组腹腔注射5%DMSO,D、E、F组腹腔注射相应剂量AG。于造模后0、12、24、48 h用干湿重法检测受损脊髓组织含水量以筛选最佳剂量,进一步用伊文思兰(Evans blue,EB)法评测血-脊髓屏障功能,用RT-PCR检测水通道蛋白4(aquaporins 4,AQP4)mRNA表达,Western blot和免疫组织化学染色检测AQP4蛋白表达。结果脊髓组织含水量检测示,E组在造膜后12、24、48 h对SCI后脊髓组织水肿有明显抑制作用(P<0.05),选择该剂量组用于后续实验。造模后12、24、48 h,E组EB含量明显低于C组(P<0.05),降低血-脊髓屏障通透性。RT-PCR检测结果示造模后12、24、48 h,B、E组AQP4 mRNA表达明显低于C组;Western blot检测示造模后24、48 h,B、E组AQP4蛋白表达明显低于C组;免疫组织化学染色示造模后48 h,B、E组AQP4蛋白表达明显低于C组,差异均有统计学意义(P<0.05);但各指标各时间点B、E组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论急性SCI后大鼠经150 mg/kg AG治疗后,能降低AQP4表达,改善脊髓水肿,减轻损伤。     

表达VEGF的重组腺相关病毒对大鼠创伤性脊髓损伤的保护作用及其机制研究

目的探讨表达VEGF的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)对大鼠创伤性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的保护作用及其机制。方法取144只成年雄性SD大鼠(体重200～250 g)随机分为4组,每组36只。假手术组(A组)仅手术暴露脊髓。模型对照组(B组)、rAAV-绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein,GFP)组(C组)、rAAV-hVEGF165-GFP组(D组)制备创伤性SCI大鼠模型,术后即刻分别予以20μL生理盐水、rAAV-GFP病毒、rAAV-hVEGF165-GFP病毒脊髓注射治疗。术后3、7 d采用BBB评分观察大鼠后肢运动功能变化;术后7 d通过脊髓组织尼氏小体染色观察脊髓组织病理学变化,脊髓组织神经元透射电镜检测及TUNEL凋亡细胞染色观察脊髓神经元凋亡,Western blot检测水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP-4)表达;术后1、3、5、7 d ELISA法检测VEGF165蛋白表达。结果 BBB评分显示术后3、7 d D组神经功能较B、C组显著改善(P<0.05)。尼氏小体染色显示术后7 d D组脊髓组织结构破坏明显轻于B、C组(P<0.05)。ELISA检测显示D组VEGF165蛋白表达呈低剂量缓释表达,术后3、5、7 d,D组VEGF165蛋白表达均高于其他3组(P<0.05)。透射电镜检测及TUNEL凋亡细胞染色结果显示术后7 d D组脊髓神经元凋亡较B、C组显著减少,凋亡率显著低于B、C组(P<0.05)。Western blot结果显示术后7 d D组脊髓组织AQP-4蛋白表达明显较B、C组减少(P<0.05)。结论表达VEGF的rAAV通过抗神经元凋亡及减轻脊髓水肿对大鼠创伤性SCI起保护作用。     

体外转基因成肌细胞移植对大鼠损伤脊髓细胞凋亡的影响

目的：探讨大鼠脊髓损伤后胚胎脊髓和腺病毒介导的脑源性神经生长因子（AxCA-BDNF)体外转基因成肌细胞移植对大鼠脊髓细胞凋亡的影响。方法：将动物分为：大鼠脊髓半切洞损伤明胶海绵填充组（A组）,大鼠脊髓半切洞损伤应用胚胎脊髓移植组（B组）,脊髓半切洞损伤损伤AxCA-BDNF基因转染的成肌细胞移植组（C组）大鼠脊髓半切洞损伤后应用胚胎脊髓和AxCA-BDNF基因转染的成肌细胞移植组（D组）。手术后1、3、7、14、28d应用行为学和电生理检查观察大鼠功能恢复情况,对脊髓损伤区进行细胞凋亡的检测（TUNEL）以及Bcl-2蛋白表达的测定（免疫组化法）。采用计算机图像分析技术,进行定量分析。结果：A、B、C、D四组中均发现凋亡细胞及Bcl-2蛋白阳性表达细胞,图像分析发现,各组凋亡细胞核为A＞B＞C＞D;Bcl-2免疫反应阳性细胞表达顺序为D＞C＞B＞A,Bcl-2免疫反应阳性细胞的表达与大鼠后肢功能恢复有同样的变化趋势。结论：大鼠胚胎脊髓和体外转基因成肌细胞移植能抑制脊髓损伤后的细胞凋亡。     

右美托咪定预处理对内毒素血症大鼠海马区Bcl-2、Bax表达及认知功能的影响

目的 探讨右美托咪定(dexmedetomidine,Dex)预处理对内毒素血症大鼠海马区凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表达及认知功能的影响. 方法 健康清洁SD雄性大鼠24只,6周龄,体重200～250 g,采用随机数字表法将其分为3组(每组8只):对照组(C组)、内毒素组(E组)和Dex组(D组).D组腹腔注射Dex 50 μg/kg,30min后尾静脉注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)5 mg/kg;E组腹腔注射等容量(2ml)生理盐水,30 min后尾静脉注射LPS 5 mg/kg;C组腹腔注射等容量生理盐水,30 min后尾静脉注射等容量生理盐水.各组于给药后12h,用Morris迷宫测试大鼠认知功能的变化,其后处死大鼠,取大脑海马组织.TUNEL法检测组织凋亡指数(apoptosis index,AI),免疫组织化学法分别检测Bcl-2、Bax蛋白的表达.结果 与C组比较,E组和D组潜伏期和游泳总距离增加,穿越平台次数减少(P＜0.05);与C组比较,E组Bcl-2表达差异无统计学意义(P＞0.05),Bax表达上调,Bcl-2/Bax比值降低(P＜0.05);D组Bcl-2和Bax表达上调,Bcl-2/Bax比值升高(P＜0.05).与E组比较,D组AI明显降低,Bcl-2表达上调,Bax表达下调,Bcl-2/Bax升高(P＜0.05). 结论 Dex可以改善内毒素血症大鼠的认知功能,其机制可能与调节Bcl-2和Bax蛋白表达,减轻海马区神经元凋亡有关.     

基于TNFR/RIPK1通路探索紫草素对大鼠脊髓损伤的作用及机制

目的:初步探讨紫草素对大鼠急性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后神经功能恢复的影响及作用机制。方法:将96只Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠分为4组:假手术组,即A组;假手术+紫草素组,即B组;脊髓损伤+二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)组,即C组;脊髓损伤+紫草素组,即D组;每组24只。C、D组采用钳夹法制作大鼠急性SCI 模型。所有大鼠硬膜下置管,A 组不给药,B组和D组造模后30 min 经导管注射紫草素100 mg·kg^-1,C组注射等量 DMSO,每日1次,至取材时间点。各组分别于造模后6、12 h和3 d 每组取8只大鼠,行 Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分及造模后1、3、7、14、21 d行斜板实验,再处死动物取脊髓组织。造模后1 h 每组大鼠腹腔注射碘化丙啶(propidine iodide,PI)1 mg·kg^-1,术后24 h取材检测脊髓组织 PI 红染细胞数;24 h 时取材采用苏木素-伊红(haematoxylin eosin,HE)染色观察脊髓损伤情况,尼氏(Nissl)染色观察神经元存活数量,使用Western-blot技术检测 B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白及凋亡相关蛋白受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1)的表达水平。结果:造模后A组和B组各时间点的 BBB 评分均正常,C、D组各时间点均低于A、B组,D组造模后12 h和3 d的 BBB 评分高于同时间点C组(P<0.05)。造模后12 h,D组PI 红染细胞较C 组明显减少,神经元崩解减轻(P<0.05)。造模后24 h,A 组和 B 组脊髓组织 HE 和 Nissl 染色正常,D 组脊髓组织损伤程度和存活神经元数量均优于 C 组(P<0.05)。Bcl-2、RIPK1蛋白在A 组、B 组表达很低; RIPK1 在C组表达明显增高,在D组表达明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);Bcl-2蛋白在D 组表达高于C 组(P<0.05)。结论:紫草素可减轻大鼠急性SCI后的病理变化,改善行为学评分,促进脊髓神经功能恢复。其具体机制可能与抑制TNFR/RIPK1信号通路介导的坏死性凋亡有关。     

红景天苷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤及其诱导凋亡作用的影响

目的探索红景天苷对大鼠肝脏缺血再灌注(IR)损伤的保护作用及其相关机制。方法将54只SD大鼠随机分成3组(假手术组、IR组、红景天苷组),每组各18只。实验前7 d,红景天苷组每天腹腔注射方式给药(30 mg·kg-1·d-1),IR组和假手术组以相同体积等渗Na Cl溶液代替。建立大鼠肝脏70%IR模型,缺血45 min后恢复血供,再灌注后4、8、16 h每组各处死6只大鼠,立即下腔静脉采血并取肝组织标本。检测大鼠再灌注后不同时间点血清ALT、AST水平;蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-8、Caspase-9的表达;免疫组织化学法观察上述相关凋亡相关分子阳性细胞表达并进行半定量分析;流式细胞仪检测肝细胞凋亡率。采用单因素方差分析比较各组大鼠再灌注后不同时间点血清ALT和AST含量、凋亡相关蛋白相对表达量及细胞凋亡率。结果与假手术组相比,IR组各时间点ALT、AST均上升,红景天苷组ALT、AST均低于IR组(P均0.05)。与IR组相比,红景天苷组Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达降低,Bcl-2表达增加;2组再灌注后各时间点Bcl-2、Bax相对表达量差异均具有统计学意义,再灌注后4 h Caspase-3相对表达量差异有统计学意义,再灌注后8、16 h Caspase-8、Caspase-9相对表达量差异有统计学意义(P均0.05)。再灌注后8 h,红景天苷组、IR组和假手术组肝细胞凋亡率分别为(24.09±2.43)%、(45.71±3.19)%和(5.46±0.34)%,差异有统计学意义(F=4.08,P0.05)。结论红景天苷预处理可以减轻肝脏缺血再灌注损伤,可能与其抑制细胞凋亡内源性和外源性途径有关。     

不同时间点应用甲氨蝶呤对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响

目的探讨不同时间点应用低剂量甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后神经细胞凋亡的作用,探讨其潜在的神经保护机制与合适的给药时机。方法取成年雄性SD大鼠120只,体质量247~286 g,随机分为4组(n=30),分别为假手术组(A组)、对照组(B组)、MTX治疗组(C组)和MTX预防组(D组)。A组仅行椎板切除,B、C、D组采用改良Allen法制备SCI模型;C组于术后1、6、12、18、24 h,D组于术前30 min及术后6、12、18、24 h,经尾静脉注射MTX(0.5 mg/kg);A、B组于术后1、6、12、18、24 h注射等量生理盐水。术后观察大鼠一般情况,于1、3、7、14、21 d采用BBB评分进行神经功能评估;取材行组织学观察脊髓形态学变化,免疫组织化学染色观察半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表达,TUNEL标记观察细胞凋亡水平。结果 B、C、D组实验过程中共死亡10只大鼠,最终各组纳入25只大鼠进行观察。各时间点A组BBB评分均高于B、C、D组(P0.05),从3 d开始C、D组评分明显高于B组(P0.05);D组从3 d开始均高于C组,除21 d(P0.05)外,其余各时间点比较差异均有统计学意义(P0.05)。组织学观察示,A组术后各时间点脊髓组织为正常结构;D组SCI程度轻于B、C组,C组轻于B组;从14 d开始,B、C、D组病变范围基本固定。各时间点B、C、D组Caspase-3及TUNEL阳性细胞数均显著多于A组,B组多于C、D组,比较差异有统计学意义(P0.05);C组Caspase-3阳性细胞数均多于D组,其中3、7、14 d比较差异有统计学意义(P0.05),而TUNEL阳性细胞数仅3、7 d显著多于D组(P0.05)。术后1、3、7、14、21 d,B、C、D组组内Caspase-3、TUNEL阳性细胞数均成正相关(P0.05)。结论低剂量MTX能够通过抑制神经细胞凋亡有效阻止SCI的继发性损伤;预防性应用MTX效果优于单纯治疗性应用。