裂谷热病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

目的根据裂谷热病毒(Rift Valley Fever Virus,RVFV)M片段的保守序列设计并合成特异性引物和TaqMan探针,建立鉴定裂谷热病毒的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。方法合成裂谷热病毒M片段基因,PCR扩增后将其连入pMD18-T载体,构建重组质粒作为阳性标准品,以10倍系列稀释的标准品进行荧光定量PCR扩增,并绘制标准曲线。结果所绘制标准曲线的相关系数为0.999,该检测方法的灵敏度达40copies/μL,特异性好,对除裂谷热病毒外其他病毒(PPRV、HFV、RV、SPPV和GIPV)检测均为阴性。该方法重复性好,批内重复和批间重复的变异系数均小于1%。结论裂谷热病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立为裂谷热病毒的快速准确诊断及流行病学调查提供了有效的手段。     

沙眼衣原体荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立沙眼衣原体实时荧光定量PCR检测技术,以期用于沙眼衣原体的感染检测。方法针对沙眼衣原体ompA基因序列保守区域设计引物和TaqMan探针,构建标准质粒并制作标准曲线,建立沙眼衣原体实时荧光定量检测方法,通过对人型支原体等的检测评价方法的特异性。结果建立的沙眼衣原体荧光定量PCR体系能特异性检测沙眼衣原体,与人型支原体、解脲脲原体、淋球菌、大肠埃希菌EDL933、金黄色葡萄球菌无交叉反应;标准曲线在3.9×109～3.9×103 copies/μl之间线性关系良好(r2=0.99);方法的灵敏度高,检测最低拷贝数为3.9copies/μl;组内及组间变异系数均5%。结论建立的检测沙眼衣原体实时定量PCR方法特异、灵敏,可用于沙眼衣原体感染的早期筛查和临床快速诊断。     

三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR与ELISA检测弓形虫的比较

目的 选取弓形虫基因组中高度保守的多拷贝基因529 bp重复序列、ITS-1序列和B1基因作为real-timePCR检测的靶基因,建立检测弓形虫的三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR的检测方法并且与ELISA检测方法进行比较。方法 将529 bp重复序列、B1基因、ITS-1序列的选定扩增序列进行克隆、测序构建标准品;将构建的3个标准品放在一个体系中进行扩增,进行三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR。结果 529 bp、ITS-1和B1的标准曲线的相关系数(R²)均为0.998,并且扩增效率均为96.724%,扩增片段的Tm值分别为 86.5±0.5 ℃ 、78.8±0.5 ℃、83.1±0.5 ℃;构建的三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR特异性试验表明,529 bp、ITS-1和B1有特异性的溶解曲线峰值分别是86.2 ℃、78.9 ℃和83.3 ℃,阴性对照无扩增曲线;敏感性试验表明,529 bp、ITS-1和B1序列最低检出限分别为 173copies/μL、123copies/μL、和135 copies/μL;Tm值的批内、批间重复试验的变异系数均小于0.13%;ELISA检测猪弓形虫IgG抗体的阳性率41.72%,ELISA与荧光定量PCR检测核酸阳性符合率为53.44%(P＜0.01)。结论 建立弓形虫三重SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测技术具有高特异性和敏感性,可为临床弓形虫的诊断提供科学依据     

实时荧光定量PCR在手足口病肠道病毒快速检测中的应用

目的建立快速检测手足口病肠道病毒的实时荧光定量PCR法,并作出应用分析。方法采用卫生部《手足口病预防控制指南》(2008年版)推荐的RT-PCR法,对丽水市2008年4～5月间发生的172例临床诊断手足口病患者的324份标本进行人肠道病毒、柯萨奇病毒A组16型和肠道病毒EV71型特异性核酸的检测,同时采用实时荧光定量PCR法进行平行检测,比较两者的实验结果,分析实时荧光定量PCR方法的特异性和灵敏度。结果实时荧光定量PCR检测324份标本,肠道病毒通用核酸阳性70份,柯萨奇A16核酸阳性22份,肠道EV71病毒核酸阳性15份,与RT-PCR结果一致,符合率100%。结论实时荧光定量PCR法具有特异性强、灵敏度高等优点,是一种理想的手足口病肠道病毒的检测方法。     

两种检测尼帕病毒的实时荧光定量PCR方法的比较与效果验证

目的 建立稳定可靠的尼帕病毒特异性检测技术和方法,对该病毒进行监测和检测、预警预报.方法 本研究对已建立的两种尼帕病毒的实时荧光定量PCR检测方法的特异性与敏感性进行了比较和验证.结果 研究结果显示两种方法检测体外转录RNA时灵敏度为10 copies/μL,检测活病毒的灵敏度为10 TCID50/mL.特异性检测结果...     

检测基孔肯雅病毒SYBR Green I real-time PCR方法的建立及应用

目的建立一种基孔肯雅病毒的快速诊断方法。方法采用基孔肯雅病毒E1基因的重组质粒作为阳性标准品。优化反应条件,建立针对基孔肯雅病毒的SYBR Green I real-time PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果建立的SYBR Green I real-time PCR检测方法的Ct值与阳性标准品在6.94×10~0～6.94×10~8 copies/μl范围内呈良好的线性关系,相关性为0.997,斜率为-3.571;其检测下限为0.694 copies/μl,且对ZIKV、DENV和JEV等均无特异性扩增;所有稀释倍数的标准品在84.0℃出现特异性熔解峰;组内和组间变异系数均小于2%。采用该方法对93份蚊虫样品进行检测,基孔肯雅病毒核酸阳性率为2.15%,普通PCR核酸阳性率为1.07%。结论成功建立了针对基孔肯雅病毒E1基因的SYBR Green I real-time PCR检测方法。该方法灵敏、特异,可用于基孔肯雅病毒感染的快速诊断。     

汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的通过建立汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法,快速准确地检测汉坦病毒。方法根据汉滩型和汉城型汉坦病S片段基因的序列分别设计特异性探针引物,使用含有目的基因片段的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立检测两型汉坦病毒的实时荧光定量PCR方法。结果建立的检测方法特异性良好,与其他常见病原不发生交叉反应;最低检测限为101copies/μl,灵敏度高;不同梯度定量模板的拷贝数的对数值与Ct值之间线性关系表达式分别为y=-3.4607x＋40.988（HTN）,y=-3.5307x＋39.356（SEO）,扩增效率分别为92.2%（HTN）和92.6%（SEO）,相关系数R2分别为0.9968（HTN）和0.9997（SEO）,呈良好的线性关系,且重复性好。结论建立的实时荧光定量PCR灵敏度高,重复性好,可用于汉坦病毒的快速检测,并可初步辨别汉滩型和汉城型汉坦病毒,对肾综合征出血热的病原早期诊断和流行病学调查有较好的应用价值。     

猪圆环病毒3型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

目的建立针对PCV3的操作简单、重复性好、灵敏度较高的检测方法。方法利用PCR方法扩增PCV3保守区基因片段(312bp),将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-PCV3作为阳性标准品质粒。优化反应条件,建立定量检测PCV3的实时荧光定量PCR方法,并进行敏感性、特异性和重复性验证。结果建立的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法的Ct值与标准品模板在4.24×10~1~4.24×10~8拷贝/μl范围内呈良好线性关系,其相关系数为0.996,斜率为-4.384。该方法特异性强,与PRRSV、FMDV、JEV、PCV2及PRV均无交叉反应;敏感性为4.24×10~1拷贝/μl,比常规PCR方法高10倍;组间和组内重复试验的变异系数均小于2%。利用实时荧光定量PCR方法对采集的155份猪肺组织进行检测,阳性率为36.13%,高于普通PCR阳性检出率的32.25%。结论建立的PCV3SYBR GreenⅠReal-time PCR方法敏感、特异,可用于猪体PCV3感染的快速检测。     

碱性磷酸酶直接标记核酸探针检测乙型肝炎病毒DNA

目的 建立快速、特异、灵敏的碱性磷酸酶直接(AlkPhos Direc)标记核酸探针检测血清中乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)方法。方法 应用 AlkPhos DirecTM将碱性磷酸酶直接标记在HBV DNA全基因序列上制备探针,与目标核酸杂交后加入CDP-Star化学发光试剂,用胶片放射自显影检测HBV DNA。同时检测探针的灵敏度和特异性。比较AlkPhos Direc标记HBV DNA探针与地高辛标记的HBV DNA探针检测临床血清标本80份结果,并对70份临床血清标本的荧光定量PCR方法检测的结果与AlkPhos Direc标记HBV DNA探针斑点杂交检测的结果作相关性分析。结果 探针灵敏度至少为10pg,与地高辛探针比较,用AlkPhos Direct标记探针检测方法的灵敏度为100％,特异性为100％,符台率为100％,用HBV DNA荧光定量PCR方法和AlkPhos Direct标记探针核酸斑点定量方法检测的结果进行相关性比较,r=0.98,P<0.01。结论 AlkPhos Direc标记 HBVDNA探针检测血清中HBV DNA方法灵敏、特异,与地高辛标记的HBV DNA探针检测结果完全符合,与HBVDNA荧光定量PCR方法硷侧的结果有良好的相关性。     

犬库布病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用北大核心CSCD

目的建立可检测狐狸物种中犬库布病毒(CaKoV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。方法利用PCR方法扩增狐狸CaKoV的3D基因504bp,将其克隆到pEASY-Blunt载体,构建重组质粒作为阳性质粒,以其为模板建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,验证其灵敏度、特异性和重复性。结果建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法检测目的基因在6.12×10^(1)~6.12×10^(8)拷贝/μl时呈良好的线性关系,相关系数为0.994,斜率为-4.369,灵敏度6.12×10^(1)拷贝/μl。该方法对于CPV、CDV和CCV未出现特异性扩增。所有标准曲线在溶解温度为86.49℃时出现单一的特异峰。使用本方法检测2021年辽宁、山东地区的253份狐狸临床标本,总阳性率为7.91%。结论建立的CaKoV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法敏感、特异,用于狐狸CaKoV感染的快速检测。     

基因Ⅲ型乙型脑炎病毒Real-time PCR检测方法的建立及应用

目的建立针对云南地区流行的基因Ⅲ型乙型脑炎病毒株Real-time PCR检测方法。方法根据云南地区分离株乙型脑炎病毒株(Yunnan0901)基因组核苷酸序列设计特异性引物,构建pMD18-T-JEV-E质粒,以此为模板进行SYBR GreenⅠReal-time PCR扩增并制作标准曲线,摸索最佳反应体系条件,建立乙型脑炎病毒荧光定量PCR检测方法,并与普通RT-PCR方法相比较。结果建立的SYBR GreenⅠReal-time PCR标准曲线呈现良好的重复性和特异性,与模板浓度呈现良好的线性关系。与RT-PCR方法相比,SYBR GreenⅠReal-time PCR的灵敏度高10倍,而且不与猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、基孔肯雅病毒、辛德毕斯病毒核酸发生非特异性扩增,具有良好的特异性。用该方法检测云南部分地区的蚊虫样品,其中库蚊、按蚊乙型脑炎病毒阳性率分别为17.4%和30.7%,且主要为基因型Ⅲ型。结论本实验建立的检测基因Ⅲ型乙型脑炎病毒的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等特点,可应用于乙型脑炎疫情的监测。     

基因Ⅲ型乙型脑炎病毒Real-time PCR检测方法的建立及应用北大核心CSCD

目的建立针对云南地区流行的基因Ⅲ型乙型脑炎病毒株Real-time PCR检测方法。方法根据云南地区分离株乙型脑炎病毒株(Yunnan0901)基因组核苷酸序列设计特异性引物,构建pMD18-T-JEV-E质粒,以此为模板进行SYBR GreenⅠReal-time PCR扩增并制作标准曲线,摸索最佳反应体系条件,建立乙型脑炎病毒荧光定量PCR检测方法,并与普通RT-PCR方法相比较。结果建立的SYBR GreenⅠReal-time PCR标准曲线呈现良好的重复性和特异性,与模板浓度呈现良好的线性关系。与RT-PCR方法相比,SYBR GreenⅠReal-time PCR的灵敏度高10倍,而且不与猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、基孔肯雅病毒、辛德毕斯病毒核酸发生非特异性扩增,具有良好的特异性。用该方法检测云南部分地区的蚊虫样品,其中库蚊、按蚊乙型脑炎病毒阳性率分别为17.4%和30.7%,且主要为基因型Ⅲ型。结论本实验建立的检测基因Ⅲ型乙型脑炎病毒的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等特点,可应用于乙型脑炎疫情的监测。     

Real-time RT-PCR检测西尼罗病毒一步法的建立

目的建立针对西尼罗病毒E基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于西尼罗病毒感染样本的快速准确检测和定量。方法针对西尼罗病毒的保守基因E设计引物和探针,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性。结果本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法可以特异性检测出西尼罗病毒,不与日本脑炎病毒及其他病毒产生交叉反应。该方法的最低检出浓度为3.6×102copies/μl,标准曲线的线性范围为3.6×102～3.6×107copies/μl。结论本研究建立的一步法real-time RT-PCR方法敏感性和特异性较高,且不易出现污染引起的假阳性结果,适合用于西尼罗病毒感染样本的检测。     

实时荧光定量PCR在登革热病毒快速检测中的应用

目的应用实时荧光定量PCR快速检测登革热病毒感染。方法采集疑似登革热患者血清,采用实时荧光定量PCR检测登革热病毒,同时采用ELISA检测血清登革热IgM抗体。结果患者发病第7d血清登革热IgM血清抗体A值为0.236和0.237(临界值0.250),高度疑似阳性,第13d血清IgM抗体阳性。患者发病第2d,通用型核酸检测显示血清登革热病毒核酸含量较多,经过治疗,于第7d病毒拷贝下降。发病第2d,核酸检测确定感染病毒为登革热Ⅲ型;发病第13d血清登革Ⅲ型病毒核酸检测阴性。结论实时荧光定量PCR法具有准确性好、灵敏度高等优点,可用于登革热病毒感染的快速检测。     

SARS病毒核酸检测中不同引物对灵敏度的影响

目的筛选灵敏、特异的SARS病毒核酸检测方法。方法采用世界卫生组织(WHO)和中国疾病预防控制中心(中国CDC)推荐的9对SARS病毒核酸检测引物，同时又选择市售的2种SARS荧光定量PCR试剂，分别对不同稀释度的SARS病毒核酸进行RT—PCR、巢式PCR和荧光定量PCR扩增，比较其检测灵敏度和特异性。结果两种荧光定量PCR试剂可检测SARS病毒核酸灵敏度均为0．1TCID50，与普通RT—PCR方法检测灵敏度(0.1TCID50)相同，而较巢式PCR法(0．01TCID50)略低；采用RT—PCR方法扩增SARS核酸时，以WHO推荐的SAR1s／SAR1as、BNIinS／BNIAs、BNIoutS/BnoutAs与中国CDC推荐的CDC-P1 ／P1-灵敏度最高。结论RT—PCR扩增时各引物对之间存在明显差异；荧光定量PCR可作为SARS疑似样本检测的首选方法，必要时再采用RT—PCR和巢式PCR法加以确认。     

液滴式数字PCR与实时荧光定量PCR检测利什曼原虫的方法比较

目的 建立内脏利什曼病液滴式数字PCR检测方法，将其与同时建立的实时荧光定量PCR检测方法进行方法学比较，探究其在内脏利什曼病诊断方面的价值。方法 以杜氏利什曼原虫小环动基体DNA(kinetoplast DNA,kDNA)为分子靶标，根据其约200 bp的保守片段设计引物和探针，建立内脏利什曼病液滴式数字PCR检测方法，比较其与实时荧光定量PCR检测方法的检测限、精密度以及在不同利什曼原虫虫株中的检测效果。结果 液滴式数字PCR检测下限与实时荧光定量PCR检测下限相同，约为1.0×10 copies/μL;随待测样本浓度的降低(1.0×10⁴ copies/μL～1.0×10 copies/μL),液滴式数字PCR检测方法变异系数呈增大趋势(12.07%～62.96%),重复性越差；实时荧光定量PCR变异系数较小(2.96%～4.26%),且不同浓度之间的变异系数差别不大。2种方法在不同利什曼原虫中的检测灵敏度不同。结论 和实时荧光定量PCR相比，液滴式数字PCR在利什曼原虫检测中的灵敏度和重复性没有表现出显著的优势，后续还需更多的研究从分子靶标的选择、灵敏度、...     

不同实时荧光定量PCR仪对外周血中EB病毒DNA检测结果的影响

目的:应用同一种商品化EB病毒核酸定量检测试剂盒在2款实时荧光定量PCR仪同时检测外周血标本中EB病毒载量,探讨不同类型的实时荧光PCR仪对EBV DNA定性和定量检测结果的影响.方法:提取179例外周血标本(包括102例全血和77例血浆)的DNA后,应用EB病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)分别在2款实时荧...     

不同引物检测甲型H1N1流感病毒的比较研究

目的筛选灵敏、特异的甲型H1N1流感病毒核酸检测方法。方法采用国家流感中心推荐的甲型流感病毒(H1N1)核酸引物和1对自行设计的引物,同时选择市售荧光定量PCR试剂盒,分别对不同浓度的流感病毒进行RT-PCR或荧光定量PCR扩增,比较其检测的灵敏度和特异性。结果荧光定量PCR检测H1N1病毒核酸的灵敏度为10-5(病毒稀释度),高于普通RT-PCR的灵敏度10-3~10-4;RT-PCR扩增甲型流感病毒(H1N1)核酸时,自行设计引物的灵敏度为10-4,高于中国CDC推荐引物的灵敏度10-3。2种引物的特异性一致。结论对于甲型(H1N1)流感病毒疑似样品的检测,荧光定量PCR是较灵敏的方法,但从成本和灵敏度两方面考虑,自行设计的引物更适合基层疾控机构采用。     

狂犬病病毒荧光定量RT—PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立狂犬病病毒快速检测法。方法根据狂犬病病毒核蛋白基因的保守序列分别设计两对引物及其相应的TaqMan探针。构建pMD-N重组质粒,建立荧光定量RT-PCR绝对定量标准品,并对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并与普通RT-PCR法进行比较;作重复性和特异性检验后进行临床标本的检测。结果构建了绝对定量的参照质粒,标准曲线相关系数为0.998。狂犬病病毒荧光定量RT-PCR检测反应的灵敏度为10个TCID_(50);5种非狂犬病病原体检测均为阴性。结论建立的狂犬病病毒的荧光定量RT- PCR检测方法快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好,可以应用于临床样品的检测。     

实时荧光定量PCR检测人类EZH2基因方法的建立

目的:建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测人类EZH2基因的方法.方法:将EZH2 RT-PCR扩增片段克隆入载体pGEM-T后,经测序鉴定正确后,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测EZH2,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性.结果:该法检测的最低拷贝数为10,线性范围为101～108拷贝,相关系数r为-1.00,104copies/μl标本的批内变异系数(CV)和日间CV分别为1.0%和2.7%.熔解曲线分析显示单一的峰,熔解温度(Tm)为(83.42±0.13)℃.结论:实时荧光定量PCR方法检测EZH2基因,具有高敏感性、高特异性和高精确性等优点,可作为进一步研究EZH2的方法.