兔退变椎间盘中髓核细胞凋亡与BNIP3基因表达的意义

目的髓核细胞凋亡可能与髓核组织代谢障碍产生缺氧,导致BNIP3基因表达有关。通过观察兔退变椎间盘中髓核组织的细胞密度、细胞凋亡率及BNIP3的表达,为进一步了解髓核细胞凋亡机制提供实验依据。方法健康3月龄雄性新西兰大白兔30只,体重(2.3±0.2)kg,随机分为实验组(n=20)及对照组(n=10)。实验组大白兔采用针刺L3、4、L4、5及L5、6椎间盘制备椎间盘退变模型;对照组仅暴露椎间盘后缝合。术后4、8周通过MRI检查评价椎间盘退变情况,采用组织学观察和TUNEL法检查椎间盘髓核组织中凋亡细胞,用免疫组织化学染色法检测兔椎间盘髓核细胞BNIP3的表达。结果 MRI检查示实验组术后4、8周椎间盘髓核信号强度呈逐渐降低趋势。根据Pfirrmann分级标准,实验组术后4、8周椎间盘退变分级比较,差异均有统计学意义(P0.05)。组织学观察及TUNEL检查示:对照组椎间盘髓核中细胞密度高,可见少量散在的凋亡细胞;实验组术后4、8周时椎间盘髓核组织内细胞密度逐渐降低,可见较多凋亡细胞。各时间点实验组细胞密度、TUNEL染色阳性细胞率与对照组比较,以及实验组各指标两时间点间比较,差异均有统计学意义(P0.05)。对照组椎间盘髓核组织细胞中无BNIP3表达;实验组术后4、8周椎间盘髓核组织细胞中BNIP3表达逐渐增多,BNIP3染色阳性细胞率分别为13.45%±1.16%、32.00%±1.82%,BNIP3灰度值分别为194.32±4.65、117.54±2.11,各时间点间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论椎间盘退变与髓核组织中细胞密度下降有关,细胞凋亡是椎间盘髓核细胞减少的原因之一,BNIP3参与了椎间盘髓核细胞凋亡。     

应用微创技术建立恒河猴腰椎间盘早期退变模型

目的 应用CT定位,经皮穿刺纤维环诱导恒河猴腰椎间盘退变,建立灵长类动物腰椎间盘早期退变模型.方法 恒河猴13只,随机分为三组:(1)造模组:在CT定位下,用20G穿刺针从左侧后方入路经皮穿刺L1,2:(n=12),L2,3、L3,4、L4,5、L5,6(n=13)椎间盘的纤维环全层至椎间盘髓核正中,共64个椎间盘.(2)穿刺对照组:15G穿刺针穿刺1只猴的L1,2椎间盘.(3)正常对照组:L6,7,L7-S1,共26个椎间盘.造模前及造模后4、8、12周对各组椎间盘行MRI检查,并行HE、Masson、番红O、免疫组织化学染色组织学观察.结果 (1)MRI:20G穿刺针穿刺的造模组椎间盘造模前及造模后4、8、12周,椎间盘信号强度按Pfirmann分级均为Ⅰ级.15G穿刺针穿刺椎间盘4周时信号降低(Pfirrmann Ⅲ级),8周时为黑色椎间盘(Pfirmann Ⅳ级).正常对照组椎间盘为Pfirmann Ⅰ级.(2)组织学:造模组椎间盘造模后4周未见改变,8周时HE染色示髓核内细胞数减少,12周时较为明显.Masson染色4周未见改变,8周时各层纤维间出现裂隙,12周时裂隙增宽.番红O染色见8、12周髓核内蛋白聚糖进行性减少.免疫组织化学结果显示4周和8周时同正常椎间盘比较差异无统计学意义(P＞0.05),12周时,Ⅱ型胶原合成减少(P＜0.05).15G穿刺对照组在8周时HE染色见髓核内细胞减少明显,Masson染色见纤维环各层间裂隙明显,呈波浪状.番红O染色示髓核内蛋白聚糖数量明显减少.免疫组织化学染色示Ⅱ型胶原合成减少.正常对照组在各时间点未见到形态学改变.结论 20G穿刺针可以诱发椎间盘缓慢进展的轻度退变.MRI平均信号强度观察椎间盘轻度退变时,不是敏感的指标,需要依靠组织学证实.     

大鼠尾椎间盘退变造模器械的研发与应用

目的:研制一种简便、微创、针刺深度可控的大鼠椎间盘退变模型的造模器械。方法 :自行设计一种新型针刺大鼠尾椎间盘退变的造模器械,由C型套环和针筒两部分构成。取3月龄雄性SD大鼠20只,分为针刺组(10只)和对照组(10只),将造模器械的C型套环套在鼠尾上,用21G针对针刺组的大鼠尾椎Co6/7、Co8/9椎间盘分别行横贯(10mm)和半横贯穿刺(5mm);对照组大鼠尾椎无任何处理。造模前和造模后4周时对两组大鼠的尾部行X线片和MRI检查,在X线片上测量椎间盘高度,计算目标椎间盘高度指数(DHI)比;在MRI T2像上采用Pfirrmann评分评价目标椎间盘退变情况。再处死大鼠取目标椎间盘固定切片后行番红O染色,观察椎间盘退变情况;对非针刺节段尾椎间盘内注射造影剂(碘海醇)后,X线下显影并用针抽吸髓核组织。结果:造模过程中大鼠无死亡,术后无感染等并发症。向大鼠椎间盘注射碘海醇后造影显影良好,可以抽取一定量的髓核组织。造模后4周,针刺组Co6/7和Co8/9的DHI比分别为0.65±0.07和0.73±0.09、Pfirrmann退变评分分别为4.3±0.82和3.5±0.71分,对照组分别为0.98±0.02和0.97±0.02、1.1±0.32分和1.1±0.32分,两组同节段比较均有显著性差异(P0.05),针刺组两个节段间比较有显著性差异(P0.05),对照组两个节段间比较无显著性差异(P0.05)。番红O染色针刺组Co6/7髓核消失,与纤维环界限不清,终板骨化;针刺组Co8/9穿刺侧髓核和纤维结构紊乱,另一侧髓核与纤维环较完整;对照组Co6/7和Co8/9髓核、纤维环和终板形状完整,结构清晰。结论:造模器械穿刺可以成功建立大鼠尾椎间盘退变模型,且横贯穿刺较半横贯穿刺椎间盘退变重;利用该造模器械可以向椎间盘内注射造影剂或药物,抽取髓核。     

经皮穿刺纤维环建立兔腰椎间盘退变模型

目的探讨使用自制穿刺针经皮穿刺纤维环制备兔腰椎间盘退变模型的可行性。方法将18只新西兰大白兔分为实验组、假手术组及空白对照组。实验组及假手术组使用自制穿刺针穿刺L_(3~4)、L_(4~5)和L_(5~6)椎间盘位置,实验组穿刺椎间盘深度为5 mm,假手术组钝性穿刺但不损伤椎间盘,空白对照组不作处理。术后3、6、9周每组取2只兔麻醉后行腰椎MRI检查,处死行大体观察并取椎间盘行HE染色及髓核蛋白多糖含量测定。结果术后3周开始实验组MRI信号强度、髓核蛋白多糖含量与其他两组相比明显下降(P0.05),其后呈逐渐下降趋势,大体观察及HE染色显示实验组髓核及纤维环呈逐渐退变趋势。结论自制穿刺针经皮穿刺纤维环法能成功建立兔腰椎间盘退变模型,具有操作简单、损伤小、动物存活率高等优点。     

骨髓间充质干细胞-壳聚糖凝胶复合体移植治疗椎间盘退变

目的 观察兔骨髓间充质干细胞.壳聚糖凝胶复合体移植修复椎间盘髓核缺损退变的效果.方法 建立兔椎间盘髓核缺损退变模型,将兔骨髓间充质干细胞-壳聚糖凝胶复合体注射移植入缺损退变模型中,兔继续培养4周后处死,取出移植修复的椎间盘进行组织HE染色、Aggre-can番红O染色及Ⅱ-collagen免疫组织化学染色,与正常椎间盘及未行移植的缺损退变椎间盘进行随机对照,检测移植修复的效果.结果 骨髓间充质干细胞-壳聚糖凝胶复合体可以在缺损的椎间盘中正常生长,并呈现向类髓核细胞分化的趋势,合成分泌Ⅱ-collagen和Aggrecan,维持原椎间盘髓核组织的生物学特性,而缺损退变组髓核组织纤维化、完整性丧失,水分丢失,Ⅱ-collagen合成明显减少(P<0.05).结论 兔骨髓间充质干细胞-壳聚糖凝胶复合体能够修复椎间盘缺损退变.     

阻断双侧终板营养途径构建山羊椎间盘退变模型

目的通过建立山羊腰椎双侧终板营养途径阻断的动物模型,观察椎间盘退变(IDD)的情况,研究椎间盘营养途径与IDD的相关性。方法选取8只24月龄雌性关中山羊,每只山羊L2~3、L3~4作为实验椎间盘,麻醉后在平行于终板2 mm的椎体骨质处造成骨缺损,并使用骨水泥填塞,阻断椎体和终板之间的营养通路,L1~2、L4~5作为对照椎间盘。分别于术后4、12、24、48周行X线、MRI检查,各时间点随机处死2只山羊,采集椎间盘标本,计算骨水泥有效阻断面积、椎间高度指数(DHI)和Pfirrmann分级,并行HE、Masson三色、蛋白多糖、番红O染色组织学检查。结果术后骨水泥有效阻断面积达49.6%~69.6%(60.7%±5.3%)。术后48周时实验椎间盘DHI百分比为60.5%~81.7%(72.7%±5.6%),椎间高度丢失较对照差异有统计学意义(P<0.01);术后48周时实验椎间盘Pfirrmann分级为3~5(4.0±0.7)分,较对照差异有统计学意义(P<0.01)。组织学检查证实,实验椎间盘术后12周即发生退变,并随时间(24、48周)逐步加重。结论骨水泥填塞阻断双侧终板营养途径可以构建山羊IDD的动物模型,阻断终板营养途径可以导致IDD发生。     

BMSCs-壳聚糖凝胶复合体移植治疗椎间盘退变的实验研究

目的 探讨兔BMSCs-壳聚糖凝胶复合体移植治疗椎间盘髓核缺损退变的效果,为临床应用提供实验依据. 方法 6只健康1月龄新西兰白兔,雌雄不限,体重1.0～1.5 kg.取骨髓2 mL,分离培养BMSCs.取第3代BMSCs,5-BrdU活细胞示踪剂标记,与壳聚糖凝胶混匀,制备BMSCs-壳聚糖凝胶复合体.将6只动物建立兔椎间盘髓核缺损退变模型,并随机分为3组(n=2):正常对照组仅分离暴露椎间盘,不作任何处理;移植治疗组将30 μL自体BMSCs-壳聚糖凝胶复合体注射入缺损椎间盘中心;缺损退变组仅注射入0.01 mol/L PBS液30 μL.移植后4周处死动物,取出移植修复的椎间盘,行细胞5-BrdU标记检测、HE、aggrecan番红.染色及Col Ⅱ免疫组织化学染色;Col Ⅱ免疫组织化学染色切片行灰度值测定. 结果 细胞标记检测发现,自体BMSCs移植后继续存活并增殖,形成细胞克隆.正常对照组及移植组椎间盘HE染色示椎间盘结构清晰,髓核组织及外周纤维环分界清晰,细胞核及细胞浆染色明显;缺损退变组示椎间盘结构紊乱,髓核组织和外周纤维化分界不清.aggrecan番红O染色示正常对照组及移植治疗组椎间盘染色明显,椎间盘结构清晰;缺损退变组椎间盘结构紊乱,髓核组织和外周纤维化分界不清.Col Ⅱ免疫组织化学染色示正常对照组以中央髓核组织染色为主,呈黄褐色阳性反应,椎间盘结构清晰;移植治疗组中央髓核组织呈阳性反应,细胞间质可见明显黄褐色,大体结构仍保持完整;缺损退变组染色较前两组浅,且结构不清.3组Col Ⅱ免疫组织化学染色切片行灰度值测定,正常对照组为223.84±3.93,与移植治疗组(221.03±3.53)比较差异无统计学意义(P>0.05),但两组与缺损退变组(172.50±3.13)比较,差异均有统计学意义(P<0.05). 结论 兔BMSCs-壳聚糖凝胶复合体可修复椎间盘缺损退变,为临床应用可注射式组织工程髓核移植治疗椎间盘退变奠定实验基础.     

腰椎间盘髓核退变的MRI表现与病理学的相关性研究

目的探讨腰椎间盘髓核退变的MRI表现与病理学之间的相关性,为临床应用MRI相对信号强度评价腰椎间盘髓核退变提供病理学依据。方法病例组标本取自腰椎间盘疾患手术患者,共91例101个椎间盘;对照组标本取自既往无明显腰痛史的年轻腰椎骨折患者和新鲜脑死亡患者,共6例16个椎间盘。所有标本均于术前测量MRI相对信号强度,并予以HE染色、Alcianblue临界电解质浓度(CEC)染色和水分含量测定,分析MRI相对信号强度与硫酸软骨素指数、MRI相对信号强度与水分含量、硫酸软骨素指数与水分含量之间的相关性。结果两组间的MRI相对信号强度、硫酸软骨素指数和水分含量差异均有显著性,而硫酸角质素指数差异无显著性。MRI相对信号强度与硫酸软骨素指数、MRI相对信号强度与水分含量、硫酸软骨素指数与水分含量均有明显相关性,其r值分别为0.659、0.752和0.592,P值均<0.001。根据髓核的水分含量和病理学改变,可将髓核退变大致分为四个阶段,每个阶段的MRI相对信号强度依次为:>0.82,0.73~0.82,0.64~0.72,<0.64。结论MRI相对信号强度不仅能反映髓核的水分含量,而且还能反映髓核退变过程中的病理特征。MRI相对信号强度四级定量分级法是一种评价髓核退变较好的方法。     

腺相关病毒介导的骨形态发生蛋白-2体内转染兔退变椎间盘的实验研究

目的 观察腺相关病毒介导的骨形态发生蛋白-2(AAV-BMP-2)基因对兔退变腰椎间盘的治疗作用.方法 将36只新西兰大白兔L2-3、L3-4、L4-5、L5-6椎间盘针刺制造退变模型后随机分为3组,其中12只注射AAV-BMP-2作为实验组,12只注射AAV作为实验对照组,12只注射生理盐水作为空白对照组.注射后的2、4、8周各组随机抽取4只兔行腰椎MRI扫描,扫描后将其处死,取L2-3、L3-4、L4-5、L5-6椎问盘髓核组织,用间苯三酚分光光度法检测髓核组织中的蛋白多糖含量.结果 在MRI影像学Thompson分级评估中,实验组各时间点椎间盘MRI信号比较,差异无统计学意义.实验对照组和空白对照组各时间点MRI信号比较,差异有统计学意义.实验组和实验对照组、实验组和空白对照组各时间点MRI髓核信号比较,差异有统计学意义;实验对照组和空白对照组比较,差异无统计学意义.在蛋白多糖含量测定中,实验组蛋白多糖含量在各时间点均高于实验对照组和空白对照组,实验对照组和空白对照组蛋白多糖均随时间的变化逐渐减少,各时间点两组比较无明显区别.结论 AAV-BMP-2对兔退变的腰椎间盘有治疗作用.     

退变腰椎间盘髓核组织中NDRG2表达的变化及其意义

[目的]研究退变的腰椎间盘髓核组织中NDRG2表达的变化及其在椎间盘退变中的作用。[方法]收集腰椎间盘标本47例,根据Pfirrmann分级分为Ⅰ~Ⅴ级。采用免疫组织化学染色、实时-定量PCR(RT-PCR)和Western-Blotting技术从细胞、蛋白和基因水平分别检测腰椎间盘髓核组织中NDRG2的表达,并与Pfirrmann分级进行相关性分析;通过RT-PCR分析P53 mRNA的表达;采用衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)实验检测腰椎间盘髓核组织中衰老髓核细胞比例,并与NDRG2表达量进行相关性分析。[结果]免疫组织化学染色、RT-PCR及Western-Blotting检测示NDRG2表达随椎间盘退变程度加重而增加,且与Pfirrmann分级呈正相关;P53 mRNA在腰椎间盘髓核组织中的相对表达随着椎间盘退变程度加重而增加,且与NDRG2的表达量呈正相关。SA-β-gal阳性细胞比例在椎间盘髓核组织中随退变程度加重而增加,并且与NDRG2阳性细胞比例呈正相关。[结论]NDRG2参与了腰椎间盘退变的病理过程,并且可能通过介导腰椎间盘髓核细胞衰老对椎间盘退变起促进作用。     

自体富血小板血浆干预兔早期椎间盘退变的初步研究

目的富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)具有刺激椎间盘细胞增殖、促进细胞外基质合成代谢及抑制纤维环细胞凋亡等作用。通过观察自体PRP干预兔早期椎间盘退变,明确其治疗效果,为临床应用提供理论依据。方法取健康成年新西兰大白兔45只,体重2.5～3.0 kg,雌雄不限;随机分为实验组、对照组、假手术组(n=15)。取实验组兔耳中央动脉血,采用Landesberg等方法制备PRP,同时对全血及PRP行血小板计数。实验组及对照组采用纤维环针刺法建立L4、5及L5、6椎间盘退变模型,造模2周后于L4、5及L5、6椎间隙分别注入100μL自体PRP及100μL PBS液;假手术组仅分离暴露椎间盘,不作处理。观察实验动物造模后一般情况;造模2周及干预1、2周时各组取5只实验动物行腰椎MRI、HE染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,腰椎MRI退变程度分级及Ⅱ型胶原阳性积分吸光度(IA)值检测。结果兔PRP中血小板计数约为外周血的4.92倍。实验动物均存活至实验完成。造模2周时,与假手术组相比,实验组和对照组椎间盘信号降低,髓核细胞减少,基质退变,Ⅱ型胶原表达降低。腰椎MRI退变程度分级及Ⅱ型胶原阳性IA值结果显示,各时间点实验组、对照组与假手术组相比差异均有统计学意义(P<0.05),干预1、2周时,实验组MRI退变程度分级显著低于对照组(P<0.05),但仍与假手术组有差异(P<0.05);干预1、2周时,实验组髓核细胞及软骨样基质较对照组增多,基质纤维化程度轻,Ⅱ型胶原表达明显强于对照组(P<0.05)。结论椎间盘内注射自体PRP可终止甚至一定程度逆转兔早期椎间盘退变,可能与PRP含有多种生长因子调控细胞功能、改善组织微环境、促进组织再生修复有关。     

1-磷酸鞘氨醇受体在不同退变程度髓核组织中的表达变化

目的 :比较不同退变程度人椎间盘髓核组织中3种1-磷酸鞘氨醇受体(S1PR1/2/3)表达水平的差异,探讨椎间盘中S1PR表达水平与椎间盘退变的关系。方法:收集腰椎间盘退行性病变患者手术切除的椎间盘组织,其中轻度退变(Pfirrmann分级Ⅳ级)22例,严重退变(Pfirrmann分级Ⅴ级)14例;同时取6例无椎间盘退变患者(单纯腰椎椎体骨折,Pfirrmann分级Ⅱ级)手术切除的椎间盘组织作为对照组;通过HE染色以及Saf-O染色观察不同退变程度椎间盘的组织学变化,免疫组化检测不同退变程度组织中的S1PR表达水平;Ⅱ型胶原酶消化分离提取原代髓核细胞,通过Real-time PCR、Western-bolt检测不同退变程度椎间盘髓核细胞中S1PR的表达水平,并通过细胞免疫化学方法对S1PR进行定位。结果:HE染色及Saf-O染色结果显示退变椎间盘的纤维环出现破损,髓核细胞形成明显的集落,细胞外基质减少。免疫组化结果显示正常和轻度退变的髓核组织中3种受体(S1PR1/2/3)都有表达,严重退变的组织中表达极弱;Real-time PCR结果显示对照组髓核细胞中S1PR1/2/3的m RNA表达水平分别是严重退变组的5.34±0.52倍、7.25±0.04倍、1.92±0.06倍,轻度退变组S1PR1/2/3的m RNA表达水平分别是严重退变组的4.35±2.45倍、4.96±3.44倍、2.19±0.82倍;Western-blot发现对照组和轻度退变组髓核细胞中S1PR1/2/3均有表达,严重退变组表达水平较低;免疫细胞化学显示S1PR主要集中在髓核细胞的细胞质和细胞膜上。结论:髓核组织中主要表达S1PR1/2/3,在严重退变的髓核组织和细胞中其表达水平明显下降,S1P及其受体可能参与椎间盘髓核组织的退变过程。     

纤维环穿刺抽吸法和纤维环切开法建立兔椎间盘退变模型的比较

[目的]通过纤维环穿刺抽吸法和纤维环切开法建立兔椎间盘退变模型,分析此两种方法的可行性及特点.[方法]取10个月龄健康日本大耳白兔24只,随机分为2组,其中A组为纤维环穿刺抽吸组,利用18G穿刺针分别在兔L3、4、L4、5、L5、6椎间盘刺入并抽吸髓核8～ 12 mg;B组为纤维环切开组,利用手术刀分别在兔L3、4、L4、5、L5、6椎间盘纤维环上做水平位切口;造模完毕,两组兔分别于术后4、8、12、16周进行MRI检查,病理组织学观察和免疫组化染色观察.[结果]A、B两组退变椎间盘MRI T2加权像信号随时间延长呈现持续减弱趋势,术后4、8周纤维环穿刺组T2加权像信号强度评分较纤维环切开组低(P＜0.05),组织学观察发现造模组髓核细胞逐渐减少;免疫组化染色观察Ⅱ型胶原和蛋白聚糖表达含量随时间延长逐渐降低,且B组含量明显低于A组.[结论]两种方法均能建立兔椎间盘退变模型,但纤维环切开法椎间盘的退变程度较纤维环穿刺法出现较早且较为剧烈.     

CT引导下经皮纤维环穿刺建立兔腰椎间盘退变模型

【摘要】 目的：在CT引导下经皮纤维环穿刺建立兔腰椎间盘退变模型,并通过影像学和病理学验证其退变过程及效果。方法：3月龄新西兰大白兔18只,体重2.7~3.3kg,雌雄不限,术前均行X线及MRI检查。每只兔在螺旋CT引导下,用18G穿刺针经侧方皮下穿刺兔L5/6椎间盘（穿刺组）,确认刺入椎间盘纤维环深度约为5mm,并对L4/5椎间盘进行假性穿刺（穿刺达椎间盘边缘,但不刺入纤维环内;假穿刺组）,L3/4椎间盘作为对照椎间盘（对照组）。术后4周、8周、12周随机选取6只兔行X线片及MRI检查,观察各组椎间隙高度、邻近骨质改变及椎间盘信号改变,以“术后椎间隙高度/术前椎间隙高度×100”计算椎间盘高度相对值(DHRV),并进行椎间盘改良Thompson分级法分级;X线片及MRI检查结束24h内处死动物,选取对照、假穿刺和穿刺组椎间盘进行组织形态学及免疫组织化学分析。结果：对照组及假穿刺组术后4、8、12周,X线片示椎间隙高度无降低,无终板骨质硬化与骨赘形成;MRI T2加权成像图像示各椎间盘均呈高信号;组织学检查见髓核细胞数量较多,分布均匀,纤维环排列呈同心圆层状;免疫组化分析髓核呈Ⅰ型胶原染色强阳性,Ⅱ型胶原染色阴性,在各时间点表现无明显差别。穿刺组椎间盘在术后4周X线片即可见椎间隙高度轻度降低（DHRV=70.78±4.55）,MRI示椎间盘信号强度轻度下降,组织学上见纤维环结构紊乱、髓核细胞轻度减少;术后8周椎间隙高度明显降低（DHRV=50.63±4.04）,开始出现终板骨质硬化,MRI示椎间盘信号强度明显下降,组织学上髓核被胶原组织分裂为含较多椭圆形细胞的细胞岛,出现纤维软骨细胞,纤维环层状结构变形、部分断裂;术后12周椎间隙高度继续下降（DHRV=44.78±2.61）,骨赘形成、终板骨质硬化明显,MRI示椎间盘信号强度继续减弱,组织学上见髓核被纤维软骨组织所代替,纤维环层状组织碎裂、解体;免疫组织化学分析示术后4、8、12周髓核Ⅰ型胶原染色逐渐增强,Ⅱ型胶原染色逐渐减弱。各时间点对照组椎间盘的DHRV及改良Thompson分级与假穿刺组比较均无统计学差异（P＞0.05）;穿刺组在术后不同时间点的DHRV降低、改良Thompson分级增高与对照组及假穿刺组比较均有统计学差异（P<0.05）;随着穿刺时间的延长,穿刺组DHRV呈进行性降低趋势,改良Thompson分级进行性升高,两者在术后4、8、12周间均有统计学差异（P<0.05）。结论：CT引导下经皮纤维环穿刺法诱导兔椎间盘退变模型构建成功,操作方法简单、创伤小,经影像学及病理学证实其退变过程为渐进性。     

应用纤连蛋白片段建立椎间盘退变动物模型

目的:探讨应用N端30kDa纤连蛋白片段(Fn-f)建立模拟人类椎间盘退变规律的椎间盘退变动物模型的可行性,为椎间盘退变的防治提供实验模型及实验依据.方法:选取雄性6月龄新西兰大白兔28只,麻醉后使用30G微量注射针和微量注射器,在透视引导下经皮将25μl 1.5μmol/L Fn-f(Fn-f组)或25μl磷酸缓冲液(PBS,0.01mol/L,pH值7.2;PBS组)随机分别注射入不同节段的腰椎间盘中心区.分别于注射4、8、12、16周后获取椎间盘,对椎间盘进行组织学检测(HE、Masson三色及番红O染色),并以RT-PCR法对椎间盘聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的基因表达水平进行分析.结果:与注射PBS椎间盘相比,注射Fn-f椎间盘造模后4周时椎间盘的髓核、纤维环结构以及胞外基质蛋白聚糖等无明显差别;8周时髓核细胞数量减少、细胞簇状分布,被胞外基质分隔开来,纤维环层状结构排列部分出现紊乱,蛋白聚糖染色变浅;12和16周时髓核细胞数量明显减少,细胞变圆,呈明显的成簇聚集分布,纤维环排列明显不规整,各层间出现裂隙,甚至断裂,蛋白聚糖染色明显变浅,甚至部分未见染色.Fn-f组椎间盘聚集蛋白聚糖mRNA表达水平在8、12和16周3个时间点均明显低于PBS组(P＜0.05);Ⅱ型胶原mRNA表达水平在12和16周时明显低于PBS对照组(P＜0.05).结论:透视引导下兔椎间盘内注射N端30kDa Fn-f可诱导椎间盘产生渐进性退行性病变,该法建立的动物模型可作为研究椎间盘退变的发病机制及防治的实验模板.     

淫羊藿苷对大鼠椎间盘退变的影响

[目的]研究淫羊藿苷(ICA)对大鼠尾椎椎间盘退变(IDD)的影响。[方法]体内实验部分,SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、空白对照组(IDD组)和3个淫羊藿苷处理组(ICAL、ICAM、ICAH)。制备椎间盘退变模型,给予相应处理,并行MIR和细胞因子检测。体内实验部分,自假手术与IDD动物椎间盘髓核分离细胞,体外培养,并给予淫羊藿苷处理(ICAL、ICAM、ICAH),检测细胞和上清的细胞因子等。[结果]体内实验表明,术后2周,与IDD组比较,ICAM组椎间盘T2加权信号强度高;术后6周,IDD组信号消失,ICAM组则无明显改变;ICAM组MRI的Pfirrmann评级均明显低于IDD组(P<0.05)。与Sham组比较,IDD组的IL-1β、IL-6蛋白表达显著增高(P<0.05);与IDD组比较,ICA组的IL-1β、IL-6蛋白表达显著降低(P<0.05)。体外实验显示:IDD组NP细胞增殖率明显降低(P<0.05);而ICA组的NP细胞增殖率明显升高(P<0.05)。与Sham组相比,IDD组NP细胞IL-1β、IL-6表达显著上调(P<0.05);与IDD组比较,ICA各组NP细胞IL-1β、IL-6表达显著下调(P<0.05)。与正常对照组相比,IDD组NP细胞Aggrecan和CollagenⅡmRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与IDD组相比,ICA各组Aggrecan和CollagenⅡmRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。[结论]淫羊藿苷可促进退变髓核细胞增殖、蛋白聚糖及II型胶原蛋白合成,减少IL-1β及IL-6表达,延缓椎间盘退变。     

外源性肿瘤坏死因子-α诱发兔椎间盘退变中β-catenin蛋白的表达及意义

目的 通过外源性肿瘤坏死因子(TNF)-α注射构建兔椎间盘退变动物模型,探讨该模型中β-catenin蛋白的表达及意义和炎性细胞因子在促进腰椎间盘退变过程中Wnt/β-catenin信号通路的作用.方法 选取12只健康成年日本白兔,雌雄随机,体质量2.5～3.0kg.手术暴露L2～5 3个间隙共36个椎间盘.随机分为4组,分别注入生理盐水、TNF-α 5 ng、TNF-α 10ng、TNF-α 20 ng,于术后第8周统一处死,取椎间盘髓核组织作苏木素-伊红(HE)-番红O染色病理切片进行形态学观察;各组分别随机选取4个椎间盘髓核组织标本,采用蛋白印迹法(Western blot)测定β-catenin蛋白含量并比较各组间差异.结果 HE-番红O染色病理切片显示,在5、10、20 ng组椎间盘组织中髓核细胞数量减少,正常网状结构破坏,细胞形态发生改变,出现肥大空泡样软骨细胞,组织基质蛋白聚糖含量明显降低,番红O淡染,生理盐水对照组椎间盘形态基本正常,无退变发生.蛋白印迹结果显示β-catenin蛋白含量在注射TNF-α组明显增加,各组吸光度比值分别为:0.142±0.036、0.351±0.041、0.472±0.052和0.710±0.063,组间差异有统计学意义(P＜0.05)且与TNF-α浓度相关.结论 通过外源性TNF-α盘内注射能够成功构建兔椎间盘退变动物模型,且退变程度与TNF-α呈浓度依赖性;在退变模型髓核组织中β-catenin蛋白含量增高且与TNF-α浓度正相关,提示炎症细胞因子触发了Wnt/β-catenin信号通路,在椎间盘退变过程中可能发挥了重要作用.     

三种方法建立兔椎间盘退变模型的比较研究

目的选择可靠的椎间盘退变动物模型,能为研究椎间盘退变性疾病的发病机制和治疗提供重要的实验载体。通过3种不同损伤方式诱导建立兔椎间盘退变模型,并采用生物化学和影像学方法比较其退变过程及特点。方法取健康6月龄新西兰大白兔25只,体重2.0～2.5kg,随机分为5组,每组5只,每只均选取L3、4、L4、5、L5、6共3个节段椎间盘进行实验。其中A、B组为纤维环穿刺组,分别采用18G和22G针头穿刺;C组为髓核抽吸组;D组为终板破坏组;E组为假手术对照组。分别于术后2、4、8、16和32周每组各取1只动物行CR和MRI检查,测量椎间盘相对高度,评估并记录各椎间盘退变分级的分值;然后处死实验动物获取椎间盘髓核组织,测定其中的水含量和硫酸化糖胺多糖(sulfated-glycosaminoglycan,s-GAG)含量。结果影像学检查显示除E组外,A～D组手术节段的椎间隙随时间延长逐渐狭窄,上下软骨终板出现不同程度钙化,椎体前缘骨赘形成,椎间盘髓核信号强度呈现逐渐降低趋势。与E组相比,A～D组椎间隙相对高度和椎间盘分级分值分别在4周内不同时间点开始差异有统计学意义(P0.05);C、D组出现明显变化时间早于A、B组。A～D组髓核组织的水含量和s-GAG含量随时间延长也呈逐渐下降的变化趋势;与E组相比,A～D组两者含量分别在8周内不同时间点开始差异有统计学意义(P0.05);C、D组出现明显下降趋势的时间早于A、B组。结论3种手术损伤方式均成功建立了兔椎间盘退变模型。终板破坏法和髓核抽吸法较纤维环穿刺法所诱发的退变过程出现更早,进展较快且退变程度更重。     

纤维环穿刺法建立兔椎间盘退变模型

[目的]通过纤维环穿刺法建立兔椎间盘退变模型,分析其特点.[方法]将16只新西兰大白兔随机分为2组.经腹膜外入路暴露X2、3、L3、4椎间隙.A组为纤维环穿刺组,采用16号针头穿刺,B组为假手术对照组.术后2,4,6,8周通过MRI和组织病理学检查观察髓核变性及组织病理情况.[结果)纤维环穿刺组髓核信号强度在术后呈现逐渐降低趋势,髓核面积逐渐缩小,椎间隙高度也逐步下降,从术后4周开始两组差异有统计学意义(p＜0.O5 ).随着时间的进展,纤维环穿刺组髓核内细胞含量逐渐减少.[结论]纤维环穿刺法可成功建立椎间盘退变模型,比较真实地模拟了人类椎间盘损伤后的退变过程.     

直立体位下无创轴向加载建立兔椎间盘退变动物模型

目的:通过直立体位下无创性轴向加载的方式,建立一种新型兔腰椎间盘早期退变的动物模型。方法:24只4月龄雄性新西兰大白兔随机分为实验组及对照组。将实验组动物置于特制筒内使之保持直立体位,并自颈部施以600g轴向载荷,每日6h;对照组动物不接受任何处理而常规饲养。在实验开始前及实验开始后4周、8周、12周时对全部动物行X线及MRI检查,观察实验组动物在筒内时腰椎的骨性结构,通过椎间盘高度指数(disc height index,DHI)测量,比较两组动物侧卧位时L2/3、L4/5和L6/7节段椎间隙高度改变;通过髓核相对灰度值测量比较两组动物髓核含水量变化。14周后全部动物处死,取L5/6节段胶冻状髓核组织,应用rtPCR检测Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原及蛋白多糖表达水平;取L6/7节段椎间盘连同上、下各1mm软骨下骨,应用HE及天狼星红染色观察各组动物椎间盘组织结构改变。结果:2只实验组动物在实验过程中死亡,其对应的实验数据从结果中剔除。腰椎X线片显示,在直立体位负重条件下,实验组兔腰椎形成明显后凸,较侧卧位下腰椎间隙明显变窄,在L2/3节段,直立体位下椎间隙高度为侧卧位时的75.1%(P0.05);在L4/5节段为54.8%(P0.05);在L6/7节段为47.9%(P0.05)。DHI测量显示两组动物腰椎各节段DHI在任何时间点均无显著差异(P0.05)。MRI结果显示,在L2/3节段,实验组与对照组髓核灰度值在任何时间点均无统计学差异(P0.05),在L4/5节段,实验组与对照组髓核相对灰度值在12周时开始具有显著差异(P0.05);在L6/7节段,两组间在8周时即开始有显著性差异(P0.05)。rt-PCR结果显示,实验组Ⅰ型胶原m RNA表达明显高于对照组(3.57倍,P0.05);而Ⅱ型胶原及蛋白多糖表达明显低于对照组(分别为0.35倍和0.43倍,P0.05)。病理学检查显示对照组与实验组椎间盘组织结构存在显著差异,对照组髓核组织与纤维环间边界清晰,髓核内富含均匀分布的髓核细胞;实验组内层纤维环明显增生,而髓核区域相应减小。结论:直立体位下无创性轴向加载方式可显著加速兔腰椎间盘的退变进程,其在发病机理上与人类椎间盘退变更加相似,该腰椎间盘退变动物模型操作简单、可重复性强。