低氧对成骨生长肽诱导的小鼠间充质干细胞成骨分化的影响

目的探讨低氧对成骨生长肽(osteogenic growth peptide,OGP)诱导的小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖与成骨分化的影响。方法将第三代小鼠BMSCs随机分为四组:对照组(A组,常氧条件下培养);1%O2组(B组,1%O2条件下培养);OGP组(C组,常氧条件下添加OGP培养)、1%O2联合OGP组(D组,1%O2条件下添加OGP)。分别于培养后1天、2天、3天、4天收集细胞,噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)比色法观察BMSCs增殖能力;培养7、14天后收集细胞,可见光比色法检测细胞碱性磷酸酶活性(alkaline phosphatase,ALP);培养1天后收集细胞,ELISA法检测低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor,HIF-1α)表达,培养3、7天后收集细胞,实时荧光定量PCR检测RUNX2、Osterix表达。结果 MTT结果显示,与C组相比,在培养第2、3、4天D组能明显促进BMSCs增殖(P0.05)。与C组相比,在培养第7、14天D组能明显上调ALP表达(P0.05)。与C组相比,在培养第3、7天D组能明显上调RUNX2、Osterix信使RNA表达(P0.05)。在培养后1天,A组及C组未能检测到HIF-1α蛋白,B组与D组HIF-1α表达明显增加(P0.001)。结论低氧明显增强了OGP促进BMSCs增殖及成骨分化的作用。     

环指蛋白11调控Akt信号通路促进BMSCs成骨分化的机制研究北大核心CSCD

目的研究BMSCs成骨分化过程中环指蛋白11(ring finger protein 11,RNF11)对Akt信号通路的调节作用,为进一步阐明BMSCs成骨分化机制和用于临床治疗提供思路。方法从健康人体新鲜骨髓中分离培养BMSCs并传代,取第4代细胞经流式细胞术,成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定后用于实验。BMSCs成骨诱导分化培养0~14 d,通过茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,并用Western blot法检测RNF11蛋白表达。取第4代BMSCs,分为空白对照组(A组)、空载慢病毒(Lv-NC)组(B组)和敲低RNF11(Lv-ShRNF11)组(C组),成骨诱导分化培养0~14 d,采用Western blot检测RNF11蛋白表达,茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,14 d实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测BMSCs成骨标志物Runx2、骨钙素(osteocalcin,OCN)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的mRNA相对表达量;采用Western blot检测Akt、Smad1/5/8及β-catenin信号通路蛋白相对表达量,以磷酸化前后比值表示。为研究RNF11对Akt信号通路的影响机制,取第4代BMSCs分为Lv-NC转染组(A1组)、Lv-ShRNF11转染组(B1组)和添加Akt信号通路激活剂SC79的Lv-ShRNF11转染组(C1组),14 d时采用Western blot检测RNF11和Akt信号通路蛋白相对表达量,茜素红染色、ALP染色及qRT-PCR检测成骨相关指标。结果流式细胞术及成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定显示分离培养细胞为BMSCs。RNF11蛋白相对表达量随成骨分化时间延长而逐渐增加(P<0.05);下调RNF11后,茜素红和ALP染色示C组相较于A、B组BMSCs成骨分化程度降低,qRT-PCR检测示Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量减少(P<0.05)。随成骨分化时间延长,RNF11与Akt信号通路蛋白相对表达量均上升(P<0.05)。下调RNF11后,C组相较于A、B组,其Akt信号通路蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),而对Smad1/5/8以及β-catenin信号通路蛋白相对表达量无明显影响(P>0.05)。B1、C1组相较于A1组,其RNF11蛋白相对表达量减少(P<0.05),B1组相较于A1、C1组,其Akt信号通路蛋白相对表达量降低(P<0.05);茜素红与ALP染色示C1组BMSCs成骨分化程度稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05);qRT-PCR检测示C1组Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05)。结论RNF11通过正向调控Akt信号通路激活水平促进BMSCs向成骨细胞分化。RNF11可作为提高BMSCs修复骨缺损疗效以及治疗骨代谢病的潜在靶点。     

miR-21对骨质疏松小鼠骨髓基质细胞增殖的影响

目的探讨miR-21对骨质疏松小鼠骨髓基质细胞(BMSCs)增殖的影响。方法采用双侧卵巢切除法构建骨质疏松小鼠模型(VOX),分离、培养、纯化小鼠BMSCs并采用si PORT Neo FX转染pre-miR-21、pre-miR-negative control(pre-miR-NC)、antmiR-21、ant-miR-negative control(ant-miR-NC)并进行RT-PCR验证,MTT法检测小鼠BMSCs增殖情况、茜素红与碱性磷酸酶染色法检测小鼠BMSCs成骨能力、Western-blotting检测细胞增殖、成骨分化相关蛋白水平。结果骨质疏松症小鼠BMSCs中miR-21相对表达水平低于Ctrl组(P0.05),OVX-pre-miR-21组BMSCs中miR-21相对表达水平、细胞增殖、PCNA水平、Ki-67水平、ALP染色程度、ALP活性、茜素红染色程度、Runx2水平、Osterix水平均高于OVX-pre-miR-NC组(P0.05),OVX-premiR-NC组BMSCs中miR-21相对表达水平、细胞增殖、PCNA水平、Ki-67水平、ALP染色程度、ALP活性、茜素红染色程度、Runx2水平、Osterix水平均显著低于Ctrl-pre-miR-NC(P0.05); OVX-ant-miR-21组BMSCs中miR-21相对表达水平、细胞增殖、PCNA水平、Ki-67水平、ALP染色程度、ALP活性、茜素红染色程度、Runx2水平、Osterix水平均显著低于OVX-ant-miR-NC组(P0.05),OVX-ant-miR-NC组BMSCs中miR-21相对表达水平、细胞增殖、PCNA水平、Ki-67水平、ALP染色程度、ALP活性、茜素红染色程度、Runx2水平、Osterix水平均显著低于Ctrl-ant-miR-NC(P0.05)。结论提高miR-21表达水平可促进骨质疏松小鼠BMSCs增殖能力与成骨分化能力。     

骨碎补促进骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化

[目的]研究骨碎补对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖与成骨分化的影响。[方法]40只SD大鼠随机分为4组,包括空白对照组和3个处理组,空白对照组给予生理盐水,而3个处理组分别给予高、中、低浓度骨碎补水煎液连续灌胃3个月。给药期满后,取各组动物骨髓体外培养,全骨髓贴壁法纯化培养BMSCs,第三代BMSCs作为检测细胞。CCK-8法分析不同浓度的骨碎补水煎液对BMSCs增殖的作用。采用ALP试剂盒测定BMSCs成骨诱导后ALP活性,茜素红染色观察钙化结节情况,并测定成骨细胞相关RUNX2和Osterix及OCN mRNA的表达情况,以评估骨碎补对BMSCs成骨分化的影响。[结果]CD90和CD45细胞免疫荧光显色证实所培养细胞为BMSCs。CCK-8法检测显示骨碎补能够促进BMSCs增殖,并呈剂量依赖性,3个处理组与空白对照组间的差异具有统计学意义(P0.05)。在成骨诱导培养基中培养后,3个处理组间培养液上清ALP活性呈剂量依赖性增高,并伴有培养皿茜素红染色观察钙化结节的相应增多,与空白对照组间的差异具有统计学意义(P0.05)。此外,相应的RUNX2和Osterix及OCN的表达也呈骨碎补剂量依赖性增加,3个处理组与空白对照组间的差异具有统计学意义(P0.05)。[结论]骨碎补能够促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化。     

BMP-2联合低氧环境诱导BMSCs向软骨表型分化的研究

目的探讨BMP-2联合低氧环境诱导BMSCs向软骨表型分化的可行性,并进一步研究其生物学机制。方法取4周龄健康清洁级雌性SD大鼠骨髓采用贴壁法体外培养BMSCs,取第2代细胞根据培养条件不同分为4组:常氧对照组(A组)、常氧加BMP-2诱导液组(B组)、低氧(O2浓度3%)对照组(C组)和低氧加BMP-2诱导液组(D组)。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,培养7、14、21 d阿利新蓝染色检测各组软骨基质糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAG)分泌水平,21 d时Western blot检测细胞内Ⅱ型胶原和低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)蛋白表达水平,RT-PCR检测成软骨、成骨以及低氧相关基因表达水平。结果诱导培养21 d,D组细胞变为类圆形,细胞密度降低,细胞周边呈陷窝样,基质包裹细胞;A、B、C组均未见上述典型变化。D组阿利新蓝染色明显较其他组深,并随诱导时间延长蓝染加深,21 d时出现成片深染蓝色,其他组各时间点仅见散在少量的淡染蓝色。Western blot检测D组细胞内Ⅱ型胶原蛋白表达水平较其他组显著增高,C、D组HIF-1α蛋白表达水平较A、B组显著增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测D组成软骨分化相关指标Ⅱ型胶原α1(collagenⅡα1,COL2α1)、聚集蛋白聚糖表达最高,而B组成骨分化相关指标COL1α1、ALP、Runt相关转录因子2表达水平最高,C、D组低氧相关指标HIF-1α较A、B组显著增强,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 BMP-2联合低氧(O2浓度3%)环境可以诱导大鼠BMSCs向软骨分化,并抑制其成骨分化,HIF-1α可能是参与促软骨生成过程中的一个重要信号分子。     

低氧环境下共培养的骨膜细胞和髓核细胞骨向分化能力的研究

[目的]探讨低氧环境对体外共培养的骨膜细胞、髓核细胞骨向分化能力的影响。[方法]采用组织块法分离兔骨膜细胞,胰酶、胶原酶消化法获取髓核细胞,传至3代进行共培养实验,实验分为2组:正常氧组(20%O2)、低氧组(5%O2),共培养后用CCK-8检测细胞增殖情况,用AKP试剂盒、BCA试剂盒检测碱性磷酸酶活性,RT-PCR检测骨钙素、Ⅰ型胶原、RUNX2以及HIF-1a mRNA的表达,免疫组化试剂盒检测Ι型胶原的表达,茜素红染色检测钙盐沉积或钙结节。[结果]骨膜细胞和髓核细胞在体外成功分离和培养,共培养后保持了较高的增殖率,经过成骨诱导培养后成功诱导为成骨细胞,细胞增殖曲线为"S"型,两组在1、3、5、7、9 d的光吸收值(OD)比较差异有统计学意义(P0.05);低氧组的骨钙素、Ⅰ型胶原、RUNX2以及HIF-1a mRNA表达水平高于常氧组(P0.05),碱性磷酸酶(ALP)活性高于常氧组(P0.05),细胞成骨染色(茜素红染色、免疫组化)结果显示低氧组较常氧组表达增多。[结论]低氧条件下体外共培养的骨膜细胞和髓核细胞经成骨诱导后向成骨细胞分化的能力更强。     

不同组织来源间充质干细胞体外成骨分化能力的比较研究

目的比较成人脂肪间充质干细胞(ASCs)、脐带间充质干细胞(UC-MSCs)和成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨能力,选择优势干细胞种类作为应用于骨组织工程治疗骨缺损的种子细胞。方法采用含10%胎牛血清的DMEM/Ham’s F-12培养液培养3种MSCs。取3种MSCs的P3代,通过CCK8方法检测其增殖能力;通过流式细胞仪进行鉴定;通过碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色检测骨分化蛋白ALP的分泌和矿化钙结节的沉积,并对钙结节进行定量分析;通过实时荧光定量PCR(RT-q PCR)方法检测骨再生相关基因的表达。结果 3种P3代MSCs在3~5d之间增殖均处于对数生长期;流式鉴定3种细胞的表面标志物阳性率:CD44、CD90和CD105均高于97%,阴性率:CD14、CD34和CD45均低于1%;ALP染色结果显示3种MSCs成骨诱导9d时,细胞内均表达ALP,茜素红染色结果显示成骨诱导18d时,均呈现较好的矿化能力,BMSCs和UC-MSCs成骨诱导后形成的钙结节无显著性差异;RT-q PCR结果显示3种MSCs成骨诱导组相比较于对照组,成骨再生相关基因Osterix、ALP、I型胶原(COL1)和骨钙素(OCN)均显著性高表达;3种MSCs成骨诱导9d时,UC-MSCs实验组的COLI基因表达显著性高于BMSCs,成骨诱导18d时,ASCs实验组的Osterix基因表达显著性高于BMSCs。结论 ASCs和UC-MSCs具有一定的成骨矿化能力,有望成为骨组织工程治疗骨缺损的种子细胞。     

缺氧状态对骨形态发生蛋白-2诱导分化体外复合富血小板血浆凝胶的骨髓间充质干细胞的影响

目的研究缺氧状态对骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导分化体外复合富血小板血浆(PRP)凝胶的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的影响。方法取第三代培养的BMSCs细胞与PRP凝胶相混合,通过构建细胞缺氧模型,根据培养条件的不同确定实验分组:常氧BMSCs+PRP组(A组)、常氧BMP-2+BMSCs+PRP组(B组)、低氧BMSCs+PRP组(C组)、低氧BMP-2+BMSCs+PRP组(D组)。反转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)及Western-blotting检测各组成软骨及成骨基因的表达。结果 RT-PCR检测表明C组和D组的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖和低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达均较A组和B组明显升高;Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶(ALP)在B组的表达最高;A组与B组runt相关转录因子2(Runx2)的表达较C组和D组明显升高。Western-blotting检测结果表明B组和D组的Ⅱ型胶原表达较A组和C组明显升高;C组与D组的HIF-1α表达较A组与B组显著升高;D组的SOX-9表达较其余3组显著升高。所有结果差异均有统计学意义(P0.05)。结论低氧条件能显著促进BMP-2对BMSCs的成软骨诱导分化,同时抑制BMSCs的成骨分化。HIF-1α可能是这一过程的重要调节因子,其可能通过调节SOX-9的表达来发挥促BMSCs成软骨细胞分化的作用。     

联合转染人VEGF165和ANG-1双基因对大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

[目的]研究联合转染入血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管紧张素-1(ANG-1)双基因对大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化潜能的影响.[方法]将本室构建的编码人VEGF165和ANG-1双基因腺病毒质粒pAd-VIA在QBI-293A细胞内进行包装和扩增,获得腺病毒载体pAd-VIA,将其体外转染大鼠BMSCs,应用诱导培养液定向诱导向成骨细胞分化.实验分为4组:A.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs并诱导组;B.BMSCs诱导组;C.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs组;D.单纯BMSCs组.通过碱性磷酸酶(ALP)染色和活性的测定、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色来评价联合转染双基因对BMSCs成骨分化潜能的影响.[结果]重组腺病毒质粒pAdVIA在QBI-293A细胞内成功包装和扩增,有大量的绿色荧光蛋白表达,体外转染大鼠BMSCs后,A、B组的ALP染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色为阳性,而C组和D组为阴性.ALP活性表达具有时间相关性,3 d开始表达,7 d到达高峰,在7、14 d,A、B组与C、D组之间ALP表达均具有统计学差异(P＜0.01),A组和B组之间,在各个时间点均无统计学差异(P＞0.05).[结论]腺病毒载体pAd-VIA转染大鼠BMSCs后,未明显影响其体外成骨分化潜能.     

脂联素通过调节BMP信号通路促进骨髓干细胞成骨分化

目的 研究脂联素（adiponectin, ApN）对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）成骨分化的作用,并探讨其可能的机制。方法 体外培养BMSCs,构建ApN过表达质粒及干扰质粒,转染至BMSCs中。将BMSCs随机分为5组：对照组、过表达组、过表达空载组、干扰组和干扰空载组。茜素红染色观察各组细胞钙化沉积。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）染色观察各组细胞成骨分化能力。qRT-PCR检测ApN受体、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）信号通路及成骨相关基因表达情况。结果 与对照组相比,过表达组BMSCs中钙化沉积和ALP阳性表达增多,AdipoR1、AdipoR2、BMP2、RUNX2、Smad1和Smad5 mRNA表达量显著升高（P<0.05）;干扰组BMSCs中钙化沉积和ALP阳性表达减少,AdipoR1、AdipoR2、BMP2、RUNX2、Smad1和Smad5 mRNA表达量显著降低（P<0.05）。结论 ApN可能通过上调BMP信号通路促进BMSCs成骨分化。     

腺病毒介导BMP-2联合低氧诱导因子1α突变型与单基因BMP-2分别转染BMSCs后成骨效应的比较研究

目的比较腺病毒载体Ad-BMP-2-内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)-低氧诱导因子1α突变型(hypoxia inducible factor 1αmu,HIF-1αmu)与Ad-巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)-BMP-2-IRES-人源化海肾绿色荧光蛋白1(human renilla reniformis green fluorescent protein 1,hrGFP-1)分别转染BMSCs后的成骨效应,优化成骨细胞种子来源。方法取1月龄新西兰大白兔骨髓分离培养BMSCs。取第3代BMSCs进行病毒液转染,根据转染病毒液不同将实验分为4组,A、B、C组分别采用感染复数(multiplicity of infection,MOI)为50、100、150和200的Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu、Ad-CMV-BMP-2-IRES-hrGFP-1、Ad-CMV-IRES-hrGFP-1(空腺病毒载体)转染细胞,D组为未被转染的BMSCs。选择最佳MOI值进行观察。转染后采用免疫组织化学染色检测BMP-2表达,Western blot检测BMP-2和HIF-1α蛋白表达,ALP活性测定和钙结节茜素红染色检测细胞成骨分化能力。结果 A、B、C组最佳MOI值分别为200、150和100。免疫组织化学染色示,A、B组BMP-2染色呈阳性,C、D组呈阴性;A组阳性细胞数明显多于B组(P<0.05)。Western blot检测示,A、B组BMP-2蛋白表达明显高于C、D组(P<0.05),A组高于B组(P<0.05);A组HIF-1α蛋白表达明显高于其余3组(P<0.05),其余3组间差异无统计学意义(P>0.05)。A、B组ALP活性明显高于C、D组(P<0.05),A组高于B组(P<0.05)。茜素红染色示,A、B组可见明显钙结节,C、D组未见钙结节形成;且A组钙结节数量多于B组(P<0.05)。结论单载体双基因Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu与单载体单基因Ad-CMV-BMP-2-IRES-hrGFP-1分别转染兔BMSCs后,前者BMP-2和成骨效应表达均高于后者。     

BMSCs条件培养基改善地塞米松对成骨细胞成骨功能抑制效应的研究

目的探讨BMSCs的旁分泌作用对地塞米松所致成骨细胞成骨功能抑制作用的影响。方法首先通过培养小鼠BMSCs 24 h制备无血清条件培养基备用。将小鼠MC3T3-E1细胞株复苏并传至第3代用于实验,分为4组:A组为对照组;B组于细胞中添加1μmol/L地塞米松;C组于细胞中按1∶1比例添加1μmol/L地塞米松和BMSCs条件培养基;D组仅添加BMSCs条件培养基。培养24 h后收集细胞测定ALP含量,Western blot测定细胞内RUNX2、骨钙素(Osteocalcin)蛋白表达,实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-q PCR)测定细胞内α1-Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ-α1,COL1A1)、RUNX2、ALP、Osteocalcin基因表达;21 d后行茜素红染色观察钙结节形成情况。结果培养24 h后,B、C、D组ALP含量均显著低于A组,B组低于C、D组(P0.05),C、D组间差异无统计学意义(P0.05)。Western blot检测示,B组RUNX2蛋白相对表达量显著低于A、C、D组(P0.05),A、C、D组间比较差异无统计学意义(P0.05);B组Osteocalcin蛋白相对表达量均显著低于A、C、D组,A、C组低于D组(P0.05),A、C组间差异无统计学意义(P0.05)。RT-q PCR检测示,B、C、D组RUNX2、Osteocalcin、COL1A1、ALP基因相对表达量均显著低于A组(P0.05);D组RUNX2、Osteocalcin、ALP基因相对表达量均显著高于B、C组,C组显著高于B组(P0.05);D组COL1A1基因相对表达量显著高于B组(P0.05),B、C组间及C、D组间比较差异均无统计学意义(P0.05)。培养6 d时A组细胞死亡;21 d时B、C、D组均可见钙结节阳性染色,且逐渐增强。结论小鼠BMSCs条件培养基能改善地塞米松对成骨细胞成骨功能的抑制效应。     

钽涂层对骨髓间充质干细胞的黏附增殖及成骨分化的影响

目的探讨钽涂层金属在体外促进大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)黏附、增殖及成骨分化方面的作用。方法在体外取6只6周龄SD大鼠BMSCs进行原代培养至第3代,使用化学气相沉积系统自行制备钽涂层金属。然后进行流式细胞术鉴定、BMSCs三向诱导、荧光染色、细胞增殖检测及实时荧光定量聚合酶链反应技术(Q-PCR)试验。观察比较BMSCs在钛合金圆片(Ti6Al4V组)和钽金属圆片(Ta组)表面黏附的BMSCs数量、增殖速率、成骨细胞特异性转录因子(OSX)、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨粘连蛋白(OSN)和骨桥蛋白(OPN)的表达情况。结果流式细胞术结果显示CD44(94.55%)、CD90(95.01%)、CD34(0.06%)。诱导成骨分化14 d后碱性磷酸酶(ALP)染色阳性;诱导成骨分化21 d后出现茜素红钙化结节;成脂诱导21 d后油红O染色呈阳性;成软骨诱导21 d后阿利新蓝染色评估有软骨形成能力。激光共聚焦显微镜结果显示BMSCs在Ti6Al4V组和Ta组金属圆片表面贴附生长,细胞间互相接触、聚集成片,Ta组金属圆片上黏附的BMSCs数量明显多于Ti6Al4V组,并且具有更好的延展性能。细胞增殖检测结果发现,分别共培养1、3、5、7 d后Ta组BMSCs的增殖速率明显快于Ti6Al4V组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Q-PCR结果发现,与Ti6Al4V组相比,体外培养7 d后Ta组金属圆片更能促进OSN和OPN的表达,差异有统计学意义(P<0.05);体外共培养21 d后,Ta组金属圆片更能促进OSX、RUNX2、OSN和OPN的表达,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论相比于传统的骨科植入物钛合金而言,钽涂层金属能够更好地促进BMSCs的黏附,增殖和成骨分化。     

双基因pCDNA 3.1-NGF-IRES-BMP2真核质粒转染大鼠BMSCs诱导成骨的研究

[目的]研究双基因NGF与BMP2转染大鼠BMSCs并诱导BMSCs成骨分化后表达情况。[方法]将第三代大鼠BMSCs,分为五组,单基因pCDNA3.1-NGF转染组(A组),单基因pCDNA3.1-BMP2转染组(B组),双基因pCDNA3.1-NGF-IRES-BMP2转染组(C组),空质粒对照组(D组)、阴性对照组(E组)。运用Lipofectamine2000介导将各组基因转染BMSCs,Western-blot检测目的基因蛋白表达情况,免疫组织化学染色检测I型胶原蛋白表达含量并测定灰度值。ALP试剂盒检测ALP表达含量,茜素红染色测定转染后各组钙结节并计数。[结果]各组基因转染BMSCs后,Western-blot、I型胶原免疫组化染色、ALP试剂盒检测、茜素红染色钙结节及统计学分析均提示双基因转染组的目的蛋白表达量、I型胶原蛋白表达量、ALP表达量、钙结节形成数目均高于单基因转染组、空质粒组及阴性对照组。[结论]转染双基因pCDNA3.1-NGF-IRES-BMP2组BMSCs可同时表达两种目的蛋白,能诱导BMSCs向成骨细胞分化,NGF的加入能够增强BMP2的成骨作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及多向分化研究的体外实验

目的 分离培养较高纯度大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）,检测其多向分化潜能.方法 采用密度梯度离心结合差速贴壁法分离培养大鼠BMSCs,观察细胞形态,检测表面标志物CD34、CD44、CD45、CD90表达情况,及其成骨、成脂、成神经诱导后茜素红染色、油红O染色和NSE、GFAP免疫荧光染色情况.结果 细胞呈典型的成纤维细胞样形态,CD44和CD90呈阳性表达,CD34和CD45呈阴性表达,细胞纯度＞98%.成骨、成脂、成神经诱导后,茜素红染色、油红O染色、NSE和GFAP免疫荧光均为阳性.结论 密度梯度离心结合差速贴壁法可分离、培养出高纯度的大鼠BMSCs,该细胞具有成脂、成骨、成神经多向分化潜能,是脊髓损伤修复的一种较理想的种子细胞.     

miR-124-3p靶向Axin1 调控糖尿病骨质疏松成骨的研究

目的 研究miR-124-3p靶向Axin1 调控糖尿病骨质疏松症大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells ，BMSCs）成骨分化的作用。方法 20只糖尿病大鼠模型-SPF级SD雌性大鼠分为分组对照组10例、实验组10例，经过药物注射，测血生化指标，测骨密度。BMSCs培养，流式细胞学鉴定。检测对照组和实验组miR-124-3p mRNA的表达。过表达miR-124-3p（模拟物）7、14、21 d，检测ALP、茜素红染色成骨能力。第7天检测miR-124-3p mRNA表达水平。实验组细胞用miR-124-3p模拟物转染，分为高糖组和低糖组，检测中Axin1 mRNA水平。构建载体，与模拟物共转染，荧光素酶报告基因检测miR-124-3p和Axin1靶向结合。将实验组BMSCs分为高糖组和低糖组，检测实验组BMSCs高糖组及低糖组miR-124-3p、Runx2 mRNA的表达及茜素红染色和ALP染色结果。检测实验组模拟物在高糖组及低糖组miR-124-3p、Runx2 mRNA的表达及茜素红染色和ALP染色结果。结果 ELISA检测血生化指标，实验组TG、TC、FPG、HbA1C值上调，β-CTX和SOST上调，OC和骨密度下调。BMSCs培养，流式细胞学鉴定显示CD73和CD105的表达为阳性， CD34 和 CD45 的表达呈阴性。符合间充质干细胞的抗原特点，证实为BMSCs。实验组miR-124-3p表达明显低于对照组。过表达miR-124-3p（模拟物）7、14、21 d，ALP、茜素红染色随时间逐渐升高。第7天miR-124-3p表达水平显著升高。实验组细胞用miR-124-3p模拟物转染，结果高糖组Axin1 mRNA表达水平上调，但用miR-124-3p模拟物转染时水平下降。荧光素酶报告基因检测miR-124-3p和Axin1可以靶向结合。RT-qPCR检测实验组BMSCs高糖摄入显著降低了miR-124-3p、Runx2表达；高糖可抑制成骨分化，减少钙沉积，减少ALP表达。高血糖条件下miR-124-3p过表达（模拟物）中Runx2的表达显示，高糖+对照明显低于低糖+对照组；高糖+miR-124-3p模拟物明显高于高糖+对照组。茜素红染色和ALP染色显示，高糖+对照明显低于低糖+对照组；高糖+miR-124-3p模拟物明显高于高糖+对照组。结论 miR-124-3p能通过靶向抑制Axin1促进糖尿病骨质疏松症大鼠BMSC的成骨发生。     

SVF与PRP联合应用对BMSCs成骨分化体外影响研究

目的探究脂肪来源血管基质成分(stromal vascular fraction, SVF)与富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP)对骨缺损周围骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的作用,以及两者联合对骨缺损的修复作用。方法自2018年6月至2019年12月,中国医科大学附属第一医院整形外科利用Transwell小室建立SVF与BMSCs共培养体系,SVF以及PRP作为刺激因素分别处理BMSCs,将实验分为4组:BMSCs组为A组(对照组);BMSCs+SVF共培养组为B组;BMSCs+PRP共培养组为C组;BMSCs+SVF+PRP共培养组为D组。分别观察作用24 h和48 h时BMSCs的增殖情况,以探究SVF的旁分泌作用以及PRP对BMSCs增殖和成骨分化效能影响。结果⑴SVF、PRP和SVF+PRP组较空白对照组BMSCs于24 h和48 h细胞增殖率明显升高,其中SVF+PRP组增殖率最高。⑵共培养2 d时,PRP组和SVF+PRP组与BMSCs组相比ALP、RUNX2蛋白表达明显升高,而SVF组与BMSCs组相比,ALP蛋白表达无明显差异,RUNX2蛋白表达升高。⑶共培养7 d时,ALP和RUNX2蛋白在其他三组中的表达明显高于BMSCs组,且SVF+PRP组成骨相关蛋白表达最明显。结论 SVF与PRP均可促进BMSCs的增殖以及成骨的分化,并且两者联合促进作用明显增强。目前我们可以认为,在骨再生修复中,SVF细胞注射修复骨缺损,不仅仅是由于其自身具有成骨分化作用,同时还能够促进骨缺损周围BMSCs的增殖及成骨的分化。SVF与PRP联合应用能达到更强的修复作用。     

miR-124-3p经Wnt通路因子Axin1调控骨髓间充质干细胞的研究

目的 探讨miR-124-3p经Wnt通路因子A(Axin1)对骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分子靶向机制及调节BMSCs的成骨分化进而参与绝经后骨质疏松（PMOP）的形成。方法 收集20例股骨骨折需要手术并扩髓或暴露髓腔的患者,10例绝经后骨质疏松妇女（PMOP组）和10例非骨质疏松的绝经后妇女（对照组）,术中取骨髓组织3~5 mL,建立体外BMSCs细胞模型,用流式细胞仪检测BMSCs标志物,将BMSCs诱导分化为成骨细胞,RT-qPCR法检测miR-124-3p的表达。双荧光素酶报告基因系统检测miR-124-3p结合位点A-Axin1。构建miR-124-3p过表达载体,miR-124-3p过表达转染PMOP-BMSCs同时更换成骨诱导培养基进行成骨诱导培养。诱导第7、14、21 天 分别收集细胞进行检测碱性磷酸酯酶染色（ALP）和茜素红染色。成骨诱导第7天,RT-qPCR检测各组BMSCs中Runx2、Osterix靶因子Axin1的表达。Western Blotting检测miR-124-3p转染BMSCs后的表达与Axin1关系。结果 ①RT-qPCR法检测miR-124-3p的表达,PMOP组低于对照组。②miR-124-3p过表达转染、成骨诱导,随着诱导时间的延长,细胞培养液中ALP水平逐渐上升,茜素红染色可见结节沉积逐增加。③RT-qPCR检测成骨诱导第7天,Runx2和Osterix的表达,BMSC+成骨分化液组明显高于BMSC组,BMSC+过表达miR-124-3p组较其对照组明显上升;Axin1的表达,BMSC+成骨分化液组明显低于BMSC组,BMSC+过表达miR-124-3p组较其对照组显降低。④荧光素酶报告基因实验证明了miR-124-3p与Axin1的可结合性。⑤Western Blotting检测BMSCs,miR-124-3p过表达组Axin1表达显著下降,而miR-124-3p抑制组Axin1表达显著升高。结论 miR-124-3p可通过Wnt通路靶点Axin1调节BMSCs的成骨分化进而参与PMOP的形成。     

IGF-1介导MAPKs通路在C3H10T1/2细胞成骨分化中的作用

目的 探究胰岛素样生长因子1(IGF-1)介导丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路在C3H10T1/2细胞成骨分化中的调控作用及机制。方法 不同浓度IGF-1(0、5、10、20 ng/mL)培养C3H10T1/2细胞,碱性磷酸酶(ALP)与茜素红(ARS)染色检测ALP活性、钙盐沉积情况,qRT-PCR法检测成骨特性因子核心结合因子α-1(RUNX2)、成骨分化特异性因子骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)mRNA表达水平,Western Blot法检测MAPK通路蛋白磷酸化表达水平。对数期细胞分为空白组、IGF-1组、ERK通路抑制剂(PD98059)组、PD+IGF-1组、p38通路抑制剂(SB202192)组、SB+IGF-1组,qRT-PCR法检测成骨特性因子RUNX2、成骨分化特异性因子骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)mRNA表达水平。结果 不同浓度IGF-1组ALP显色加深,ALP活性升高,钙盐结节形成增多,RUNX2、OPN、OCN mRNA表达水平升高,磷酸化ERK、p38、JNK蛋白表达增加,具有剂量效应(P<0.05)。与空白组比较,PD组、SB...