伤寒沙门菌主动外排多重耐药基因acrB与表达水平研究

目的调查临床分离伤寒沙门菌对常用抗生素的耐药情况与多重耐药主动外排基因acrB的检测、序列分析及其表达水平。方法根据NCCLS推荐的琼脂二倍稀释法测定7种抗生素对伤寒沙门菌的抗菌活性，以基因库序列为参考设计引物PCR扩增acrB、测序并用RT—PCR方法检测其表达水平。结果32株伤寒沙门菌对氧氟沙星、环丙沙星、头孢噻肟、哌拉西林、氯霉素、四环素、庆大霉素的耐药率分别为0、0、0、28．13％、43．75％、40．63％和12．5％，其中多重耐药菌10株。所有细菌均检测到多重耐药外排基因acrB．测序显示与参考沙门菌序列（No．AL627267）比较，有2处碱基变异。与大肠埃希菌（No．ECU00734）比较，碱基同源性为85．51％（61／421），提示其碱基序列同源性极高。对不同种类抗生素耐药及不耐药部分伤寒沙门菌共16株进行一步法RT—PCR检测acrB表达水平，结果所测伤寒沙门菌均检测到多重耐药外排基因acrB的表达，多重耐药株主动外排的表达较其它菌株明显增强。结论伤寒沙门菌对喹诺酮类、第三代头孢菌素类耐药率低，对哌拉西林、氯霉素、四环素耐药率相对较高，且有多重耐药。伤寒沙门菌中均存在acrAB主动外排系统，acrB与大肠埃希菌同源性高，对不同结构抗生素耐药的种类越多，表达水平越高。主动外排机制可能是伤寒沙门菌多重耐药的主要原因之一。     

产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌的耐药性及相关耐药机制

目的 了解安徽省35所医院2005年随机月份临床分离402株大肠埃希菌产质粒介导AmpC酶及对常用抗菌药物的耐药情况，揭示其相关耐药机制，指导临床合理用药。方法 三维试验筛选产AmpC酶株；多重PCR检测产质粒介导AmpC酶菌株，对产质粒介导AmpC酶菌株用PCR方法检测超广谱β-内酰胺酶（EsBLs）基因、1类整合子基因盒插入序列和主动外排系统acrAB-tolC基因。结果检出产质粒介导AmpC酶菌株28株（7．0％），其中2株经测序证实为新的质粒ampC基因型（GenBank登录号分别为EF054895，EF417572）。产酶菌株对12种常用抗菌药物，除亚胺培南、美罗培南全部敏感外，对其他大多数抗菌药物耐药率均高于非产酶株。28株产酶菌株中有23株表现为多重耐药，20株检测出各型ESBLs基因，21株扩增出Ⅰ类整合子基因盒插入序列，20株主动外排系统acrAB-tolC基因阳性。结论产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌对临床常用抗菌药物的耐药率均较高，多重耐药现象普遍，同时存在多种耐药机制，其中以产生灭活酶和Ⅰ类整合子介导的耐药机制为主。对产酶株临床经验用药可选用碳青霉烯类、阿米卡星及第四代头孢菌素类抗菌药物。     

多重耐药鲍曼不动杆菌的主动外排泵基因对β-内酰胺类抗菌药物耐药性的影响

目的 探讨对β-内酰胺类抗菌药物耐药的多重耐药鲍曼不动杆菌主动外排泵基因在耐药机制中表达情况.方法 多重耐药鲍曼不动杆菌96株,分析其对9种β-内酰胺类抗菌药物的耐药性.以加入泵抑制剂羰基氰氯苯腙(CCCP)后最低抑菌浓度(MIC)降低至≤1/4为标准,筛选出34株外排泵表型阳性的鲍曼不动杆菌,用聚合酶联链反应(PCR)扩增法对其行外排泵蛋白基因adeB进行检测和分析.结果 多重耐药鲍曼不动杆菌对头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦的耐药率分别为92.3％,86.6％,83.0％,70.8％,68.3％;对氨苄西林、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨苄西林/舒巴坦的耐药率分别为90.1％,77.5％,72.4％和67.3％.34株外排泵表型阳性的鲍曼不动杆菌检测到adeB基因有33株,检出阳性率97.06％.对33株鲍曼不动杆菌的外排泵基因adeB进行测序,经比对所测序列与Genebank中序列同源性为100.0％.结论 主动外排泵基因是多重耐药鲍曼不动杆菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的一个重要因素.     

大肠埃希菌尿潴留患者尿液分离株同时检出六种抗菌制剂外排泵基因

目的调查7种抗菌制剂外排泵基因(smr-2、emrB、emrD、emrE、mdfA、tehA、qacE△1)在一株大肠埃希菌尿潴留患者尿液分离株(ECO-024)中的存在情况。方法大肠埃希菌ECO-024于2009年2月分离自宁波市第一医院一例尿潴留患者的尿液标本,采用聚合酶链反应(PCR)检测7种外排泵基因。结果ECO-024共检出6种外排泵基因:emrB、emrD、emrE、mdfA、tehA、qacE△1,只有smr-2未能检出。结论同时检测这7种抗菌制剂外排泵基因是国内首次报道。其中有6种基因在大肠埃希菌尿液分离株中被检测到,这或许是导致分离株呈多重耐药的一个重要原因。在大肠埃希菌中检出mdfA、emrB、emrD、emrE基因为国内首次报道。     

铜绿假单胞菌MexAB-OprM主动外排表型筛选和外排基因检测

目的 研究解放军总医院临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌的主动外排系统，为指导临床合理选择抗生素提供依据。方法 采用外排泵抑制剂（苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺）与喹诺酮类抗生素，以微量肉汤稀释法测定加与不加外排泵抑制剂时环丙沙星与左氧氟沙星的最低抑菌浓度（MIC）值，并计算MIC值的变化，根据加与不加外排泵抑制剂MIC值降低3个稀释度及以上筛选主动外排表型阳性菌株；PCR扩增外排表型阳性菌的耐药基因oprM、mexB和mexR，并对3株菌进行mexR基因测序分析；RT-PCR检测oprM基因的mRNA水平，分析耐药基因的表达情况。结果 苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺能极大的降低左氧氟沙星和环丙沙星的MIC值，70株多重耐药铜绿假单胞菌中46株表型阳性（65．7％），其中PCR检测oprM、mexB和mexR基因同时阳性菌株42株（91．3％），仅oprM基因阳性2株（4．3％），oprM、mexB和mexR基因均阴性2株（4．3％）。RT-PCR产物测定A值（A260／A280）与PAO1对照阳性菌株13株，以PAO1的oprM／rpoD的A值为对照阳性菌株4株，同时满足A值（A260／A280）和oprM／rpoD比值均高于PA01的菌株3株。测序结果与GenBank中已知的mexR基因比对，其中2株同源性为100％，1株第434位核苷酸插入2bp（AT）。结论 中国人民解放军总医院多重耐药铜绿假单胞菌大多存在主动外排的耐药机制，其耐药与外排泵过度表达相关。     

鲍曼不动杆菌主动外排系统AdeABC、AdeIJK与多重耐药相关性

了解本地区鲍曼不动杆菌主动外排系统的分布并探讨其在介导细菌多重耐药中的作用.方法 琼脂二倍稀释法检测20种抗菌药物对鲍曼不动杆菌l临床分离株的MIC;PCR扩增AdeABC-AdeRS、AdeIJK两种RND主动外排系统的结构和调节基因.结果 112株鲍曼不动杆菌临床分离株对亚胺培南/西司他丁和美罗培南耐药率分别为0.9%和1.8%,对大多数抗菌药物的耐药率均大于60%,但对多黏菌素B和米诺环素均敏感.75.9%的菌株同时检出adeABC-adeRS和adeIJK主动外排基因,6.3%仅检出adeIJK.同时检出adeABC-adeRS和adeIJK的菌株耐药率较高.结论 本地区鲍曼不动杆菌临床分离株多重耐药情况严重.adeABC和adeIJK在鲍曼不动杆菌临床分离株有较高检出率.AdeABC主动外排系统在鲍曼不动杆菌多重耐药性的形成中起重要作用.     

大肠埃希菌连续分离株耐药表型及复方磺胺甲嘿唑耐药相关基因研究

目的了解临床分离的大肠埃希菌耐药性和复方磺胺甲噁唑（SMZ／TMP）耐药相关基因存在状况。方法测定临床连续分离的60株大肠埃希菌对19种抗菌药物的敏感性，采用聚合酶链反应（PCR）检测SMZ／TMP耐药相关基因（sull、dfrAl、dfrA17）。结果60株中sul1、dfrA1、dfrA17基因阳性分别为34株（56．7%）、1株（1．7%）、35株（58．3％）。结论临床分离的大肠埃希菌多重耐药严重；复方磺胺甲嗯唑耐药相关基因携带率高。     

ＭｅｘＸＹ ＯｐｒＭ 主动外排系统在铜绿假单胞菌多重耐药机制中的作用

目的　研究ＭｅｘＸＹ ＯｐｒＭ主动外排系统在铜绿假单胞菌（ＰＡ）多重耐药机制中的作用。方法　挑选临床分离的 ＰＡ多重耐药菌株２６株、敏感菌株１５株及标准质控菌株（ＡＴＣＣ２７８５３），用ＲＴ ＰＣＲ方法扩增其内膜转运蛋白ＭｅｘＹ的结构基因 ｍｅｘＹ和内参基因１６ＳｒＲＮＡ片段，根据结构基因ｍｅｘＹ与１６ＳｒＲＮＡ扩增产物的电泳扫描比值，分析ｍｅｘＹｍＲＮＡ的表达水平，用以判 断ＭｅｘＸＹ ＯｐｒＭ的表达情况。结果　２６株多重耐药菌株对１４种常用抗菌药物都耐药，耐药率为１００００％，１５株敏感菌株对１４种 常用抗菌药物都敏感；标准质控菌株、敏感菌株和多重耐药菌株均检测出ｍｅｘＹ的ｍＲＮＡ基因，耐药菌株的ｍｅｘＹｍＲＮＡ水平高于 敏感菌株（Ｐ＜００５）。结论　ＭｅｘＸＹ ＯｐｒＭ主动外排系统表达水平的增高在ＰＡ多重耐药中起到重要的作用。     

51株鲍曼不动杆菌耐药表型及外排蛋白基因表达研究

目的:探讨鲍曼不动杆菌耐药表型以及adeB外排泵基因的表达情况。方法:收集2004年2月～2005年2月北京协和医院51株非重复鲍曼不动杆菌,应用聚合酶链反应法测定鲍曼不动杆菌主动外排系统adeB结构基因及序列分析。结果:受试菌株对常用广谱抗生素均不敏感;多重耐药鲍曼不动杆菌携带adeB主动外排泵基因。结论:本研究中鲍曼不动杆菌多重耐药性与产生β-内酰胺酶无关,另有其它耐药机制存在,主动外排作用可能是鲍曼不动杆菌多重耐药的重要机制之一。     

主动外排系统与念珠菌的多重耐药

近年真菌感染大幅度增加，随着三唑类抗真菌药大剂量、长疗程使用，多重耐药株感染导致的治疗失败也呈增加趋势，对耐药念珠菌的研究发现，多重耐药与真菌细菌膜上主动外排泵的活化密切相关；与多重耐药相关的主动外排系统有ATP结合盒超家族（cdr 1和cdr 2)和主要易化因子超家族（CaMDR和flul),临床分离的敏感株和耐药株应用Southern blot及限制性核酸内切酶片段长度多态性分析表明，两者在基因型上无明显的差异，而Northern blot发现，两者在主动外排泵基因的mRNA上差异明显，表明耐药的发生是源于基因表达的异常而不是基因扩增所致，而启动子区上游500bp的碱基序列分析，未发现能增加基因表达的突变，进一步的研究发现，基因表达的增加源于反式调节因子对启动子的激活。     

惠东地区产ESBLs大肠埃希菌中TEM型β-内酰胺酶临床研究

目的探讨惠东地区产ESBLs大肠埃希菌中TEM型β-内酰胺酶分型、耐药性及基因突变类型。方法收集86例产ESBLs大肠埃希菌菌株,分析其基因类型;对产ESBLs大肠埃希菌TEM型进行耐药试验及基因突变类型的相关检测。结果 86例产ESBLs大肠埃希菌菌株中,TEM基因型49株(57.0%),SHV基因型16株(18.6%),CTX-M基因型21株(24.4%);TEM分型主要有TEM-1、TEM-2、TEM-105、TEM-116和TEM-128,其中TEM-1和TEM-2型例数最多,分别为18例和17例;TEM基因突变类型主要为缺失和碱基置换;产ESBLs大肠埃希菌菌株TEM型仅对亚胺培南/西司他丁和美罗培南敏感。结论探讨惠东地区产ESBLs大肠埃希菌基因突变分型及药敏试验对抗菌药物的选择具有重要的临床价值。     

Restoration of antibiotic susceptibility in fluoroquinolone-resistant Escherichia coli by targeting acrB with antisense phosphorothioate oligonucleotide encapsulated in novel anion liposome

Fluoroquinolone-resistant Escherichia coli (FREC) is one of the leading causes of Gram-negative bacterial infections short of effective antibiotics, thus necessitating development of novel antibacterial agents such as antisense resistance inhibitors. Aiming to restore susceptibility of FREC to fluoroquinolones by antisense inhibition of essential resistance mechanism, we designed and synthesized anion liposome encapsulated phosphorothioate oligodeoxynucleotide 831 (PS-ODN831) targeting gene acrB, which encodes the AcrAB-TolC efflux pump responsible for decreasing intercellular antibiotic concentrations. In all encapsulated PS-ODN831-treated groups, the MICs of ciprofloxacin and levofloxacin to FREC were reduced at different degrees, therefore inhibiting growth of FREC in a concentration-dependent manner. Reversion of their bactericidal effects was the result of specific and potent inhibition of acrB mRNA and the activity of efflux pump of AcrAB-TolC in FREC strains by liposome-encapsulated PS-ODN831. The study indicated that antisense targeting of AcrAB-TolC efflux pump system may be a feasible and potential strategy to treat FREC infections.     

多重耐药大肠埃希菌16S rRNA甲基化酶、氨基糖苷类修饰酶基因研究

目的了解多重耐药大肠埃希菌(ECO)氨基糖苷类药物耐药机制。方法采用PCR检测20株多重耐药ECO菌11种16S rRNA甲基化酶和氨基糖苷类修饰酶基因。结果1株检出16S rRNA甲基化酶基因(5.0%),并为新亚型;16株检出氨基糖苷类修饰酶基因(80.0%)。15号株rmtB基因测得序列翻译成氨基酸序列与美国核酸库(GenBank)已登录的rmtB氨基酸不同,为新亚型。结论本组多重耐药ECO菌氨基糖苷类耐药机制与产16S rRNA甲基化酶和产氨基糖苷类修饰酶相关。多重耐药ECO菌存在新的氨基糖苷类药物耐药机制。     

2016—2018年某医院CRE临床分布、耐药性及碳青霉烯酶基因检测

目的 了解耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, CRE)的临床分布、耐药性及碳青霉烯酶基因型,为临床抗感染治疗及医院感染防控提供依据。方法 收集2016年1月至2018年12月蚌埠医学院第一附属医院临床分离的CRE菌株,采用VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定药敏分析仪进行药敏实验。药敏结果判读参照CLSI 2018版标准,WHONET 5.6软件统计分析。PCR方法检测常见碳青霉烯酶基因。结果 2016年1月至2018年12月我院临床标本中共分离出626株CRE,总检出率为12.46%。其中主要为肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌,分别占84.35%(528/626)和9.27%(58/626)。标本来源主要为痰56.87%(356/626)、尿液12.14%(76/626)、血液10.38%(65/626)。病区分布主要为急诊内科32.75%(205/626)和重症监护病房25.08%(157/626)。626株CRE菌株对甲氧苄啶-磺胺甲噁唑和阿米卡星耐药率分别为56.07%和69.65%,其余在测试的抗菌药物耐药率均高于80%。626株CRE中602株检出携带常见碳青霉烯酶基因。602株菌主要包括肺炎克雷伯菌515株(510株携带blaKPC-2基因,5株携带blaNDM-1基因,2株携带blaIPM基因);大肠埃希菌54株(43株携带blaKPC-2基因,13株携带blaNDM-1基因,1株携带blaIPM基因)。其中3株大肠埃希菌和2株肺炎克雷伯菌同时检出blaKPC-2基因和blaNDM-1基因。未检出blaVIM和blaOXA-48基因。结论     

2016—2018年某医院CRE临床分布、耐药性及碳青霉烯酶基因检测

目的 了解耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, CRE)的临床分布、耐药性及碳青霉烯酶基因型,为临床抗感染治疗及医院感染防控提供依据。方法 收集2016年1月至2018年12月蚌埠医学院第一附属医院临床分离的CRE菌株,采用VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定药敏分析仪进行药敏实验。药敏结果判读参照CLSI 2018版标准,WHONET 5.6软件统计分析。PCR方法检测常见碳青霉烯酶基因。结果 2016年1月至2018年12月我院临床标本中共分离出626株CRE,总检出率为12.46%。其中主要为肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌,分别占84.35%(528/626)和9.27%(58/626)。标本来源主要为痰56.87%(356/626)、尿液12.14%(76/626)、血液10.38%(65/626)。病区分布主要为急诊内科32.75%(205/626)和重症监护病房25.08%(157/626)。626株CRE菌株对甲氧苄啶-磺胺甲噁唑和阿米卡星耐药率分别为56.07%和69.65%,其余在测试的抗菌药物耐药率均高于80%。626株CRE中602株检出携带常见碳青霉烯酶基因。602株菌主要包括肺炎克雷伯菌515株(510株携带blaKPC-2基因,5株携带blaNDM-1基因,2株携带blaIPM基因);大肠埃希菌54株(43株携带blaKPC-2基因,13株携带blaNDM-1基因,1株携带blaIPM基因)。其中3株大肠埃希菌和2株肺炎克雷伯菌同时检出blaKPC-2基因和blaNDM-1基因。未检出blaVIM和blaOXA-48基因。结论 CRE菌株对常用抗菌药物耐药严重,主要的碳青霉烯酶基因为blaKPC-2型。应加强对CRE菌株的医院感染防控。     

细菌NDM-1质粒耐药表型与其表达的相关性研究

目的 探讨NDM-1质粒携带菌株耐药表型与其基因表达的相关性，为临床抗菌药物选择提供理论参考。方法 携带NDM-1的质粒电转化入大肠埃希菌TOP10，采用琼脂平板倍比稀释法测定碳青霉烯类药物对野生株和电转化子的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)，TaqMan RT-PCR检测碳青霉烯类耐药菌株的blaNDM-1基因表达及亚-MIC亚胺培南诱导对blaNDM-1基因表达的影响。结果 12株产NDM-1菌株中共有8株电转化成功，电转化子对碳青霉烯类药物的耐药性与野生菌株基本一致。细菌对碳青霉烯类的耐药性与blaNDM-1基因表达成正比。亚-MIC亚胺培南诱导后菌株对碳青霉烯类药物的MIC值和blaNDM-1基因表达均显著高于野生株。结论 碳青霉烯类耐药菌株耐药表型与blaNDM-1基因表达具有正相关性，TaqMan RT-PCR检测可快速准确地为临床治疗提供依据。     

细菌NDM-1质粒耐药表型与其表达的相关性研究

目的 探讨NDM-1质粒携带菌株耐药表型与其基因表达的相关性,为临床抗菌药物选择提供理论参考。方法 携带NDM-1的质粒电转化入大肠埃希菌TOP10,采用琼脂平板倍比稀释法测定碳青霉烯类药物对野生株和电转化子的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC),TaqMan RT-PCR检测碳青霉烯类耐药菌株的blaNDM-1基因表达及亚-MIC亚胺培南诱导对blaNDM-1基因表达的影响。结果 12株产NDM-1菌株中共有8株电转化成功,电转化子对碳青霉烯类药物的耐药性与野生菌株基本一致。细菌对碳青霉烯类的耐药性与blaNDM-1基因表达成正比。亚-MIC亚胺培南诱导后菌株对碳青霉烯类药物的MIC值和blaNDM-1基因表达均显著高于野生株。结论 碳青霉烯类耐药菌株耐药表型与blaNDM-1基因表达具有正相关性,TaqMan     

大肠埃希菌耐药谱六年动态观察和分析

目的 了解广州地区大肠埃希菌检出情况及其对常用抗菌药物的耐药谱动态变化,为临床合理选用抗菌药物提供依据.方法 应用回顾性调查方法,对本院从2002年1月～2007年12月间临床样本分离的大肠埃希菌的药敏试验进行对比统计分析.结果 所分离出的679株大肠埃希菌,占革兰阴性菌的18.6%;大肠埃希菌对常用抗菌药物的耐药率总体呈上升趋势.耐药率低于30%的有亚胺培南、阿米卡星和哌拉西林/三唑巴坦.除了哌拉西林/三唑巴坦外其他抗菌药物耐药性均有显著性变化.结论 本地区大肠埃希菌耐药率有显著性变化,多重耐药现象严重,动态监测其耐药谱变化,是防止大肠埃希菌的感染率攀升的重要措施.     

Partial characterisation of the acrAB locus in two Citrobacter freundii clinical isolates

We studied the mechanisms of resistance to fluoroquinolones in two Citrobacter freundii strains (1.44 and 1.38) isolated from the same patient and belonging to the same clone by pulsed-field gel electrophoresis. This study allowed partial characterisation of the acrA and acrB genes of this microorganism. As previously reported, the two strains showed the same substitutions in the GyrA and ParC proteins (Thr-83-->Ile and Asp-87-->Tyr in GyrA and Ser-83-->Ile in ParC). However, differences were observed in the amount of ciprofloxacin accumulated, with strain 1.38 showing less accumulation. Expression of genes in both strains was analysed using DNA microarrays for Escherichia coli. Ten genes were overexpressed in strain 1.38 compared with strain 1.44, including genes acrA and acrB. Nucleotide similarity between the partially sequenced acrA and acrB genes of C. freundii and E. coli was 80.7% and 85%, respectively. The acrA and acrB genes of C. freundii are similar to those described in E. coli and their overexpression may play an important role in modulating the final minimum inhibitory concentration of fluoroquinolones in collaboration with mutations in the gyrA and parC genes.